本發(fā)明涉及一種抗羊igmμ鏈單克隆抗體，還涉及分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其用途，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：igm是免疫球蛋白之一，分泌型igm為五聚體，是分子量最大的ig(約900kd)，主要存在于血液中，占血清免疫球蛋白總量的5％～10％。igm是抗原初次刺激機(jī)體后體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體，是機(jī)體抗感染的“先鋒部隊(duì)”；具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性和細(xì)胞溶解活性，是抗血管內(nèi)感染的第一線抗體，igm抗體一般為保護(hù)性抗體，對(duì)防止菌血癥起主要作用。在生物進(jìn)化中，igm也是出現(xiàn)最早的ig。在胚胎發(fā)育晚期，胎兒就開(kāi)始具有產(chǎn)生igm的能力，但是igm不能通過(guò)胎盤(pán)。一旦發(fā)生感染，機(jī)體就快速產(chǎn)生igm，但持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)，igm的半衰期短，僅5.1天，而且在感染的早期即已產(chǎn)生。此外，由于igm在結(jié)合補(bǔ)體和活化補(bǔ)體后可通過(guò)補(bǔ)體活化片段發(fā)揮調(diào)理吞噬的作用的能力均較igg強(qiáng)。因此，血清中檢出特異性igm抗體水平標(biāo)志著機(jī)體近期發(fā)生了感染，對(duì)某些傳染病的早期診斷具有較高的臨床價(jià)值。隨著科技的發(fā)展，流通方式日趨走向多元化和頻繁化，造成多種傳染病跨地區(qū)、跨國(guó)界傳播，對(duì)衛(wèi)生安全帶來(lái)了更大的危害。因此，對(duì)某些傳染病，尤其是潛伏期較長(zhǎng)的傳染病而言，早期診斷具有重要的防治價(jià)值。重鏈μ鏈?zhǔn)莍gm分子所特有，抗igmμ鏈單克隆抗體具有高效、特異性結(jié)合igm的特性，在體外診斷試劑領(lǐng)域具有非常廣泛的應(yīng)用。市場(chǎng)上不易購(gòu)買(mǎi)到不同物種的igmμ鏈。在制備其單克隆抗體時(shí)，一般采用sds-page切膠獲取免疫用μ鏈，方法繁瑣，回收率不高。本實(shí)驗(yàn)利用原核表達(dá)系統(tǒng)大量表達(dá)制備羊igmμ鏈，以鎳瓊脂糖親和層析和陽(yáng)離子交換層析純化的重組蛋白免疫動(dòng)物，獲得分泌抗羊igmμ鏈單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一是提供一株能夠穩(wěn)定分泌抗羊型igmμ鏈單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明的目的之二是提供由上述雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的抗羊igmμ鏈的單克隆抗體。本發(fā)明的目的之三是提供所述雜交瘤細(xì)胞株以及單克隆抗體在制備診斷或檢測(cè)羊igm免疫球蛋白及其抗體試劑中的應(yīng)用。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：本發(fā)明以分泌型igm蛋白為靶蛋白，克隆獲得igmμ鏈基因的完整開(kāi)放閱讀框，并將其亞克隆至原核表達(dá)載體，利用鎳柱純化重組蛋白，并對(duì)6-8周齡的雌性balb/c小鼠進(jìn)行免疫，當(dāng)抗體滴度在1∶10000以上時(shí)，對(duì)免疫小鼠脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，篩選獲得分泌抗羊igmμ鏈的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；向6-8周齡的經(jīng)產(chǎn)balb/c小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，注射7天左右收集腹水，proteing/a瓊脂糖珠純化腹水，獲得純度較高的抗羊igmμ鏈的單克隆抗體。本發(fā)明的一株能夠穩(wěn)定分泌抗羊型igmμ鏈單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為5d1，分類(lèi)命名為小鼠骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，其菌種保藏編號(hào)為:cgmccno.11283，保藏時(shí)間為2015年10月12日。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了由所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體(5d1)。