本發(fā)明屬于生物制藥技術領域，涉及一種制備用于治療糖尿病足的干細胞工藝，特別涉及一種利用細胞工廠制備用于治療糖尿病足的干細胞工藝。

背景技術：

隨著飲食習慣的改變和人口老齡化的加劇，糖尿病發(fā)病率越來越高。糖尿病足作為糖尿病嚴重的慢性并發(fā)癥之一，其嚴重威脅糖尿病患者的健康和生活質量，糖尿病足是糖尿病患者致殘，甚至致死的重要原因之一，不但給患者造成痛苦，而且在各國均造成了巨大的醫(yī)療、社會、經濟問題。

目前基于藥物和手術的傳統(tǒng)治療，在改善下肢血管病早期有顯著的療效，但是對于晚期尤其是體弱患者療效并不明顯，因此如何建立有效的側支循環(huán)，促進毛細血管的再生，減輕神經病變和促進傷口愈合，成為治療糖尿病足的研究熱點。

間充質干細胞(mesenchymalstemcells，msc)是一群具有高度自我更新能力和分化潛能的成體干細胞。因其具有免疫調控、分泌細胞因子、取材方便等優(yōu)點而倍受關注，成為細胞治療的理想種子細胞。間充質干細胞表達轉錄因子oct-4、nanog和sox-2，是一群比成體干細胞更為原始的細胞，因此具有更強的分化潛能。msc可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、成肌細胞、成心肌細胞及神經細胞等細胞類型。而且，臍帶間充質干細胞表達低水平的mhc-i類抗原，不表達mhc-ii類抗原及fasl，也不表達相關的t細胞活化的共刺激分子?，F(xiàn)在培養(yǎng)的msc已被廣泛地用于臨床實驗研究，如移植物抗宿主病(gvhd)、充血性心力衰竭、急性心肌梗死、ii型糖尿病、脊髓損傷、軟骨和骨損傷、克羅恩病等，而且在腎臟、肌肉和肺的損傷修復中也有初步進展。間充質干細胞形態(tài)均一、數量多，尤其適合工業(yè)化制備。

另外，體內外的實驗都已經證明，干細胞可以緩解多種血管性疾病，包括心肌、腦、下肢等的缺血性疾病。目前應用干細胞治療下肢缺血性疾病已經在動物模型體內證明有效，并且大量的臨床研究也表明，干細胞在下肢缺血的部位局部多點肌肉注射有很好的治療效果。患者的痛感、間歇性跛行、壞疽等癥狀明顯好轉，踝/臂指數(abi)和下肢動脈造影(dsa)等相關檢查也表明患者的下肢血管狹窄緩解，側支循環(huán)增加，并且沒有發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應。有文獻顯示，使用臍帶充質干細胞進行治療后，傷口愈合程度明顯增強。通過免疫組織化學分析，發(fā)現(xiàn)干細胞能促進燒傷部位傷口愈合，維持表皮組織及毛囊完整性，臍帶干細胞的移植減輕燒傷局部組織炎癥反應。

隨著國內法規(guī)對細胞產品的安全性、穩(wěn)定性等質量要求的不斷提高，干細胞行業(yè)競爭的加劇，許多干細胞生產企業(yè)都意識到，要建立起企業(yè)長期的產品優(yōu)勢、成本優(yōu)勢等競爭優(yōu)勢，就需要建立起包括用細胞工廠生產干細胞的技術體系，加強技術創(chuàng)新研究和應用，不斷發(fā)展和鞏固企業(yè)的核心競爭力。

