本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種可分泌抗h-fabp單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞、單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

脂肪酸結(jié)合蛋白(fabp)是一組多源性的小分子細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量約為12kds～15kds，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的心肌、小腸、肝臟、脂肪組織、腦、表皮等組織細(xì)胞中。目前已發(fā)現(xiàn)的fabp有9種不同的亞型，常見(jiàn)的有心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-fabp)、肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(l-fabp)、腎臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(k-fabp)、骨骼肌型脂肪酸結(jié)合蛋白(s-fabp)等。

其中，h-fabp大量的存在于心肌組織中，約占心臟全部可溶性蛋白的5％～15％，屬于細(xì)胞內(nèi)小的疏水基配體結(jié)合蛋白家族，是細(xì)胞內(nèi)重要的載體蛋白，可與心肌細(xì)胞內(nèi)作為能源的難溶性長(zhǎng)鏈脂肪酸的疏水部分相結(jié)合，起著將上述物質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)膜向脂化和氧化部位運(yùn)輸?shù)淖饔?。h-fabp的相對(duì)分子量約為14kds～15kds，等電點(diǎn)(pi)約為5.1。h-fabp在正常人的血液中含量很小，當(dāng)心肌細(xì)胞受損時(shí)可快速釋放到血液中。

心腦血管疾病是全球頭號(hào)死因，每年死于心腦血管疾病的人數(shù)多于任何其他死因。而急性心肌梗死(ami)是心血管疾病的主要類型，心梗發(fā)病極為迅速，在所有死亡病例中，有2/3是在送醫(yī)途中病逝的。所以早發(fā)現(xiàn)早疏通一直都是治療的關(guān)鍵。在臨床上，若病人出現(xiàn)胸骨后劇烈疼痛和12導(dǎo)聯(lián)心電圖st段升高，則可初步診斷為心肌梗死，需要做血管疏通治療，但具有上述癥狀而最終確診為心肌梗死的患者僅占總數(shù)的約5％。此外，大部分心梗發(fā)病者不出現(xiàn)明顯的癥狀或癥狀不明顯，容易被患者忽視，而一旦察覺(jué)則已危及性命。

利用傳統(tǒng)的物理檢測(cè)手段，一方面無(wú)法排除有梗死癥狀但實(shí)際上不是心肌梗死的病人，另一方面無(wú)法確診沒(méi)有癥狀而實(shí)際上是心肌梗死的病人?；谏鲜鲈?，心肌損傷標(biāo)記物檢測(cè)則成為診斷的重要條件。一般臨床上應(yīng)用最較多的心肌損傷標(biāo)志物包括腦鈉肽(bnp)或n端腦鈉肽前體(nt-probnp)、肌酸激酶同工酶(ck-mb)、肌鈣蛋白i(ctni)或肌鈣蛋白t(ctnt)和肌紅蛋白(myo)等。全球心肌梗死定義推薦使用ctni/t和ck-mb這兩類標(biāo)志物，但是它們都是發(fā)病后6小時(shí)以后的指標(biāo)，不適用于早期診斷。相比于ctni/t或ck-mb，心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-fabp)和myo都是小分子，心梗發(fā)生后釋放速度非?？欤蚨貏e適合于心肌梗死的早期診斷。相較myo而言，h-fabp在心肌的含量要遠(yuǎn)高于骨骼肌，因而它指示心肌損傷時(shí)特異性會(huì)優(yōu)于myo。

然而，正常人血液中的h-fapb濃度很低(一般小于<10ng/ml)，雖然心肌損傷后濃度會(huì)升高，但依然無(wú)法用常規(guī)的化學(xué)定量方法測(cè)出。傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法(elisa)、放射免疫法(ria)、膠體金免疫層析法等也無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)極微量h-fapb含量的樣本。且上述檢測(cè)方法存在一些缺陷，限制了它們?cè)谂R床診斷中的大規(guī)模應(yīng)用。例如elisa檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，操作步驟繁瑣，重復(fù)性較差。ria需要特定的儀器，且操作人員會(huì)接觸放射性物質(zhì)，會(huì)損害操作人員的身體，同時(shí)使用完成后的放射性材料的處置也是個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題。而目前免疫層析法產(chǎn)品雖多，但普遍存在特異性不高、性能不穩(wěn)定等問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，有必要提供一種特異性較高、性能穩(wěn)定的h-fabp檢測(cè)試劑盒，以及可應(yīng)用在該h-fabp檢測(cè)試劑盒中的可分泌抗h-fabp單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞及其制備方法、單克隆抗體及應(yīng)用。

