本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種可分泌抗c反應(yīng)蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞、c反應(yīng)蛋白檢測試劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

c反應(yīng)蛋白(c-reactionprotein，crp)最早在1930年由tillet和francis發(fā)現(xiàn)。最初他們觀察到一些急性病人的血清可與肺炎鏈球菌的莢膜c-多糖發(fā)生反應(yīng)，隨后證實(shí)能與c-多糖反應(yīng)的物質(zhì)是一種蛋白質(zhì)，因而將這種蛋白質(zhì)命名為c反應(yīng)蛋白(c-reactionprotein，crp)。crp主要是在白細(xì)胞介素(il-6)等細(xì)胞因子調(diào)節(jié)下，由肝臟合成分泌的一種蛋白質(zhì)，外周血淋巴細(xì)胞亦能合成少量的crp。crp以5個(gè)相同亞單位形成環(huán)狀的五聚體，相對分子量為115kd～140kd。電泳分布在慢γ區(qū)帶，有時(shí)可以延伸到β區(qū)帶，其電泳遷移率易受一些因素影響，如鈣離子及緩沖液成分等。

c-反應(yīng)蛋白(crp)是急性時(shí)相蛋白中變化最顯著的一種，也是人體感染的一個(gè)重要敏感標(biāo)志物之一。crp具有激活補(bǔ)體、增強(qiáng)淋巴細(xì)胞活性、促進(jìn)吞噬細(xì)胞功能、清除病理性產(chǎn)物、抑制血小板凝集等作用。近年來，大量研究資料表明，crp作為炎癥因子，雖為非特異性的標(biāo)志物，但它與某些疾病如感染性疾病、心血管疾病、惡性腫瘤、自身免疫病、抑郁癥等疾病的發(fā)生發(fā)展存在很大的相關(guān)性，具體如下：

1、crp作為急性時(shí)相蛋白在各種急性炎癥、組織損傷、心肌梗塞、手術(shù)創(chuàng)傷、放射性損傷等疾病發(fā)作后數(shù)小時(shí)迅速升高并有成倍增長之勢。病變好轉(zhuǎn)時(shí)又迅速降至正常，其升高幅度與感染的程度呈正相關(guān)。

2、crp與其它炎癥因子的相關(guān)性，crp與其它炎癥因子如白細(xì)胞總數(shù)、紅細(xì)胞沉降率和多形核白細(xì)胞等具有密切相關(guān)性。crp與wbc(白細(xì)胞)存在正相關(guān)。在炎癥反應(yīng)中起著積極作用使人體具有非特異性抵抗力。在患者疾病發(fā)作時(shí)crp可早于wbc而上升，恢復(fù)正常也很快，故具有極高的敏感性。

3、crp可用于細(xì)菌和病毒感染的鑒別診斷，一旦發(fā)生炎癥crp水平即升高而病毒性感染crp大都正常。膿毒血癥crp迅速升高，而依賴血培養(yǎng)則至少需要48小時(shí)，且其陽性率不高。又如crp能快速有效地檢測細(xì)菌性腦膜炎其陽性率達(dá)99％。

4、惡性腫瘤患crp大都升高，如crp與afp的聯(lián)合檢測可用于肝癌與肝臟良性疾病的鑒別診斷。crp測定用于腫瘤的治療和預(yù)后有積極意義。手術(shù)前crp上升，手術(shù)后則下降，且其反應(yīng)不受放療、化療和皮質(zhì)激素治療的影響，有助于臨床評估腫瘤的進(jìn)程。

目前，臨床實(shí)驗(yàn)室測定crp的常規(guī)方法主要有膠乳凝集試驗(yàn)和免疫濁度法(如散射、透射比濁法,并且已實(shí)現(xiàn)了自動化)以及靈敏度和精確度較高的放射免疫測定方法(ria)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)和超靈敏的發(fā)光法，臨床檢測主要是免疫比濁法。具體如下：

1、免疫濁度法：當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體在兩者比例合適時(shí)，抗原抗體在特殊緩沖液中快速形成抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度，如形成的復(fù)合物增加，反應(yīng)液的濁度隨之增加，與一系列的標(biāo)準(zhǔn)品對照，即可計(jì)算出受檢物的含量。國內(nèi)crp試劑盒一般采用免疫比濁法，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，但是免疫學(xué)中常因抗原過剩而引起的勾狀效應(yīng)，導(dǎo)致假陽產(chǎn)生。