經(jīng)mousemonoclonalantibodyisotypingkit檢測(cè)，將5d1單克隆抗體亞型確定為igg1，輕鏈類(lèi)型為κ，間接elisa檢測(cè)方法測(cè)定效價(jià)，可知：5d1株單抗的腹水效價(jià)為2.56×105，且具有耐熱、耐酸、耐堿，穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，因此可用于羊igm免疫球蛋白及其抗體的直接或間接檢測(cè)。本發(fā)明的提出為羊igm免疫球蛋白及其抗體的檢測(cè)提供了一種有效的技術(shù)手段，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)多種羊病的早期篩查與監(jiān)測(cè)，具有廣泛的應(yīng)用范圍和社會(huì)需求。附圖說(shuō)明圖1為bsa標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2為單克隆抗體亞型鑒定；圖3為單克隆抗體熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果；圖4為單克隆抗體酸穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果；圖5為單克隆抗體堿穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果；圖6為3株單抗飽和度曲線。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。實(shí)施例1羊igm重組蛋白的制備一、羊igm重組蛋白(th蛋白)的表達(dá)1、引物設(shè)計(jì)參照genbank分泌型igm前體序列(登錄號(hào):x59994.1)，設(shè)計(jì)合成游引物。上游引物：5’-gaattcatgcaggtgcagctgcaggagt-3’下游引物：5’-ctcgagtcagtagcaggtgctggccgt-3’其中，下劃?rùn)M線部分分別為ecori和xhoi酶切位點(diǎn)。2、rt-pcr擴(kuò)增(1)分離淋巴細(xì)胞：無(wú)菌采取健康山羊抗凝血10ml與等量的pbs混合稀釋,取5ml稀釋的外周血緩慢加入等量淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心,水平離心機(jī)2300r/min室溫離心15min；吸取中間的白色淋巴細(xì)胞層,加入pbs洗滌,以2000r/min離心15min,去上清,沉淀物再加入pbs重復(fù)洗滌1次；收集淋巴細(xì)胞用含10％胎牛血清rpmi1640(含100mg/l青霉素和100mg/l的鏈霉素)培養(yǎng)液稀釋,并取10μl細(xì)胞液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),之后將細(xì)胞液稀釋至1×106個(gè)/ml。(2)提取淋巴細(xì)胞rna；(3)rt-pcr擴(kuò)增①反轉(zhuǎn)錄(rt):10μltotalrna懸液和1μloligod(t)引物，混勻，70℃預(yù)變性5min后立即冰浴5min；然后加入4μl5×cdnasynthesisbuffer、1μldntpmixture(2.5mm)、0.5μlrnasin(50u/μl)、1μl反轉(zhuǎn)錄酶，depc水補(bǔ)加至20μl，混勻，瞬時(shí)離心后42℃水浴60min，75℃5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。②pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5μl、10×pcrbuffer5μl、dntpmixture(2.5mm)5μl、上、下游引物(50pmol/μl)各1.5μl、mgcl2(25mm)5μl、taq酶1μl，無(wú)核酶水補(bǔ)加至50μl，混勻。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)熱變性5min；94℃，60s；53℃，60s；72℃，100s，35個(gè)循環(huán)，72℃，10min。(4)將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在1785bp處出現(xiàn)一條特異電泳條帶，與預(yù)期的大小一致。(5)將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到原核表達(dá)載體pet-30a(+)中，取用ecori和xhoi雙酶切的pet-30a(+)載體2μl(50μg/μl)與上述rt-pcr片段8μl混合后，加入2×rapidligasebuffer5μl，t4dna連接酶1μl(3u/μl)，混勻后置16℃連接過(guò)夜，得到重組質(zhì)粒pet-30a(+)-igm。