一種可分泌抗h-fabp單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，保藏號(hào)為cctccno：c2016220。

在一個(gè)實(shí)施例中，上述雜交瘤細(xì)胞分泌的抗h-fabp單克隆抗體標(biāo)記為1f38。

上述雜交瘤細(xì)胞或上述抗h-fabp單克隆抗體在制備h-fabp的檢測(cè)試劑或h-fabp的檢測(cè)設(shè)備中的應(yīng)用。

一種可分泌抗h-fabp單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，保藏號(hào)為cctccno：c2016219。

在一個(gè)實(shí)施例中，上述雜交瘤細(xì)胞分泌的抗h-fabp單克隆抗體標(biāo)記為6f20。

上述雜交瘤細(xì)胞或上述抗h-fabp單克隆抗體在制備h-fabp的檢測(cè)試劑或h-fabp的檢測(cè)設(shè)備中的應(yīng)用。

一種可分泌抗h-fabp單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：

用h-fabp抗原免疫小鼠；

收集免疫后的小鼠的脾細(xì)胞，并將所述脾細(xì)胞與小鼠瘤細(xì)胞進(jìn)行融合得到融合細(xì)胞；

采用hat培養(yǎng)基對(duì)所述融合細(xì)胞進(jìn)行選擇培養(yǎng)；以及

用h-fabp抗原檢測(cè)所述融合細(xì)胞的培養(yǎng)上清中的抗體含量，篩選獲得一株穩(wěn)定分泌1f38的雜交瘤細(xì)胞以及一株穩(wěn)定分泌6f20的雜交瘤細(xì)胞。

一種h-fabp檢測(cè)試紙，所述檢測(cè)試紙上標(biāo)記有上述的1f38和上述的6f20。

在一個(gè)實(shí)施例中，該h-fabp檢測(cè)試紙包括支撐片、樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸收墊、檢測(cè)線及質(zhì)控線，所述樣品墊、所述金標(biāo)墊、所述硝酸纖維素膜及所述吸收墊從所述支撐片的一端向另一端依次設(shè)置在所述支撐片上，所述樣品墊與所述金標(biāo)墊部分重疊，所述金標(biāo)墊與所述硝酸纖維素膜部分重疊，所述硝酸纖維素膜與所述吸收墊部分重疊，所述檢測(cè)線及所述質(zhì)控線設(shè)在所述硝酸纖維素膜上，且所述檢測(cè)線設(shè)在靠近所述金標(biāo)墊的一端，所述質(zhì)控線設(shè)在靠近所述吸收墊的一端，所述金標(biāo)墊上涂覆有1f38包附膠體金顆粒形成的膠體金標(biāo)記的單克隆抗體，所述檢測(cè)線為6f20，所述質(zhì)控線為羊抗鼠igg抗體。

一種h-fabp檢測(cè)試劑盒，包括如上述的h-fabp檢測(cè)試紙。

上述雜交瘤細(xì)胞的分泌產(chǎn)量高，分泌得到的抗h-fabp的單克隆抗體具有高親和力、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用在心腦血管疾病診斷的檢測(cè)領(lǐng)域，如h-fabp檢測(cè)試劑或h-fabp檢測(cè)設(shè)備的制備領(lǐng)域等。

上述雜交瘤細(xì)胞的分泌產(chǎn)量高，分泌得到的抗h-fabp的單克隆抗體具有高特異性且性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用在制備h-fabp檢測(cè)試劑或h-fabp檢測(cè)設(shè)備中。可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)出血液中h-fabp的含量，有利于對(duì)心肌損傷作出早期診斷，為病人贏取寶貴的治療時(shí)間。且在特異性、穩(wěn)定性等方面較之傳統(tǒng)的檢測(cè)方法具有顯著的優(yōu)勢(shì)，可以應(yīng)用于h-fapb的快速檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1為一實(shí)施方式的可分泌抗h-fabp單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的制備方法的流程圖；