2、乳膠凝集法：以乳膠顆粒作為載體的一種間接凝集試驗(yàn)。即吸附可溶性抗原于其表面，特異性抗體與之結(jié)合后，可產(chǎn)生凝集反應(yīng)?，F(xiàn)國內(nèi)市場上相關(guān)crp乳膠凝集法試劑盒較少，乳膠凝集法檢測crp缺乏精密度，樣品的滴度是靠稀釋血清的陽性結(jié)果來確定的，不能定量的表示檢測結(jié)果，而且對于小量濃度的crp不夠敏感，而不能滿足現(xiàn)代臨床對醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的要求。

3、放射免疫測定方法：將高靈敏度的同位素示蹤法和高特異性的抗原抗體免疫化學(xué)反應(yīng)結(jié)合使用的技術(shù)。選用適當(dāng)?shù)姆派湫酝凰貥?biāo)記抗原，并與限量的抗體結(jié)合，形成可逆性的標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物。如果加入待測的非標(biāo)記抗原，則標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原共同爭奪限量抗體，最后達(dá)到平衡狀態(tài)。加入的非標(biāo)記抗原越多，標(biāo)記抗原與抗體的結(jié)合就越少。放射免疫技術(shù)已廣泛應(yīng)用于測定各種激素、腫瘤相關(guān)抗原(甲胎蛋白、癌胚抗原)、藥物(地高辛、嗎啡等)、病毒抗原(乙型肝炎表面抗原)以及ig等，其靈敏度可達(dá)pg/毫升，為目前最靈敏的分析方法，并有自動化設(shè)備。然而，檢測放射性同位素需要昂貴的儀器和輻射防護(hù)設(shè)備，并需要專門從事放射性同位素工作的實(shí)驗(yàn)室和放射性廢物處理裝置，操作人員常常受到放射線照射的威脅，而且，作為放免指示劑的某些放射性同位素，由于半衰期短，限制了其一些試劑的保存時(shí)間，其檢測所需成本較高時(shí)間亦較長。

4、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，是利用抗原抗體之間專一性鍵結(jié)之特性，對檢體進(jìn)行檢測；由于結(jié)合于固體承載物上之抗原或抗體仍可具有免疫活性，因此設(shè)計(jì)其鍵結(jié)機(jī)制后，配合酶結(jié)合物示蹤，即可顯示特定抗原或抗體是否存在，并可利用od值進(jìn)行定量/半定量分析。目前已用酶標(biāo)法測定血清蛋白質(zhì)、腫瘤抗原、激素、藥物、各種微生物和寄生蟲的抗原，以及上述各種抗原所產(chǎn)生的相應(yīng)抗體。在臨床診斷、疾病普查、法醫(yī)鑒定、獸醫(yī)檢查、植物病害檢驗(yàn)等方面應(yīng)用廣泛。國內(nèi)外很多廠家都有crp相關(guān)試劑盒，在市場最為普遍，但是一般作為初篩，現(xiàn)階段還不能作為定性、定量、定位手段，特異性較差。且酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa法)操作較為復(fù)雜，人工誤差比較大，其檢測濃度的線性范圍較窄，對于高濃度樣本的測定結(jié)果誤差較大往往低于實(shí)際濃度，特異性和重復(fù)性較差。

新發(fā)展的免疫熒光技術(shù)是一種熒光微球免疫層析定量檢測方法，該方法充分利用粒子的優(yōu)良特性，并結(jié)合免疫層析技術(shù)，在優(yōu)化試紙條結(jié)構(gòu)和組成材料的基礎(chǔ)上，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)的熒光定量檢測。然而由于熒光標(biāo)記平臺工藝并不成熟，所使用的抗體原料性能善較差，抗體特異性、親和力上的不足。

綜上，傳統(tǒng)的c反應(yīng)蛋白檢測試劑特異性不高、線性范圍較窄。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，有必要提供一種特異性較高、線性范圍較寬的c反應(yīng)蛋白檢測試劑及其制備方法，以及可應(yīng)用在該c反應(yīng)蛋白檢測試劑的可分泌抗c反應(yīng)蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞、單克隆抗體及應(yīng)用。

一種可分泌抗c反應(yīng)蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，保藏號為cctccno：c2016218。