細胞工廠(cellfactory)是一種設計精巧的細胞培養(yǎng)裝置，在有限的空間內利用了最大限度的培養(yǎng)表面。細胞工廠的材質為符合《美國藥典》規(guī)定的聚苯乙烯，采用靜止培養(yǎng)方式，培養(yǎng)表面經特殊處理，大大提高了細胞的吸附性。因細胞工廠培養(yǎng)面積相對較大，不僅可以節(jié)約操作時間，還大大增加了培養(yǎng)廠房的利用空間。細胞工廠培養(yǎng)技術在干細胞制備中，具有工業(yè)規(guī)?；a的作用，降低培養(yǎng)過程中的污染，節(jié)省空間，大量生產干細胞，降低了成本，縮短了培養(yǎng)所需的時間和人員的投入，有效的保證操作的無菌性，最大限度降低批間差異，實現(xiàn)操作規(guī)程化。使用無血清培養(yǎng)基，解決了外源性因子免疫問題。具體來說：1)足夠數量的種子干細胞：從組織中分離的干細胞量非常少，要通過一定的培養(yǎng)后才能夠獲得目標的細胞量，同時在傳代的過程中，干細胞的代次會不斷增加，當達到一定的傳代次數后干細胞可能會出現(xiàn)不同程度的衰老。因而，如何實現(xiàn)種子細胞量又保證種子細胞的質量成為需要解決的關鍵問題。2)細胞工廠制備干細胞：與敞開式的平面擴增干細胞不同，細胞工廠為多層的半封閉的培養(yǎng)體系，雖同為貼壁培養(yǎng)，但培養(yǎng)面積更大，細胞接種均一性下降，層層的貼壁面使得每層的溶氧量不同，影響干細胞的增值能力以及衰老情況；同時收獲干細胞的時間也變得不定。3)大規(guī)模培養(yǎng)的干細胞的質量及安全性：經過大規(guī)模培養(yǎng)后，收獲細胞的狀態(tài)不同，收獲細胞的代次也可能提高，細胞的特性可能會出現(xiàn)一定程度的改變，建立評價干細胞質量的體系以及考察其安全性的指標成為關鍵技術。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種利用細胞工廠制備用于治療糖尿病足的干細胞工藝，包括細胞庫的建立，利用細胞工廠制備干細胞以及治療糖尿病足干細胞產品的制備，以解決干細胞在轉向臨床應用時，細胞數量不足、產品質量不達標以及不均一和穩(wěn)定性不夠的問題。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種利用細胞工廠制備用于治療糖尿病足的干細胞工藝，包括以下步驟：

(1)細胞接種

在細胞庫中取4支裝有1.75×10⁶cells/ml/管的干細胞，將其復蘇后，接種到四個t175培養(yǎng)瓶，接種密度為1.0×10⁴cells/cm²，并放置在37℃，5％co2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)；

(2)細胞工廠制備干細胞

待干細胞融合度達到90-95％時，將t175培養(yǎng)瓶的干細胞接種到4個兩層的細胞工廠中培養(yǎng)，接種密度為1.0×10⁴cells/cm²，再待兩層細胞工廠的細胞融合度達到90-95％時，將細胞傳代至4個十層的細胞工廠中培養(yǎng)，接種密度為1.0×10⁴cells/cm²；

(3)干細胞產品的制備

待十層的細胞工廠培養(yǎng)的干細胞融合度達到70％時，換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，使得bsa的含量降低至50ng/ml，同時，待細胞融合度達到90％-95％后，將干細胞消化下來，得到大量的干細胞。

優(yōu)選為，步驟(2)和步驟(3)中，干細胞在t175培養(yǎng)瓶、兩層的細胞工廠和十層的細胞工廠培養(yǎng)時，待細胞融合度達到30％時，要吸出舊的培養(yǎng)基同時添加新鮮配制的培養(yǎng)基，并且培養(yǎng)基的量也相應要增加50％，該步驟是保證干細胞在細胞工廠正常增殖的關鍵步驟，本發(fā)明通過對培養(yǎng)基量的控制，達到即不浪費培養(yǎng)基也能同時保證干細胞的正常增殖的目的，為工業(yè)化生產干細胞提供了很好的節(jié)約培養(yǎng)基、節(jié)約成本的途徑。

優(yōu)選為，還包括將步驟(3)得到的大量干細胞分裝為2×10⁷cells/ml/管，并使用干細胞凍存液重懸，使用時將凍存液除去，換成干細胞保存液。

優(yōu)選為，所述的干細胞為臍帶間充質干細胞、脂肪間充質干細胞、宮膜間充質干細胞、牙髓間充質干細胞、胎盤間充質干細胞、羊膜間充質干細胞或胎盤造血干細胞中的一種；更為優(yōu)選，所述的干細胞為臍帶間充質干細胞。

優(yōu)選為，步驟(1)所述的干細胞是從組織中通過不同的分離提取方法得到，其中，臍帶間充質干細胞的提取采用的是組織塊法，臍帶間充質干細胞細胞庫的建立，包括以下步驟：

(1)獲取經檢測合格的臍帶組織，保存至保存液中，48h內冷鏈運輸至gmp車間；

(2)用滅菌的剪刀將臍帶組織剪斷為2-3cm的組織塊，配合使用止血鉗、鑷子和剪刀，去除靜脈和動脈三個血管，將去除血管的臍帶組織塊放到50ml的離心管中，加入無菌pbs緩沖液，擰緊蓋子，上下顛倒反復清洗組織塊3次以上；