圖2為一實(shí)施方式的h-fabp檢測(cè)試紙的示意圖；

圖3為一實(shí)施方式的h-fabp檢測(cè)試劑盒的示意圖；

圖4為如圖3的h-fabp檢測(cè)試劑盒的一個(gè)使用狀態(tài)示意圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式做詳細(xì)的說(shuō)明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來(lái)實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開(kāi)的具體實(shí)施的限制。

一實(shí)施方式的可分泌抗h-fabp單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞于2016年12月22日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏號(hào)為cctccno：c2016220，分類命名：雜交瘤細(xì)胞株1f38。該雜交瘤細(xì)胞可分泌出抗h-fabp的單克隆抗體，記為1f38，1f38可以作為檢測(cè)抗體。1f38可以應(yīng)用于h-fabp檢測(cè)試劑或h-fabp檢測(cè)設(shè)備的制備領(lǐng)域中。

另一實(shí)施方式的可分泌抗h-fabp單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞于2016年12月22日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏號(hào)為cctccno：c2016219，分類命名：雜交瘤細(xì)胞株6f20。該雜交瘤細(xì)胞可分泌出抗h-fabp的單克隆抗體，記為6f20，6f20可以作為檢測(cè)抗體。6f20可以應(yīng)用于h-fabp檢測(cè)試劑或h-fabp檢測(cè)設(shè)備的制備領(lǐng)域中。

請(qǐng)參閱圖1，一實(shí)施方式的可分泌抗h-fabp單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟s110～s140。

s110、用h-fabp抗原免疫小鼠。

本實(shí)施方式中，h-fabp抗原為重組心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-fabp)，由深圳市菲鵬生物股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品名稱：k1-fab。

具體可采用h-fabp抗原與弗氏完全佐劑混合后皮下注射至小鼠腹腔內(nèi)，并采尾血進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)，追加免疫至效價(jià)達(dá)到融合要求。

s120、收集s110中得到的免疫后的小鼠的脾細(xì)胞，并將脾細(xì)胞與小鼠瘤細(xì)胞進(jìn)行融合得到融合細(xì)胞。

小鼠末次免疫后，在無(wú)菌條件下取出脾臟，置于平皿中，制成細(xì)胞懸液。將小鼠瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按1:10細(xì)胞數(shù)量比例混合。

s130、采用hat培養(yǎng)基對(duì)s120中得到的融合細(xì)胞進(jìn)行選擇培養(yǎng)。

細(xì)胞融合后，培養(yǎng)至適宜的濃度，通過(guò)hat培養(yǎng)基篩選出融合細(xì)胞。

s140、用h-fabp抗原檢測(cè)所述融合細(xì)胞的培養(yǎng)上清中的抗體含量，篩選獲得一株穩(wěn)定分泌1f38的雜交瘤細(xì)胞以及一株穩(wěn)定分泌6f20的雜交瘤細(xì)胞。

將融合細(xì)胞培養(yǎng)至適宜的細(xì)胞濃度后，加入不同的重組心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-fabp)抗原，篩選出能夠分泌特定抗體的融合細(xì)胞并用有限稀釋法克隆，篩選獲得一株穩(wěn)定分泌1f38的雜交瘤細(xì)胞以及一株穩(wěn)定分泌6f20的雜交瘤細(xì)胞。

本實(shí)施方式中，篩選獲得一株穩(wěn)定分泌1f38的雜交瘤細(xì)胞保藏號(hào)為cctccno：c2016220。一株穩(wěn)定分泌6f20的雜交瘤細(xì)胞保藏號(hào)為cctccno：c2016219。

上述的可分泌抗h-fabp單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的制備方法操作簡(jiǎn)單，篩選獲得的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)量高，分泌得到的抗h-fabp的單克隆抗體效價(jià)高、具有高親和力、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用在心腦血管疾病診斷的檢測(cè)領(lǐng)域，如h-fabp檢測(cè)試劑或h-fabp檢測(cè)設(shè)備的制備領(lǐng)域等。

一實(shí)施方式的h-fabp檢測(cè)試劑盒包括h-fabp檢測(cè)試紙。當(dāng)然，h-fabp檢測(cè)試劑盒還可以包括包裝盒、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品等。