上述的雜交瘤細(xì)胞分泌的抗c反應(yīng)蛋白單克隆抗體，所述抗c反應(yīng)蛋白單克隆抗體標(biāo)記為crp-2。

上述的雜交瘤細(xì)胞或上述的抗c反應(yīng)蛋白單克隆抗體在制備c反應(yīng)蛋白的檢測試劑或c反應(yīng)蛋白的檢測試劑盒中的應(yīng)用。

一種c反應(yīng)蛋白檢測試劑，包括第一抗體和第二抗體，所述第一抗體為抗c反應(yīng)蛋白的兔多克隆抗體，所述第二抗體為抗c反應(yīng)蛋白的單克隆抗體，所述第二抗體為所述第一抗體的配對抗體，所述第二抗體通過雜交瘤細(xì)胞株crp2分泌得到，所述雜交瘤細(xì)胞株crp2的保藏號為cctccno：c2016218。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第一抗體通過c反應(yīng)蛋白抗原免疫兔子后提取兔子血清中的抗體得到，所述第一抗體標(biāo)記為crp-8。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述c反應(yīng)蛋白抗原為重組人c反應(yīng)蛋白抗原。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第一抗體上標(biāo)記有熒光微球，所述第一抗體與所述熒光微球的質(zhì)量比為30～50:100。

一種c反應(yīng)蛋白檢測試劑盒，包括上述的c反應(yīng)蛋白檢測試劑。

一種c反應(yīng)蛋白檢測試劑的制備方法，所述c反應(yīng)蛋白檢測試劑包括第一抗體和第二抗體，所述方法包括如下步驟：

用c反應(yīng)蛋白抗原分別免疫兔子和小鼠；

提取免疫后兔子血清中的抗體，純化后獲得第一抗體，所述第一抗體為抗c反應(yīng)蛋白的兔多克隆抗體；

收集免疫后小鼠的脾細(xì)胞，并將所述脾細(xì)胞與小鼠瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，篩選獲得能夠分泌抗c反應(yīng)蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；以及

將多株所述雜交瘤細(xì)胞分泌得到的抗c反應(yīng)蛋白的單克隆抗體分別與所述第一抗體進(jìn)行抗體配對，并采用雙抗體夾心篩選獲得與所述第一抗體配對的抗體，得到所述第二抗體。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第二抗體通過雜交瘤細(xì)胞株crp2分泌得到，所述雜交瘤細(xì)胞株crp2的保藏號為cctccno：c2016218。

上述雜交瘤細(xì)胞的分泌產(chǎn)量高，分泌得到的抗c反應(yīng)蛋白的單克隆抗體具有高特異性且性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用在制備c反應(yīng)蛋白檢測試劑或c反應(yīng)蛋白檢測試劑盒中。

上述c反應(yīng)蛋白檢測試劑包括第一抗體和第二抗體，第一抗體為抗c反應(yīng)蛋白的兔多克隆抗體，第二抗體為抗c反應(yīng)蛋白的單克隆抗體，第二抗體為第一抗體的配對抗體。不同于傳統(tǒng)使用兩個(gè)單克隆抗體配對的方法，本檢測試劑的使用兔多克隆抗體與鼠單克隆抗體進(jìn)行配對，并篩選出與相應(yīng)的兔多克隆抗體配對活性好的鼠單克隆抗體。抗體制備方法簡單，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該配對信號更優(yōu)，檢測試劑的特異性好、線性范圍寬。

附圖說明

圖1為一實(shí)施方式的c反應(yīng)蛋白檢測試劑的制備方法流程圖；

圖2為施例4中采用c反應(yīng)蛋白檢測試劑測試獲得不同濃度c反應(yīng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品與強(qiáng)度值的線性關(guān)系圖的。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施的限制。

一實(shí)施方式的可分泌抗c反應(yīng)蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，于2016年12月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，地址：中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏號為cctccno：c2016218。分類命名：雜交瘤細(xì)胞株crp2。該雜交瘤細(xì)胞可分泌出抗c反應(yīng)蛋白的單克隆抗體，記為crp-2，crp-2可以作為檢測抗體。crp-2可以應(yīng)用于c反應(yīng)蛋白檢測試劑或c反應(yīng)蛋白檢測試劑盒的制備領(lǐng)域中。