(3)取出臍帶組織，放到培養(yǎng)皿中，將臍帶剪成小塊0.5～1.5mm³，在每個培養(yǎng)皿中放一小塊組織，完成接種，放到培養(yǎng)箱中2小時后，補加培養(yǎng)基3ml，3～4天后補加新鮮的培養(yǎng)基；

(4)1周后，除去組織塊，3～4天后換液，當細胞長至95％時，將干細胞使用tryple消化下來計數，計算收獲的細胞量；

(5)再轉接種至t175培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)3～4天后，顯微鏡下觀察t175培養(yǎng)瓶中干細胞的增殖情況，當細胞融合至90-95％時，將干細胞消化進行傳代至兩層細胞工廠；

(6)經過4～5天的培養(yǎng)后，兩層細胞工廠的細胞融合度達到90-95％，此時再次將干細胞消化接種至十層的細胞工廠培養(yǎng)，待細胞融合度達到90-95％，分裝，每管1.75×10⁶cells/ml，即完成細胞庫的建立，保證了干細胞臨床研究的細胞用量。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果如下：

一、本發(fā)明的一種利用細胞工廠制備用于治療糖尿病足的干細胞工藝，利用t瓶并結合細胞工廠來大規(guī)模制備干細胞產品，取代傳統(tǒng)的t瓶培養(yǎng)方式，縮短了生產周期以及降低了細胞污染的風險；

二、本發(fā)明的一種利用細胞工廠制備用于治療糖尿病足的干細胞工藝，具有很好穩(wěn)定性，且生產的干細胞仍然保持了很好的干細胞特性，將干細胞用于模擬的大鼠糖尿病足有很好的治療效果，同時將細胞工廠設定為十層，滿足了生物制品三批樣生產原則，為干細胞作為藥品申報的生產工藝的開發(fā)奠定了基礎；

三、本發(fā)明在十層的細胞工廠培養(yǎng)干細胞時，待細胞融合度達到70％，使用無血清培養(yǎng)基替代現(xiàn)有的牛血清培養(yǎng)基，避免了bsa殘留，防止使用干細胞產品時出現(xiàn)免疫反應，提高了產品的安全性，且符合藥典要求。

附圖說明

圖1為利用常規(guī)培養(yǎng)皿培養(yǎng)干細胞與利用本發(fā)明工藝培養(yǎng)干細胞的細胞形態(tài)比較示意圖；其中，a為常規(guī)培養(yǎng)皿培養(yǎng)干細胞；b為本發(fā)明工藝培養(yǎng)干細胞，即在十層的細胞工廠培養(yǎng)干細胞；

圖2為本發(fā)明的一種利用細胞工廠制備用于治療糖尿病足的干細胞工藝的三種培養(yǎng)系統(tǒng)收獲細胞量比較示意圖；

圖3為將本發(fā)明制備得到的臍帶間充質干細胞用于治療鼠的糖尿病足的示意圖，其中，從左到右分別為模型對照組，局部干細胞移植組，靜脈干細胞移植組。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應該理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的保護范圍。在實際應用中本領域技術人員根據本發(fā)明做出的改進和調整，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1

建立安全有效、數量足夠的細胞庫，細胞庫中的細胞通過專業(yè)的第三方檢定，并且細胞量能夠滿足臨床研究的不斷供給。

新生兒出生后獲得臍帶組織，其中捐獻者必須進行過嚴格體檢，包括各項病毒檢測。在無菌室，從人體分離后的臍帶轉移至保存液，在48小時內，通過冷鏈運送到專業(yè)的細胞凍存中心，獲得捐獻者的信息、體檢報告。

(1)將組織轉移至gmp車間，并經過嚴格處理后，噴好酒精，轉移至事先照好紫外的生物安全柜中；

(2)用無菌pbs緩沖液清洗組織3次以上；用滅菌的剪刀將臍帶組織剪斷為2-3cm的組織塊，配合使用止血鉗、鑷子和剪刀，去除靜脈和動脈三個血管。將去除血管的臍帶組織塊放到50ml的離心管中，加一定量的無菌pbs緩沖液，擰緊蓋子，上下顛倒反復清洗組織塊3次以上；

(3)從離心管中取出臍帶組織，放到培養(yǎng)皿中；在一個培養(yǎng)皿用鋒利的小剪刀將臍帶剪碎，剪成小塊0.5～1.5mm³，在每個培養(yǎng)皿中放一小塊一小塊的組織，即接種。放到培養(yǎng)箱中2小時后，補加培養(yǎng)基3ml，3～4天后補加新鮮的培養(yǎng)基；