請(qǐng)參閱圖2，本實(shí)施方式的h-fabp檢測(cè)試紙100包括支撐片110、樣品墊120、金標(biāo)墊130、硝酸纖維素膜140、吸收墊150、檢測(cè)線160及質(zhì)控線170。樣品墊120、金標(biāo)墊130、硝酸纖維素膜140及吸收墊150從支撐片110的一端向另一端依次設(shè)置在支撐片110上。樣品墊120與金標(biāo)墊130部分重疊，金標(biāo)墊130與硝酸纖維素膜140部分重疊，硝酸纖維素膜140與吸收墊150部分重疊。檢測(cè)線160及質(zhì)控線170設(shè)在硝酸纖維素膜140上，且檢測(cè)線160設(shè)在靠近金標(biāo)墊130的一端，質(zhì)控線170設(shè)在靠近吸收墊150的一端。支撐片110采用不吸水的材料制作。樣品墊120用于樣品點(diǎn)樣。金標(biāo)墊130上涂覆有1f38包附膠體金顆粒形成的膠體金標(biāo)記的1f38。檢測(cè)線160為6f20。質(zhì)控線170為羊抗鼠igg抗體。

本實(shí)施方式中，1f38作為檢測(cè)抗體，6f20為捕獲抗體。在其他的實(shí)施方式中，也可以選擇6f20作為檢測(cè)抗體，1f38為捕獲抗體。

請(qǐng)參閱圖3和圖4，h-fabp檢測(cè)試紙100可置于檢測(cè)試劑盒的殼體200內(nèi)。殼體200上開(kāi)設(shè)有加樣孔210及觀察窗220。加樣孔210對(duì)應(yīng)樣品墊120的位置。檢測(cè)線160及質(zhì)控線170裸露于觀察窗220中，方便觀察。

其他檢測(cè)試劑可以根據(jù)需要制備。

上述h-fabp檢測(cè)試劑盒利用雙抗體夾心法來(lái)檢測(cè)樣品中的心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-fabp)的含量。檢測(cè)時(shí)，樣品中的h-fabp先和金標(biāo)墊130上的抗體1f38結(jié)合，由于毛細(xì)管作用，反應(yīng)復(fù)合物沿包被膜向前泳動(dòng)，到達(dá)檢測(cè)線160，若樣品含中有h-fabp，會(huì)被設(shè)在硝酸纖維素膜140上的檢測(cè)線160上的抗體6f20捕獲，形成單抗-h-fabp-金標(biāo)記單克隆抗體復(fù)合物，富集在檢測(cè)線160上，形成紅色沉淀線。未結(jié)合的金標(biāo)記單克隆抗體則通過(guò)檢測(cè)線，被羊抗鼠igg抗體捕獲，富集在質(zhì)控線170上，形成紅色沉淀線。當(dāng)檢測(cè)線160與質(zhì)控線170上同時(shí)有紅色沉淀線(如圖3所示)時(shí)判為陽(yáng)性。若樣品中h-fabp含量<10ng/ml，樣品到達(dá)檢測(cè)線160時(shí)，遇到捕獲單抗就不會(huì)形成雙單抗夾抗原反應(yīng)復(fù)合物，僅富集在質(zhì)控線170上形成紅色沉淀線(如圖4所示)，此時(shí)判為陰性結(jié)果。

在其他實(shí)施方式中，h-fabp檢測(cè)試劑盒的結(jié)構(gòu)不限于上文描述。上述單克隆抗體除應(yīng)用在上述膠體金標(biāo)記的單抗h-fabp檢測(cè)試劑盒外，還可以用于其他心肌梗死檢測(cè)試劑盒或設(shè)備中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，將本實(shí)施方式的單克隆抗體直接或間接結(jié)合其他信號(hào)基團(tuán)(如磁性微球、辣根過(guò)氧化酶等)，或?qū)⒈緦?shí)施方式的單克隆抗體作為包被抗體(例如elisa)，則可用于其他形式的h-fabp檢測(cè)試劑或設(shè)備。故本實(shí)施方式所制備得到的雜交瘤細(xì)胞及其分泌的單克隆抗體可廣泛適用于制備診斷或檢測(cè)心肌梗死的試劑或設(shè)備。