一種c反應(yīng)蛋白檢測試劑，包括第一抗體和第二抗體，第一抗體為抗c反應(yīng)蛋白的兔多克隆抗體，第二抗體為抗c反應(yīng)蛋白的單克隆抗體，第二抗體為第一抗體的配對抗體，第二抗體通過雜交瘤細(xì)胞株crp2分泌得到，該雜交瘤細(xì)胞株crp2于2016年12月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，地址：中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏號為cctccno：c2016218。

在一個(gè)實(shí)施方式中，第一抗體通過c反應(yīng)蛋白抗原免疫兔子后提取兔子血清中的抗體得到，第一抗體標(biāo)記為crp-8。試驗(yàn)結(jié)果，由雜交瘤細(xì)胞分泌的抗c反應(yīng)蛋白的單克隆抗體crp-2與該兔多克隆抗體crp-8配對活性較強(qiáng)，在金標(biāo)等定性平臺上使用時(shí)特異性好、線性范圍寬。

具體地，免疫兔子用的c反應(yīng)蛋白抗原為重組人c反應(yīng)蛋白抗原，具體到本實(shí)施方式中，重組人c反應(yīng)蛋白抗原為菲鵬生物股份有限公司生產(chǎn)，lot：fp20160301。經(jīng)人的c反應(yīng)蛋白抗原免疫后，兔子血清中能夠相應(yīng)的分泌出抗人的c反應(yīng)蛋白的抗體，檢測特異性好。針對性開發(fā)的重組人c反應(yīng)蛋白抗原作為多抗血清的免疫原，避免了天然抗原成分復(fù)雜，抗血清抗體成分太雜的情況，能更容易獲得特異性好，專一性佳的多抗血清。之后與單克隆抗體進(jìn)行夾心檢測，保證了產(chǎn)品的特異性優(yōu)勢。

在一個(gè)實(shí)施方式中，第一抗體上標(biāo)記有熒光微球，第一抗體與熒光微球的質(zhì)量比為30～50:100，例如35:100、40:100、45:100等等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在免疫活化時(shí)，抗c反應(yīng)蛋白的兔多克隆抗體(第一抗體)能夠比傳統(tǒng)的單克隆抗體標(biāo)記更大劑量的熒光微球，可以達(dá)到更寬的線性范圍，從而適用不同濃度的c反應(yīng)蛋白檢測。而傳統(tǒng)的單克隆抗體標(biāo)記的熒光微球一般在質(zhì)量比為20:100時(shí)活性趨勢下降，可以達(dá)到線性范圍較窄。

在一個(gè)實(shí)施方式中，熒光微球先采用ph值為4.7的2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(mes)緩沖液進(jìn)行清洗。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用ph值為4.7的mes緩沖液進(jìn)行清洗后可以降低抗體與微球的聚集問題。

在一個(gè)實(shí)施方式中，熒光微球標(biāo)記好的抗體可以凍干于試紙條上，利于長期保存。

上述c反應(yīng)蛋白檢測試劑包括第一抗體和第二抗體，第一抗體為抗c反應(yīng)蛋白的兔多克隆抗體，第二抗體為抗c反應(yīng)蛋白的單克隆抗體，第二抗體為第一抗體的配對抗體。不同于傳統(tǒng)使用兩個(gè)單克隆抗體配對的方法，本檢測試劑的使用兔多克隆抗體與鼠單克隆抗體進(jìn)行配對，并篩選出與相應(yīng)的兔多克隆抗體配對活性好的鼠單克隆抗體?？贵w制備方法簡單，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該配對信號更優(yōu)于傳統(tǒng)模式，檢測試劑的特異性好、線性范圍也明顯優(yōu)于同類產(chǎn)品。

該c反應(yīng)蛋白檢測可用末梢血檢測。病人易接受、可隨身攜帶、操作簡單、方便、3min～5min即可得結(jié)果。

此外，本申請還提供一實(shí)施方式的c反應(yīng)蛋白檢測試劑盒，該試劑盒中包括了上述c反應(yīng)蛋白檢測試劑。當(dāng)然，c反應(yīng)蛋白檢測試劑盒還可以包括包裝盒、標(biāo)準(zhǔn)品、對照品等。該檢測試劑盒可應(yīng)用于c反應(yīng)蛋白的免疫熒光檢測等等。