(4)1周后，除去組織塊，3～4天后換液；去除組織塊后，當細胞長至95％時，將干細胞使用tryple消化下來計數，計算收獲的細胞量；一般每個培養(yǎng)皿爬出來的細胞為15±5×10⁴cells，則總共收獲的細胞量可達到5×10⁶cells，分裝至3支凍存管中，記為p1；

(5)取一支p1的臍帶間充質干細胞接種至t175培養(yǎng)瓶；培養(yǎng)3～4天后，顯微鏡下觀察t175培養(yǎng)瓶中干細胞的增殖情況，當細胞融合至95％時，將干細胞消化進行傳代至兩層細胞工廠；

(6)經過4～5天的培養(yǎng)后，兩層細胞工廠的細胞融合度能夠達到95％，兩層的細胞工廠收獲量可達到6×10⁷cells，此時再次將干細胞消化接種至十層的細胞工廠，而十層的細胞工廠則能夠收獲到3.5×10⁸cells，凍存200支細胞，作為細胞庫。

實施例2

本發(fā)明另一個重要的技術難點為臨床用干細胞的制備，本發(fā)明干細胞制備工藝的重要部分是利用t瓶結合細胞工廠來大規(guī)模制備干細胞產品，并且制備臨床級干細胞制劑。具體地包括以下步驟：

(1)取細胞庫中臍帶間充質干細胞4管，接種至四個t175培養(yǎng)瓶，接種量為1.75×10⁶cells/t175，即1.0×10⁴cells/cm²；第二天換液，除去未貼壁的細胞；

(2)培養(yǎng)四天后，在顯微鏡下觀察細胞，當細胞融合到95％，將干細胞進行傳代至4個兩層的細胞工廠；4～5天后，兩層細胞工廠的細胞融合度達到95％，則可將細胞傳代至4個十層的細胞工廠；

(3)十層的細胞工廠在培養(yǎng)的第3天需要去除含血清的培養(yǎng)基，換成無血清培養(yǎng)基，目的是去除外源的牛血清白蛋白(bsa)，避免了干細胞臨床應用時人體可能出現(xiàn)免疫反應；換成無血清培養(yǎng)基后需要密切關注細胞的培養(yǎng)狀態(tài)，為了除去牛血清白蛋白(bsa)，干細胞的外排時間要保證兩天及以上，才能使bsa的含量降低至50ng/ml。由于目前商品化的無血清培養(yǎng)基普遍存在營養(yǎng)不足的問題，無法維持干細胞的長期擴增，因此我們選定的限度為干細胞融合度達到70％時換成無血清培養(yǎng)基，干細胞經過一天的適應時間，兩天后即能夠達到90％～95％的融合度，即換液48小時后，干細胞融合度達到90％～95％時，這個時間點的控制非常嚴苛，若是不提前換液，在干細胞融合度達到并收獲后，血清的殘留不能夠控制在藥典規(guī)定的限度50ng以下；同時為了確保收獲細胞的量及收獲細胞的活性，在培養(yǎng)48小時，及時的將干細胞收獲，才能夠收獲到高質量的臍帶間充質干細胞。

(4)換無血清培養(yǎng)兩天后，在顯微鏡下觀察到細胞融合度達到90％后，如圖1b所示，圖1b為細胞工廠培養(yǎng)的干細胞表型，且為了與常規(guī)培養(yǎng)皿培養(yǎng)的干細胞作比較，圖1a為常規(guī)培養(yǎng)皿培養(yǎng)的干細胞表型；從圖1a和圖1b可以看出，兩者都呈現(xiàn)梭行，為正常干細胞形態(tài)，兩者沒有差別，然后將十層細胞工廠的干細胞消化下來，細胞離心后計數，得到大量的臍帶間充質干細胞，此外，按照固定的細胞接種量，比較t瓶、兩層的細胞工廠、十層的細胞工廠收獲的細胞量，如圖2所示，十層的細胞工廠收獲的細胞量遠遠高于t瓶。

(5)配制臨床級干細胞制劑，使用干細胞凍存液。

(6)調節(jié)細胞的密度為2×10⁷cells/ml/管，使用干細胞凍存液重懸，與傳統(tǒng)的干細胞凍存一樣，需要經過程序降溫，再轉移到液氮罐中，-196℃存儲，此干細胞制劑復融稀釋后可直接用于臨床，注射進病人體內是安全有效的。