通過(guò)使用上述雜交瘤細(xì)胞分泌的抗h-fabp單克隆抗體，在提高靈敏度的同時(shí)改善特異性。在標(biāo)記物為較大的納米顆粒如膠體金、乳膠或其他納米顆粒類標(biāo)記物時(shí)，間接標(biāo)記可以降低標(biāo)記抗原的使用量，在提高靈敏度的同時(shí)改善特異性。間接標(biāo)記相對(duì)于傳統(tǒng)雙抗原夾心法的兩部特異識(shí)別而言相對(duì)于多了一步特異識(shí)別，即三步特異識(shí)別，可以提高檢測(cè)試劑盒的特異性，而且相對(duì)標(biāo)記抗原的純度要求降低又可以降低檢測(cè)試劑盒的成本。通過(guò)使用上述抗h-fabp單克隆抗體，制備得到的試劑盒與現(xiàn)有心肌梗死檢測(cè)試劑盒相比，在特異性、靈敏度及檢出率方面都具有顯著的優(yōu)勢(shì)。且上述h-fabp檢測(cè)試劑盒放在室溫下每周抽檢樣品，經(jīng)驗(yàn)證h-fabp檢測(cè)試劑盒在室溫下保存18個(gè)月，檢測(cè)結(jié)果仍符合要求，性能穩(wěn)定。

以下為具體實(shí)施例。

實(shí)施例中采用藥物和儀器如非特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)選擇。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如文獻(xiàn)、書本中所述的條件或者試劑盒生產(chǎn)廠家推薦的方法實(shí)現(xiàn)。

實(shí)施例1

雜交瘤細(xì)胞株的建立與抗h-fabp單克隆抗體的制備。

1、抗原免疫。

將重組心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-fabp)抗原(1.2mg/ml，深圳市菲鵬生物股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品名稱：k1-fabp)與弗氏完全佐劑(sigma，f5881)等體積混合，得到油狀乳液。將該乳液以每只0.2毫升的劑量皮下施給balb/c小鼠(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心：廣東省佛山市南海黃岐鄱陽(yáng)路119號(hào)，6周齡雌性，5只)背部位點(diǎn)，第一次免疫14天后腹腔增強(qiáng)免疫(抗原與弗氏不完全佐劑(sigma，f5506)等體積混合)，增強(qiáng)免疫到四針后，采尾血進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)，效價(jià)達(dá)到融合要求。

融合前3天，用相同劑量抗原與等體積0.9％氯化鈉注射液混合腹腔注射追加免疫。

2、雜交瘤細(xì)胞系的制備。

(1)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備。

以balb/c鼠腹腔巨噬細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞。在融合前1天，balb/c鼠拉頸處死，75％酒精全身浸泡5分鐘，超凈臺(tái)內(nèi)，無(wú)菌操作下用剪刀剪開(kāi)腹部皮膚，暴露腹膜，用注射器腹腔注入rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液5ml，反復(fù)沖洗，回收沖洗液，1000rpm，離心5分鐘，留沉淀，用rpmi1640篩選培養(yǎng)液(含hat的rpmi1640完全培養(yǎng)液中)重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度1×105個(gè)/ml，加入96孔板，180μl/孔，37℃，5％co2培養(yǎng)過(guò)夜。

(2)免疫脾細(xì)胞的制備。

小鼠末次免疫后第三天，在無(wú)菌條件下取出脾臟，置于平皿中，rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液沖洗一次，放于小燒杯的尼龍網(wǎng)上磨碎過(guò)濾，制成細(xì)胞懸液。離心，棄上清rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，如此重復(fù)三次，計(jì)數(shù)。

(3)小鼠瘤細(xì)胞的制備。

小鼠瘤細(xì)胞經(jīng)篩選后，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取兩大瓶制成細(xì)胞懸液，離心，棄上清，用rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，如些重復(fù)三次，計(jì)數(shù)。

(4)細(xì)胞融合及hat選擇雜交瘤。

將小鼠瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按1:10細(xì)胞數(shù)量比例混合，在50ml塑膠離心管內(nèi)用rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗1次，1,200rpm，離心8分鐘。棄上清，將細(xì)胞混勻，緩慢加入1ml50％的peg1500融合，融合1分鐘后加入15ml的rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止細(xì)胞融合。1,000rpm，離心5分鐘。棄上清，用50ml的rpmi1640篩選培養(yǎng)液輕輕混懸，平分于10塊96孔板，50μl/孔，37℃，5％co2培養(yǎng)。培養(yǎng)至第六天，換ht培養(yǎng)液(含ht的rpmi1640完全培養(yǎng)液)兩次。