此外，請參閱圖1，一實(shí)施方式的c反應(yīng)蛋白檢測試劑的制備方法，該c反應(yīng)蛋白檢測試劑包括第一抗體和第二抗體，制備方法包括如下步驟s110～s140。

s110、用c反應(yīng)蛋白抗原分別免疫兔子和小鼠。

本實(shí)施方式中，c反應(yīng)蛋白抗原為重組人c反應(yīng)蛋白抗原。

兔子可以選用新西蘭兔，具體可采用c反應(yīng)蛋白抗原與弗氏完全佐劑混合后在兔子的皮下和淋巴結(jié)多點(diǎn)免疫，并采血進(jìn)行效價(jià)檢測，追加免疫至效價(jià)穩(wěn)定后采集分離血清。

對小鼠免疫時(shí)，可采用c反應(yīng)蛋白抗原與弗氏完全佐劑混合后皮下注射至小鼠腹腔內(nèi)，并采尾血進(jìn)行效價(jià)檢測，追加免疫至效價(jià)達(dá)到融合要求。

s120、提取免疫后兔子血清中的抗體，純化后獲得第一抗體，第一抗體為抗c反應(yīng)蛋白的兔多克隆抗體。

具體地，可以在對兔子免疫后，當(dāng)抗體效價(jià)穩(wěn)定后采集分離血清，并用50％的硫酸銨沉淀，緩沖液a復(fù)溶后用g25脫鹽后再過ctni抗原親和柱純化。緩沖液a中含有20mmol/l的pb(磷酸鹽緩沖液)，150mmol/l的nacl，ph為7.4。

過柱分離時(shí)先用緩沖液a平衡親和柱，上完樣后繼續(xù)用緩沖液a淋洗直到a280降至0.01以下并保持平衡。之后用緩沖液b(0.2mol/l甘氨酸，ph2.7)洗脫，收集蛋白，即獲得第一抗體。

在一個(gè)實(shí)施方式中，洗脫完成獲得第一抗體后，在第一抗體中加入為ph9.0的tris-hcl調(diào)節(jié)ph到中性，避免抗體變性。收集到的第一抗體可以在4℃用緩沖液a透析過夜，4度保存。

s130、收集免疫后小鼠的脾細(xì)胞，并將脾細(xì)胞與小鼠瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，篩選獲得能夠分泌抗c反應(yīng)蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。

具體地，可以在小鼠免疫至效價(jià)達(dá)到融合要求后，在無菌條件下取出脾臟，置于平皿中，制成細(xì)胞懸液。收集免疫后的小鼠的脾細(xì)胞，并將脾細(xì)胞與小鼠瘤細(xì)胞進(jìn)行融合得到融合細(xì)胞。細(xì)胞融合后，培養(yǎng)至適宜的濃度，通過hat培養(yǎng)基加入c反應(yīng)蛋白抗原，篩選出能夠分泌抗c反應(yīng)蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。

s140、將多株s130中獲得的雜交瘤細(xì)胞分泌得到的抗c反應(yīng)蛋白的單克隆抗體分別與s120中得到的第一抗體進(jìn)行抗體配對，并采用雙抗體夾心篩選獲得與第一抗體配對的抗體，得到所述第二抗體。

具體地，可以將第一抗體用膠體金的標(biāo)記，每株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗c反應(yīng)蛋白的單克隆抗體分別用nc膜包被，分別采用雙抗體夾心篩選進(jìn)行配對活性檢測，獲得配對活性較強(qiáng)的抗體。

本實(shí)施方式中，由雜交瘤細(xì)胞分泌的抗c反應(yīng)蛋白的單克隆抗體crp-2與該兔多克隆抗體crp-8配對活性較強(qiáng)，在金標(biāo)等定性平臺上使用時(shí)特異性好、線性范圍寬。相對應(yīng)篩選獲得分泌crp-2的雜交瘤細(xì)胞株crp2。該雜交瘤細(xì)胞株crp2的保藏號為cctccno：c2016218。

需要說明的是，c反應(yīng)蛋白檢測試劑的制備方法也可以不完全按上述步驟s110～s140的順序進(jìn)行，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要作出調(diào)整，例如s130可以在s120之前進(jìn)行。再例如，也可以是先對兔子免疫后獲得第一抗體后，再進(jìn)行對小鼠的免疫的操作。