(6)將構(gòu)建的重組表達(dá)載體pet-30a(+)-igm經(jīng)pcr、雙酶切(ecori和xhoi)鑒定均為陽(yáng)性；陽(yáng)性菌液送往上海生工生物工程有限公司測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果表明，igm成功插入到pet-30a(+)表達(dá)載體中且保持正確的閱讀框，其核苷酸序列如seqidno.1所示，所對(duì)應(yīng)的重組蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。(7)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至e.colibl21感受態(tài)細(xì)胞，用含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基篩選；用iptg誘導(dǎo)表達(dá)，并優(yōu)化、確定蛋白的最佳表達(dá)條件?；叶葤呙璺治霭l(fā)現(xiàn)，經(jīng)iptg誘導(dǎo)的重組基因工程菌獲得表達(dá)，產(chǎn)生分子量大小約為66kda的特異性蛋白條帶，重組igm蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。通過(guò)改變誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和iptg濃度來(lái)增加重組igm蛋白的表達(dá)量，sds-page分析顯示，按1％比例接入二級(jí)種子液，37℃振蕩培養(yǎng)od值達(dá)到0.6左右時(shí)，以iptg終濃度為0.5mmol/l于15℃誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜的表達(dá)量最高。所以最終選擇誘導(dǎo)條件為15℃誘導(dǎo)過(guò)夜，iptg濃度為0.5mmol/l。二、igm重組蛋白的純化1.超聲破碎菌體(1)將收集的菌體用上清buffer(50mmtris，300mmnacl，0.1％tritonx-100，ph8.0，)混勻，冰浴中超聲破碎菌體，功率500w，20min(超聲3s，暫停5s為一個(gè)循環(huán))。(2)超聲完畢，12000rpm，4℃，離心20min，保留沉淀。(3)沉淀用包涵體洗液(1m脲，50mmtris，5mmdtt，1％tritonx-100，ph8.0)洗滌，冰浴中超聲破碎，功率500w，20min(超聲3s，暫停5s為一個(gè)循環(huán))。(4)超聲完畢，12000rpm，4℃，離心20min，保留沉淀。(5)沉淀用buffer(7m鹽酸胍，50mmtris，0.1％tritonx-100，ph8.0)溶解，冰浴中超聲破碎菌體，功率500w，20min(超聲3s，暫停5s為一個(gè)循環(huán))。2.鎳瓊脂糖親和層析(1)取5mlni-ida，用10倍柱床體積的bindingbuffer(7m鹽酸胍，50mmtris，ph8.0)清洗平衡柱子，流速5ml/min。(2)樣品(溶解液上清)上柱，流速為2ml/min，收集穿透液。(3)用10倍柱床體積的bindingbuffer清洗柱子，流速10ml/min。(4)用含不同濃度咪唑的washbuffer洗脫，流速5ml/min，收集洗脫液。注：washbuffer為washbuffer1(10mmimidazole，8m脲，50mmtris，300mmnacl，ph8.0)以及washbuffer2(20mmimidazole，8m脲，50mmtris，300mmnacl，ph8.0)。(5)elutionbuffer(500mmimidazole，8m脲，50mmtris，300mmnacl，ph8.0)洗脫，流速2ml/min，收集洗脫液。(6)將樣品透析到含有4m脲，10mmmes，ph6.0的透析緩沖液中，準(zhǔn)備進(jìn)行離子交換層析。3.陽(yáng)離子交換層析(1)取10mlspsepharosetmff填料，用10倍柱床體積的bindingbuffer(4m脲，10mmmes，ph＝6.0)清洗平衡柱子，流速5ml/min。(2)樣品上柱，流速為3ml/min，收集穿透液。(3)用10倍柱床體積的washbuffer(4m脲，10mmmes，50/100mmnacl，ph＝6.0)清洗柱子，流速2ml/min。(4)eultionbuffer(4m脲，10mmmes，250/500mmnacl，ph＝6.0)洗脫,流速1ml/min，收集洗脫液。(5)將高純度的洗脫液組分透析到透析液中(25mmtris，150mmnacl，0.2％sklph＝8.0)，sds-page電泳檢測(cè)。4.蛋白濃度測(cè)定將純化的重組igm蛋白進(jìn)行sds-page，染色、脫色后灰度掃描分析純化產(chǎn)物。以牛血清白蛋白(bsa)作為標(biāo)準(zhǔn)品，用sk3071非干擾型蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，結(jié)果如表1所示。