(5)抗體的檢測(cè)。

用0.05mph9.5碳酸緩沖溶液稀釋重組心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-fabp)抗原(深圳市菲鵬生物股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品名稱：k1-fabp)，使其終濃度為2μg/ml。每孔0.1ml加入96孔聚苯乙烯板，37℃孵育2小時(shí)或4℃過(guò)夜，接著用含10％小牛血清或1％脫脂奶粉的0.01mph7.4pbs，0.12ml/孔，37℃孵育2小時(shí)，用于檢測(cè)。重組融合后第七天，取細(xì)胞上清0.1ml于上述96孔檢測(cè)板中，37℃孵育30分鐘，水洗六次后加入10000倍稀釋的辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠igg(深圳市菲鵬生物股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品名稱：羊抗鼠igg)，37℃孵育30分鐘同上洗后，每孔加入100μl含0.1％(m/v)鄰苯二胺，0.1％(v/v)雙氧水，ph5.0檸檬酸磷酸緩沖液，37℃孵育15分鐘，加入稀硫酸溶液，每孔50μl，測(cè)450nm吸收值。rpmi1640完全培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，以測(cè)定值與對(duì)照值得比≧2.0為陽(yáng)性細(xì)胞孔。

分泌抗體陽(yáng)性細(xì)胞孔以1個(gè)細(xì)胞/孔在96孔培養(yǎng)板上用有限稀釋法克隆，篩選陽(yáng)性孔依上法連續(xù)克隆四次，擴(kuò)大培養(yǎng)后，用含10％dmso的完全培養(yǎng)液凍存，細(xì)胞密度為106個(gè)/ml。細(xì)胞融合一次共獲得2株能穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株。于2016年12月22日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)。保藏號(hào)分別為cctccno：c2016220、cctccno：c2016219。保藏號(hào)為cctccno：c2016220的細(xì)胞系分泌的抗體即為1f38，保藏號(hào)為cctccno：c2016219的細(xì)胞系分泌的抗體即為6f20。

3、單克隆抗體的制備。

選6～8周健壯的balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml的弗氏不完全佐劑；10天后腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞。接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動(dòng)物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠瀕死之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲5ml～15ml腹水。收集腹水，離心取上清，放于-20℃冰箱保存。

取腹水上清，用2倍體積的0.06mph4.0的醋酸緩沖液稀釋。向混合液中加原腹水體積3％正辛酸沉淀雜質(zhì)。12000rpm離心20min沉淀雜質(zhì)，取上清過(guò)濾。用1m的naoh調(diào)濾液ph至7.4。向所得的濾液中加等體積的飽和硫酸銨，沉淀igg。12000rpm離心20min后，棄上清，沉淀用0.01mph7.4的pbs復(fù)溶。

4、效價(jià)測(cè)定。

用0.05mph9.5碳酸緩沖溶液稀釋重組心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-fabp)抗原，使其終濃度為2μg/ml。每孔0.1ml加入96孔聚苯乙烯板，37℃孵育2小時(shí)或4℃過(guò)夜。后用含10％小牛血清或1％脫脂奶粉的0.01mph7.4pbs，0.12ml/孔，37℃孵育2小時(shí)，用于檢測(cè)。

(1)細(xì)胞上清效價(jià)的檢測(cè)：用含10％小牛血清或1％脫脂奶粉的0.01mph7.4pbs稀釋1f38、6f20細(xì)胞培養(yǎng)上清依次至10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍和640倍。向已包被抗原的96孔板中每孔依次加入0.1ml的不同稀釋倍數(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)上清，37℃孵育30分鐘，水洗六次后加入10000倍稀釋的辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠igg(深圳市菲鵬生物股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品名稱：羊抗鼠igg)，37℃孵育30分鐘同上洗后，每孔加入100μl含0.1％(m/v)鄰苯二胺，0.1％(v/v)雙氧水，ph5.0檸檬酸磷酸緩沖液，37℃孵育15分鐘，加入稀硫酸溶液，每孔50μl，測(cè)450nm吸收值。2株細(xì)胞在640倍稀釋細(xì)胞培養(yǎng)上清時(shí)，吸收值大于0.5。1f38、6f20細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)可達(dá)到1:640。