上述c反應(yīng)蛋白檢測試劑的制備方法，不同于傳統(tǒng)使用兩個(gè)單克隆抗體配對的方法，本檢測試劑的使用兔多克隆抗體與鼠單克隆抗體進(jìn)行配對，并篩選出與相應(yīng)的兔多克隆抗體配對活性好的鼠單克隆抗體。抗體制備方法簡單，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該配對信號更優(yōu)于傳統(tǒng)模式，獲得的檢測試劑的特異性好、線性范圍寬。

以下為具體實(shí)施例。

實(shí)施例中采用藥物和儀器如非特別說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)選擇。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如文獻(xiàn)、書本中所述的條件或者試劑盒生產(chǎn)廠家推薦的方法實(shí)現(xiàn)。

未特別說明，重組人crp抗原

實(shí)施例1

抗c反應(yīng)蛋白的兔多克隆抗體的制備

1、動物免疫

挑選健壯新西蘭兔(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心：廣東省佛山市南海黃岐鄱陽路119號)3只，將重組人crp抗原(菲鵬生物股份有限公司生產(chǎn)，lot：fp20160301)稀釋成1mg/ml，與等體積弗氏完全佐劑混合乳化后，按每只兔1mg免疫原的劑量在皮下和淋巴結(jié)多點(diǎn)免疫。以后每隔2周加強(qiáng)免疫一次，抗原改用弗氏不完全佐劑乳化，免疫劑量同前，每次加強(qiáng)免疫后第10天采血檢測血清效價(jià)，效價(jià)穩(wěn)定后采集分離大樣血清。

2、抗體純化

取以上分離獲得的血清，用50％硫酸銨沉淀，12000rpm離心30min，沉淀用緩沖液a(20mmol/lpb，150mmol/lnacl，ph7.4)復(fù)溶，用g25脫鹽后再過ctni抗原親和柱，上樣緩沖液為a(20mmol/lpb，150mmol/lnacl，ph7.4)，上樣前先用緩沖液a平衡親和柱。上完樣后繼續(xù)用緩沖液a淋洗直到a280降至0.01以下并保持平衡。用緩沖液b(0.2m甘氨酸，ph2.7)洗脫，收集蛋白峰，洗脫完成后加入tris-hcl(1mol/l，ph9.0)調(diào)節(jié)ph到中性，避免抗體變性，洗收集到的目的抗體在4度用緩沖液a透析過夜，4度保存。

實(shí)施例2

抗c反應(yīng)蛋白的單克隆抗體的制備

1、動物免疫

將重組人crp抗原(菲鵬生物股份有限公司生產(chǎn)，lot：fp20160301)稀釋成1mg/ml，與弗氏完全佐劑(sigma，f5881)等體積混合，得到油狀乳液。將該乳液以每只0.2毫升的劑量皮下施給balb/c小鼠(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心：廣東省佛山市南海黃岐鄱陽路119號，6周齡雌性，5只)背部位點(diǎn)，第一次免疫14天后腹腔增強(qiáng)免疫(抗原與弗氏不完全佐劑(sigma，f5506)等體積混合)，增強(qiáng)免疫到四針后，采尾血進(jìn)行效價(jià)檢測，效價(jià)達(dá)到融合要求。

融合前3天，用相同劑量抗原與等體積0.9％氯化鈉注射液混合腹腔注射追加免疫。

2、雜交瘤細(xì)胞系的制備。

(1)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備。

以balb/c鼠腹腔巨噬細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞。在融合前1天，balb/c鼠拉頸處死，75％酒精全身浸泡5分鐘，超凈臺內(nèi)，無菌操作下用剪刀剪開腹部皮膚，暴露腹膜，用注射器腹腔注入rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液5ml，反復(fù)沖洗，回收沖洗液，1000rpm，離心5分鐘，留沉淀，用rpmi1640篩選培養(yǎng)液(含hat的rpmi1640完全培養(yǎng)液中)重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度1×105個(gè)/ml，加入96孔板，180μl/孔，37℃，5％co2培養(yǎng)過夜。

(2)免疫脾細(xì)胞的制備。

小鼠末次免疫后第三天，在無菌條件下取出脾臟，置于平皿中，rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液沖洗一次，放于小燒杯的尼龍網(wǎng)上磨碎過濾，制成細(xì)胞懸液。離心，棄上清rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，如此重復(fù)三次，計(jì)數(shù)。