以含不同量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(0，8，16，24、40和50l)吸收值的平均值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的bsa蛋白量為橫坐標(biāo)，繪制bsa標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1所示)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和待定量的蛋白質(zhì)樣品溶液的480nm吸收值的平均值，計(jì)算出所對(duì)應(yīng)的稀釋蛋白質(zhì)樣品溶液的濃度，進(jìn)而得出純化蛋白質(zhì)樣品溶液的原始濃度為0.41mg/ml。表1不同稀釋度蛋白o(hù)d值測(cè)試1測(cè)試2平均值bsaμg/μl0.9340.9490.941500.8820.8860.88480.8290.8350.832160.7730.7810.777240.6750.6760.6755400.6370.6360.636550a140310.8560.419445333實(shí)施例2雜交瘤細(xì)胞系的構(gòu)建1材料1.1抗原、細(xì)胞株、動(dòng)物抗原：實(shí)施例1制備的igm重組蛋白；小鼠骨髓瘤細(xì)胞(sp2/0)細(xì)胞：由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所保存；balb/c小鼠：由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物廠提供。1.2主要試劑rpmi1640培養(yǎng)液、胎牛血清(fbs)購(gòu)自gibco公司；8-氮鳥(niǎo)嘌呤、ht、hat、peg、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和封閉液(blockingbuffer)均購(gòu)自sigma公司；96孔細(xì)胞板和酶標(biāo)板均購(gòu)自costar公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記驢抗鼠igg購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；酶標(biāo)底物tmb購(gòu)自promega公司；吐溫-20購(gòu)自solarbio公司；細(xì)胞凍存管購(gòu)自corning公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.3溶液及培養(yǎng)基50％peg2000溶液：稱(chēng)取10gpeg2000，10磅高壓25min，冷卻至50～60℃，加10ml不完全培養(yǎng)基rpmi-1640，混勻，調(diào)ph至7.0～7.4，分裝于高壓過(guò)的2mleppendorf管，每管1ml，4℃保存?zhèn)溆?。a貯存液(氨基蝶呤液)：稱(chēng)取3.5mgaminopterin，加高壓過(guò)的三蒸水180ml，輕輕震蕩至完全溶解，最后加水至200ml，0.22μm濾器過(guò)濾，分裝于高壓過(guò)的2mleppendorf管，每管1ml，-20℃保存?zhèn)溆谩４吸S嘌呤和胸腺嘧啶核苷(ht)貯存液(100×，h：10-4mol/l；t：1.6×10-3mol/l)：稱(chēng)取0.054ghypoxanthine，0.016gaminopterin，加高壓過(guò)的三蒸水40ml，待溶解后0.22μm濾器過(guò)濾，分裝于高壓過(guò)的2mleppendorf管，每管1ml，-20℃保存?zhèn)溆谩?-氮鳥(niǎo)嘌呤貯存液：稱(chēng)取20mg8-氮鳥(niǎo)嘌呤，加10ml水和約30μl氨水，待溶解后，0.22μm濾器過(guò)濾，分裝于高壓過(guò)的2mleppendorf管，每管1ml，-20℃保存?zhèn)溆?。hat選擇培養(yǎng)液：78％rpmi-1640培養(yǎng)液，l％a儲(chǔ)存液，l％ht儲(chǔ)存液，20％胎牛血清，混合均勻，4℃保存?zhèn)溆?。ht培養(yǎng)液：79％rpmi-1640培養(yǎng)液，l％ht儲(chǔ)存液，20％胎牛血清，混合均勻，4℃保存?zhèn)溆?。?xì)胞凍存液：70％rpmi-1640培養(yǎng)液，20％小牛血清，10％二甲亞砜(dmso)，4℃保存，混合均勻，4℃保存?zhèn)溆?。包被?0.05mol/l碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，ph9.6)：nahco32.9g，na2co31.5g，加雙蒸水定容至1000ml，調(diào)ph至9.6，4℃保存?zhèn)溆?。pbs：na2hpo4·12h2o2.9g、kcl0.2g、kh2po40.2g、nacl8g，溶解于950ml去離子水中，用naoh調(diào)ph值至7.2后用容量瓶定量至1000mlpbst溶液：在pbs溶液中加入再加0.05％tween-20，搖勻即可使用。酶標(biāo)封閉液(1×blockingbuffer)：90ml滅菌去離子水中加入10ml10×blockingbuffer，混勻后保存于4℃?zhèn)溆?。酶?biāo)終止液(2mol/lh2so4溶液)：雙蒸水89ml，濃硫酸11ml，將硫酸緩慢滴加至雙蒸水中并不斷攪拌。