(2)小鼠腹水效價(jià)的檢測(cè)：用上述方法檢測(cè)1f38和6f20單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞所制備的腹水抗體效價(jià)。1f38和6f20腹水效價(jià)分別為1：640000，1：640000。

實(shí)施例2

h-fabp檢測(cè)試紙的制備。

1、硝酸纖維素膜的制備。

包被緩沖液的配制：含6％甲醇的0.01mph為7.2的pbs緩沖液為包被緩沖液，0.22μ膜濾過(guò)，置4℃?zhèn)溆?，有效期一周?000ml6％甲醇的0.01mph7.2的pbs緩沖液配方：nacl8g，kcl0.2g，na2hpo4·12h2o2.9g，kh2po40.2g，甲醇60ml，雙蒸去離子水定容至1000ml。

硝酸纖維素膜的制備：用包被緩沖液將抗心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-fabp)單克隆抗體1f38稀釋到1mg/ml～5mg/ml，調(diào)整機(jī)器，劃線為t1線，t1線即為檢測(cè)線，t1線靠近金標(biāo)墊端，距金標(biāo)墊端約5mm。用包被緩沖液將羊抗鼠igg抗體(深圳市菲鵬生物股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品名稱：羊抗鼠igg)稀釋到1mg/ml～5mg/ml，調(diào)整機(jī)器，劃線為c線，c線即為質(zhì)控線，c線靠近吸收墊，距吸收墊約5mm。37℃烘干，封裝備用。

2、膠體金、金標(biāo)記單克隆抗體的制備。

(1)溶液的配制。

①氯金酸的配制：用雙蒸去離子水溶解氯金酸，配成1％溶液，置4℃?zhèn)溆?，有效期四個(gè)月。1000ml1％氯金酸溶液配方：10g氯金酸：雙蒸去離子水定容至1000ml。

②檸檬酸三鈉的配制：用雙蒸去離子水溶解檸檬酸鈉，配成1％溶液，，0.22μ膜濾過(guò)，置4度備用，有效期容至1000ml。

③0.1m碳酸鉀的配制：用雙蒸去離子水配制，0.22μ膜濾過(guò)，置4度備用，有效期四個(gè)月。1000ml0.1m碳酸鉀溶液配方：13.8g碳酸鉀；雙蒸去離子水定容至1000ml。

④2％peg-20000的配制：用雙蒸去離子水配制，0.22μ膜濾過(guò)，置4度備用，有效期四個(gè)月。1000ml2％peg-20000溶液配方：20gpeg-20000；雙蒸去離子水定容至1000ml。

⑤標(biāo)記洗滌保存液的配制：2％牛血清白蛋白(bsa)，0.05％疊氮鈉(nan3)，0.01mph7.2pbs溶液，0.22μ膜濾過(guò)，置4度備用，有效期四個(gè)月。1000ml標(biāo)記洗滌保存液配方：20gbsa，0.5gnan3、0.01mph7.2pbs溶液定容至1000ml。

(2)膠體金的制備：

用雙蒸去離子水將1％氯金酸稀釋成0.01％，置電爐煮沸，按每100ml0.01％氯金酸加入2ml1％檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，直到液體呈亮紅色即停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)足失水。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無(wú)沉淀和漂浮物，有效期一周。

(3)膠體金標(biāo)記單克隆抗體的制備：

用0.1m碳酸鉀調(diào)膠體金的ph值至8.2，按8μg～10μg抗體/ml膠體金加入實(shí)施例1中制備得到的抗心臟型脂肪結(jié)合蛋白單抗，磁力攪拌器混勻30min，攪拌下加入bsa至終濃度為1％，靜置1小時(shí)。13000rpm、4℃離心30min，棄上清，沉淀用標(biāo)記洗滌保存液洗滌兩次，用十分之一初始膠體金體積的標(biāo)記洗滌保存液將沉淀重懸，置4℃?zhèn)溆?，有效期一周?/p>