(3)小鼠瘤細(xì)胞的制備。

小鼠瘤細(xì)胞經(jīng)篩選后，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取兩大瓶制成細(xì)胞懸液，離心，棄上清，用rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，如些重復(fù)三次，計(jì)數(shù)。

(4)細(xì)胞融合及hat選擇雜交瘤。

將小鼠瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按1:10細(xì)胞數(shù)量比例混合，在50ml塑膠離心管內(nèi)用rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗1次，1,200rpm，離心8分鐘。棄上清，將細(xì)胞混勻，緩慢加入1ml50％的peg1500融合，融合1分鐘后加入15ml的rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止細(xì)胞融合。1,000rpm，離心5分鐘。棄上清，用50ml的rpmi1640篩選培養(yǎng)液輕輕混懸，平分于10塊96孔板，50μl/孔，37℃，5％co2培養(yǎng)。培養(yǎng)至第六天，換ht培養(yǎng)液(含ht的rpmi1640完全培養(yǎng)液)兩次。

(5)抗體的檢測。

用0.05mph9.5碳酸緩沖溶液稀釋重組人crp抗原，使其終濃度為2μg/ml。每孔0.1ml加入96孔聚苯乙烯板，37℃孵育2小時(shí)或4℃過夜，接著用含10％小牛血清或1％脫脂奶粉的0.01mph7.4pbs，0.12ml/孔，37℃孵育2小時(shí)，用于檢測。重組融合后第七天，取細(xì)胞上清0.1ml于上述96孔檢測板中，37℃孵育30分鐘，水洗六次后加入10000倍稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠igg(深圳市菲鵬生物股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品名稱：羊抗鼠igg)，37℃孵育30分鐘同上洗后，每孔加入100μl含0.1％(m/v)鄰苯二胺，0.1％(v/v)雙氧水，ph5.0檸檬酸磷酸緩沖液，37℃孵育15分鐘，加入稀硫酸溶液，每孔50μl，測450nm吸收值。rpmi1640完全培養(yǎng)液作為陰性對照，以測定值與對照值得比≧2.0為陽性細(xì)胞孔。

分泌抗體陽性細(xì)胞孔以1個(gè)細(xì)胞/孔在96孔培養(yǎng)板上用有限稀釋法克隆，篩選陽性孔依上法連續(xù)克隆四次，擴(kuò)大培養(yǎng)后，用含10％dmso的完全培養(yǎng)液凍存，細(xì)胞密度為106個(gè)/ml。細(xì)胞融合一次共獲得多株能夠穩(wěn)定分泌抗c反應(yīng)蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

實(shí)施例3

抗c反應(yīng)蛋白的單克隆抗體與抗c反應(yīng)蛋白的兔多克隆抗體進(jìn)行抗體配對

將實(shí)施例1中純化所得的抗c反應(yīng)蛋白的兔多克隆抗體進(jìn)行膠體金的標(biāo)記，4/萬膠體金標(biāo)記兔多抗2mg/ml。并nc膜將實(shí)施例2中的獲得的多株雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗c反應(yīng)蛋白的單克隆抗體分別包被，nc膜包被鼠單抗的濃度為2mg/ml。加入crp參考血清，采用雙抗體夾心篩選檢測得出一對配對活性較強(qiáng)的抗體。分別為標(biāo)記為兔多抗crp-8和鼠單抗crp-2。篩選所得抗體crp-8標(biāo)記配對crp-2可以實(shí)用在金標(biāo)定性平臺，也可用于熒光定量平臺模式調(diào)試。其中，分泌鼠單抗crp-2的雜交瘤細(xì)胞株于2016年12月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，地址：中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏號為cctccno：c2016218。

實(shí)施例4

c反應(yīng)蛋白檢測試劑的應(yīng)用

清洗：按1mg(100μl)微球+1ml0.1m的mes緩沖液的比例進(jìn)行清洗，mes緩沖液為2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(mes)緩沖液，ph＝6.0?；靹蚝?0000rpm離心20min左右。

活化：加入一定體積的mes緩沖液4.7，超聲混勻，加入現(xiàn)配的12μg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)與72μg的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)至終體積1ml，37℃靜置反應(yīng)18min，每5min混勻一次，離心20000rpm，20min棄上清。