7.5％碳酸氫鈉溶液：稱(chēng)取7.5g碳酸氫鈉粉末，加入90ml蒸餾水充分溶解，再定容至100ml，用0.22μm濾器過(guò)濾除菌，分裝至高壓滅菌的2ml離心管內(nèi)，用封口膜封口保存于4℃?zhèn)溆谩?0000u/ml雙抗儲(chǔ)備溶液：在購(gòu)買(mǎi)的80萬(wàn)單位青霉素瓶中加入高壓過(guò)的三蒸水4ml，100萬(wàn)單位鏈霉素瓶中加入高壓過(guò)的三蒸水5ml，輕輕搖晃直至瓶?jī)?nèi)粉末完全溶解，分別取4ml加入32ml高壓過(guò)的三蒸水中，用0.22μm濾器過(guò)濾除菌，分裝至高壓滅菌的2ml離心管內(nèi)，用封口膜封口后保存于-20℃?zhèn)溆谩?實(shí)驗(yàn)方法2.1動(dòng)物免疫及小鼠效價(jià)測(cè)定2.1.1動(dòng)物免疫采用常規(guī)免疫方法對(duì)8—10周齡balb/c小鼠進(jìn)行免疫。初次免疫是用抗原與弗氏完全佐劑等體積混合，充分?jǐn)嚢杌靹?，采用背部多點(diǎn)注射免疫(100μg/只)；后期免疫均用抗原與弗氏不完全佐劑等體積混合，充分?jǐn)嚢杌靹颍扛魞芍苊庖咭淮?；待小鼠效價(jià)達(dá)到融合要求，在準(zhǔn)備細(xì)胞融合前3天將小鼠腹腔再?zèng)_擊免疫一次(50μg/只)。2.1.2小鼠效價(jià)測(cè)定使用純化的igm重組蛋白和間接elisa方法檢測(cè)免疫小鼠血清的抗體效價(jià)，選取免疫效價(jià)檢測(cè)值最高的小鼠追加免疫一次，三天后取該鼠的脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合。2.2雜交瘤細(xì)胞株的建立2.2.1骨髓瘤細(xì)胞(sp2/0)的準(zhǔn)備于融合前兩周復(fù)蘇sp2/0，置于5％co2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程在培養(yǎng)液中加入8-氮鳥(niǎo)嘌吟，連續(xù)處理3次，使sp2/0細(xì)胞對(duì)hat培養(yǎng)液更加敏感。融合前一天傳代一次，使融合當(dāng)天的骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。2.2.2飼養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備細(xì)胞融合當(dāng)天，取8～10周齡健康balb/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至l～5×105個(gè)/ml，按100μl/孔轉(zhuǎn)入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。2.2.3脾細(xì)胞的準(zhǔn)備取三天前加強(qiáng)免疫的小鼠，無(wú)菌摘取脾臟，收集脾細(xì)胞懸液，脾細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。2.2.4細(xì)胞的融合將sp2/0細(xì)胞和免疫小鼠脾細(xì)胞懸液混勻，使用聚乙二醇融合細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于5％co2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.2.5雜交瘤細(xì)胞的篩選融合后注意觀察雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，待細(xì)胞長(zhǎng)到孔底的1/4～1/3時(shí)吸出上清進(jìn)行間接elisa檢測(cè)。以p/n≥2.5作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，用未免疫小鼠血清作陰性對(duì)照，用抗體稀釋液做空白對(duì)照。對(duì)檢測(cè)為陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。2.2.6雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)克隆化培養(yǎng)采用有限稀釋法，待細(xì)胞長(zhǎng)到孔底的l/4～1/3時(shí)，對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行間接elisa檢測(cè)。選擇克隆數(shù)少、od450nm值高的陽(yáng)性孔，將其再次克隆。經(jīng)3～4次克隆化操作，直至所有克隆化細(xì)胞孔檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)100％時(shí)，即可確定獲得分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株，及時(shí)擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1免疫balb/c小鼠抗體效價(jià)檢測(cè)第五次免疫后一周左右，應(yīng)用間接elisa方法對(duì)免疫小鼠進(jìn)行抗體效價(jià)的檢測(cè)，結(jié)果顯示1#小鼠血清效價(jià)最高，大約為1︰256k，可以滿(mǎn)足細(xì)胞融合的要求(見(jiàn)表2)，因此取1#小鼠進(jìn)行沖擊免疫，并于三天后進(jìn)行細(xì)胞融合。