3、金標(biāo)墊的制備。

(1)封閉液的配制：

2％bsa，0.1％tritonx-100、0.05％nan3，0.01mph7.2pbs溶液，0.22μ膜濾過(guò)，置4度備用，有效期四個(gè)月。1000ml封閉液配方：20gbsa，0.5gnan3、1mltritonx-100、0.01mph7.2pbs溶液定容至1000ml。

(2)金標(biāo)墊的制備：

將金標(biāo)墊浸泡于封閉液中30min后好的金標(biāo)記抗體均勻的鋪在金標(biāo)墊上，每毫升溶液鋪20平方厘米，冷凍干燥，封裝，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

4、試紙條樣品墊的制備。

(1)封閉液的配制：

2％bsa，0.1％trtionx-100、0.05％nan3，0.01mph7.2pbs溶液，0.22μ膜濾過(guò)，置4度備用，有效期四個(gè)月。1000ml封閉液配方：20gbsa，0.5gnan3、1mltrtionx-100、0.01mph7.2pbs溶液定容至1000ml。

(2)樣品墊的制備：

將樣品墊浸泡于封閉液中30min后，于37℃烘干，封裝，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

5、試紙條的組裝。

將吸收墊(購(gòu)自millipore公司)、硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊依次層疊設(shè)置在不吸水的支撐pvc膠板上，切成3mm寬的小條。每十小條一包，加入干燥劑，真空封裝，得到h-fabp檢測(cè)試紙。

實(shí)施例3

h-fabp檢測(cè)試劑盒

1、h-fabp檢測(cè)試劑盒包括：

①試紙條一包(10條/包)

②樣品稀釋液一瓶(10ml/瓶)

相關(guān)溶液的配制。

樣品稀釋液：樣品稀釋液為8％nacl溶液。配制方法：80gnacl，加蒸餾水定容至1000ml。

2、膠體金法檢測(cè)h-fabp含量

(1)直接將采集好的靜脈全血20μl置于含有180μl稀釋液的塑料試管中，充分混勻，取120μl溶解好的樣品加入到試紙卡加樣孔，等待15min后即可觀察結(jié)果。

(2)結(jié)果判定：當(dāng)試紙條出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紫紅色質(zhì)控線，沒(méi)有出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紫紅色檢測(cè)線(請(qǐng)參閱圖4)，結(jié)果判為陰性。當(dāng)試紙條出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紫紅色質(zhì)控線，第一檢測(cè)線同時(shí)也出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紫紅色檢測(cè)線(請(qǐng)參閱圖3)，結(jié)果判為陽(yáng)性。檢測(cè)線顏色越深說(shuō)明被檢測(cè)樣品的抗原水平越高。當(dāng)試紙條沒(méi)有出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紫紅色質(zhì)控線，不管有沒(méi)有出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紫紅色檢測(cè)線。結(jié)果都判為檢測(cè)試紙條失效，應(yīng)廢棄。

實(shí)施例4

h-fabp檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用。

對(duì)608例臨床血清進(jìn)行測(cè)定，其中308例急性心肌梗死樣本，300例正常人樣本，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1：實(shí)施例3制作的h-fabp檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果。

由表1可以看出，實(shí)施例3制作的h-fabp檢測(cè)試劑盒檢出急性心肌梗死陽(yáng)性樣本299份，相對(duì)靈敏度為97.1％。300份陰性樣本檢出296份，其中4份為假陽(yáng)，相對(duì)特異性為98.7％。說(shuō)明實(shí)施例3制作的h-fabp檢測(cè)試劑盒完全可以用于常規(guī)的診斷急性心肌梗死快速檢測(cè)。

實(shí)施例5

h-fabp檢測(cè)試劑盒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。

1、h-fabp檢測(cè)試劑盒批內(nèi)及批間穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。

將實(shí)施例3制得同批次及不同批次生產(chǎn)的h-fabp檢測(cè)試劑盒檢測(cè)心肌梗死陽(yáng)性標(biāo)本及陰性標(biāo)本。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)驗(yàn)證試劑盒批內(nèi)和批間結(jié)果一致。

2、h-fabp檢測(cè)試劑盒存放穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。

將實(shí)施例3制得的h-fabp檢測(cè)試劑盒放在室溫下(25℃)，每周抽檢樣品。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)驗(yàn)證h-fabp檢測(cè)試劑盒在室溫下保存18個(gè)月，檢測(cè)結(jié)果仍符合要求。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。