偶聯(lián)：加入一定體積的濃度為50mmol/l，ph＝7.4的硼酸-硼砂緩沖液(內(nèi)含0.01％sds)，超聲混勻，同時(shí)將0.4mg抗體/mg微球的實(shí)施例3篩選獲得的抗體crp-8稀釋在濃度為50mmol/l，ph＝7.4的硼酸-硼砂緩沖液中(內(nèi)含0.01％sds)，加入crp-8使反應(yīng)體系終體積為1ml，37℃靜置反應(yīng)4h左右，每1個(gè)小時(shí)混勻一次。

封閉：用1mlbsa(5％)封閉1h，20000rpm離心20min，棄上清。

清洗：用tris-hcl清洗1次，20000rpm離心20min，棄上清。

保存：保存于400μl濃度為25mmol/l的mes(ph＝7.4)的緩沖液中。用的時(shí)候再用金標(biāo)恢復(fù)液db215(菲鵬生物股份有限公司lot：fp20160226)稀釋50倍左右，凍干。

包被：采用實(shí)施例3中篩選獲得的抗體crp-2進(jìn)行包被，終濃度約為1.0mg/ml，包被液為菲鵬熒光平臺包被液。

檢測：將標(biāo)本稀釋100倍，混勻30s左右，加樣60μl～75μl，反應(yīng)3min～3.5min，檢測熒光值。分別檢測了兩種質(zhì)控為陽性的c反應(yīng)蛋白(抗原)，不同濃度c反應(yīng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的強(qiáng)度值結(jié)果如下表1所示。

表1：應(yīng)用c反應(yīng)蛋白檢測試劑的測試結(jié)果

將表1的抗原1的數(shù)據(jù)作圖后得到圖2。從圖2中看出該c反應(yīng)蛋白檢測試劑測試不同濃度的c反應(yīng)蛋白時(shí)，配對信號的線性范圍寬，濃度在300μg/ml以上的c反應(yīng)蛋白濃度依然能夠測試。

進(jìn)一步采用該c反應(yīng)蛋白檢測試劑檢測醫(yī)院陽性定值血清檢測30份，具體數(shù)據(jù)如下表2所示。

表2：應(yīng)用c反應(yīng)蛋白檢測試劑的測試結(jié)果

由于人工或儀器及其他因素影響，約可以接受±10％左右偏差，符合率達(dá)99.4％，其在診斷中可有效判斷病情。

由以上結(jié)果可得出本實(shí)施例的c反應(yīng)蛋白檢測試劑采用兔多抗與鼠單抗進(jìn)行配對，線性可以0.1μg/ml～300μg/ml，線性較寬，測定醫(yī)院定值血符合率高達(dá)99％以上，此c反應(yīng)蛋白檢測試劑具有診斷上的實(shí)用性。

對比例1

測試方法與實(shí)施例4相同，c反應(yīng)蛋白檢測試劑采用未經(jīng)篩選的c反應(yīng)蛋白的單克隆抗體與兔多抗進(jìn)行配對，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記使用量僅達(dá)0.2mg抗體每mg微球。活化試劑使用10mmmesph6.0，有少量聚集，聚集峰面積30000左右。將同樣的標(biāo)本稀釋100倍，混勻30s左右，加樣60μl～75μl，反應(yīng)3min～3.5min，檢測強(qiáng)度值。不同濃度樣c反應(yīng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的熒光值結(jié)果如下表3所示。

表3：應(yīng)用對比例1的c反應(yīng)蛋白檢測試劑的測試結(jié)果

從表3中可以看出，對比例1的c反應(yīng)蛋白檢測試劑可以看出，c反應(yīng)蛋白檢測試劑的線性過窄，在50μg/ml后活性趨勢無明顯上升，到100μg/ml有下降趨勢。

以上結(jié)果表明，實(shí)施例3篩選獲得的兔多抗crp-8和鼠單抗crp-2組成的c反應(yīng)蛋白檢測試劑。熒光微球的標(biāo)記量可以大幅度提升，檢測的線性范圍寬，特異性好，達(dá)到市場要求。調(diào)節(jié)相應(yīng)試劑及ph后使得標(biāo)記單抗在熒光微球表面均勻分散，與微球的結(jié)合能力大大增強(qiáng)，提高了檢測的分析靈敏度。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。