與現(xiàn)有技術相比，該制備工藝不僅能制備大量的干細胞，同時所制備的干細胞能保持了干細胞的特性，并且符合干細胞的臨床使用級別，干細胞的質量符合各項標準，包括雜質要求等。

實施例3

將本發(fā)明制備的臍帶間充質干細胞用于治療鼠的糖尿病足，通過檢測各項指標來反映臍帶間充質干細胞的治療效果，以表明本發(fā)明的臍帶間充質干細胞可用于治療糖尿病足。

實驗方法

使用臍帶間充質干細胞治療wistar雄性大鼠的糖尿病足試驗：首先，將wistar雄性大鼠隨機分為造模組和對照組，其中，造模組使用高脂飼料喂養(yǎng)后，腹腔注射鏈脲佐菌素30mg/kg；對照組注射等體積的高脂飼料緩沖液；然后，再監(jiān)測兩組大鼠的血糖、體重、飲水量和尿量，待出現(xiàn)血糖≥14mmol/l及多飲、多尿、體重減輕等糖尿病癥狀后，將兩組大鼠足背部切除一塊3cm×7cm矩形全層皮膚組織，建立糖尿病足潰瘍模型，比較二組潰瘍愈合時間。

造模結果及分組：糖尿病造模組注射鏈脲佐菌素(stz)后，有21只大鼠出現(xiàn)血糖≥14mmol/l，并有多飲、多尿、消瘦等癥狀。鏈脲佐菌素(stz)注射后5天，造模組大鼠平均血糖濃度為：20.15±3.08，造模14天造模組大鼠平均血糖濃度為：21.54±2.71，提示糖尿病模型穩(wěn)定。除a組為正常對照組外，造模成功大鼠隨機分為4組，每組5只，分別為：b組-模型對照組；c組-局部低劑量干細胞移植組(0.5×10⁶cells/只)；d組-局部高劑量干細胞移植組(1×10⁶cells/只)；e組-靜脈干細胞移植組(2×10⁶cells/只)。局部干細胞移植組為將實施例2大規(guī)模制備的臍帶間充質干細胞，經多點注射，移植于大鼠足背創(chuàng)面周圍，靜脈干細胞移植組為將實施例2大規(guī)模制備的臍帶間充質干細胞，經大鼠尾靜脈緩慢推注入大鼠體內。

實驗結果

本發(fā)明將wistar雄性大鼠隨機分為造模組和對照組，其中，造模組高脂飼料喂養(yǎng)后，腹腔注射鏈脲佐菌素(stz)30mg/kg；對照組注射等體積的高脂飼料緩沖液。監(jiān)測兩組血糖、體重、飲水量、尿量，當兩組大鼠出現(xiàn)血糖≥14mmol/l及多飲、多尿、體重減輕等糖尿病癥狀后，將兩組大鼠足背部切除一塊3cm×7cm矩形全層皮膚組織，建立糖尿病足潰瘍模型，比較二組潰瘍愈合時間，如表一所示。結果表明：與正常對照組相比，模型對照組的潰瘍面積明顯增加，表明糖尿病不利于傷口愈合；與模型對照組相比，局部注射1×10⁶個臍帶間充質干細胞組和靜脈注射2×10⁶個臍帶間充質干細胞組的皮膚潰瘍面積均明顯縮小，此兩組在促進潰瘍愈合方面無明顯差異，如圖3所示。臍帶間充質干細胞靜脈或動脈移植具有較好的改善代謝、降低血糖、血脂、促進血管再生、傷口愈合及改善腎臟組織缺血后纖維化等功能，臍帶間充質干細胞移植有可能成為糖尿病微血管病變新的預防和治療方法。

表一：移植臍帶間充質干細胞后潰瘍面積的變化(mm²)(n＝5，means±sd)

^*p＜0.05，^**p＜0.01vscontrolgroup；^#p＜0.05vsmodelgroup.

以上公開的本發(fā)明優(yōu)選實施例只是用于幫助闡述本發(fā)明。優(yōu)選實施例并沒有詳盡敘述所有的細節(jié)，也不限制該發(fā)明僅為所述的具體實施方式。顯然，根據本說明書的內容，可作很多的修改和變化。本說明書選取并具體描述這些實施例，是為了更好地解釋本發(fā)明的原理和實際應用，從而使所屬技術領域技術人員能很好地理解和利用本發(fā)明。本發(fā)明僅受權利要求書及其全部范圍和等效物的限制。