表2用于細(xì)胞融合的免疫balb/c小鼠血清效價(jià)3.2單克隆細(xì)胞株的篩選及雜交瘤細(xì)胞株的建立免疫的balb/c小鼠脾細(xì)胞和sp2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合后，取細(xì)胞上清經(jīng)間接elisa方法測(cè)定od450nm值，選中其中陽(yáng)性值最高的3株經(jīng)亞克隆篩選，共獲得3株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2d11、3e4和5d1。3.3單克隆細(xì)胞上清效價(jià)檢測(cè)將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行系列稀釋?zhuān)缓笥瞄g接elisa法測(cè)定od450nm值；同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性、陰性血清對(duì)照。以p/n比值≥2.5時(shí)單克隆抗體的最大稀釋度即為其抗體效價(jià)，3株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的上清效價(jià)見(jiàn)表3。表3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞上清效價(jià)3.4細(xì)胞凍存將獲得的3株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株轉(zhuǎn)至細(xì)胞瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞形態(tài)良好、生長(zhǎng)旺盛時(shí)吹打混勻細(xì)胞，1000r/min離心10min收集細(xì)胞，用1ml細(xì)胞凍存液將細(xì)胞懸起，加入到細(xì)胞凍存管中，同時(shí)做好標(biāo)記，將凍存管先放置于4℃30min，然后移至-20℃冷凍30min，再移至-70℃低溫冰箱中過(guò)夜，最后投入液氮容器中，并做好記錄。實(shí)施例3單克隆抗體的制備1材料1.1細(xì)胞株、動(dòng)物細(xì)胞株：實(shí)施例2制備的雜交瘤細(xì)胞株2d11、3e4和5d1；balb/c小鼠：由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物廠提供。1.2主要試劑rpmi1640培養(yǎng)液、胎牛血清(fbs)購(gòu)自gibco公司；封閉液(blockingbuffer)均購(gòu)自sigma公司；96孔酶標(biāo)板購(gòu)自costar公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記驢抗鼠igg購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；酶標(biāo)底物tmb購(gòu)自promega公司；吐溫-20購(gòu)自solarbio公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.3溶液及培養(yǎng)基包被液(0.05mol/l碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，ph9.6)：nahco32.9g，na2co31.5g，加雙蒸水定容至1000m1，調(diào)ph至9.6，4℃保存?zhèn)溆?。pbs：na2hpo4·12h2o2.9g、kcl0.2g、kh2po40.2g、nacl8g，溶解于950ml去離子水中，用naoh調(diào)ph值至7.2后用容量瓶定量至1000mlpbst溶液：在pbs溶液中加入再加0.05％tween-20，搖勻即可使用。酶標(biāo)封閉液(1×blockingbuffer)：90ml滅菌去離子水中加入10ml10×blockingbuffer，混勻后保存于4℃?zhèn)溆?。酶?biāo)終止液(2mol/lh2so4溶液)：雙蒸水89ml，濃硫酸11ml，將硫酸緩慢滴加至雙蒸水中并不斷攪拌。7.5％碳酸氫鈉溶液：稱(chēng)取7.5g碳酸氫鈉粉末，加入90ml蒸餾水充分溶解，再定容至100ml，用0.22μm濾器過(guò)濾除菌，分裝至高壓滅菌的2ml離心管內(nèi)，用封口膜封口保存于4℃?zhèn)溆谩?0000u/ml雙抗儲(chǔ)備溶液：在購(gòu)買(mǎi)的80萬(wàn)單位青霉素瓶中加入高壓過(guò)的三蒸水4ml，100萬(wàn)單位鏈霉素瓶中加入高壓過(guò)的三蒸水5ml，輕輕搖晃直至瓶?jī)?nèi)粉末完全溶解，分別取4ml加入32ml高壓過(guò)的三蒸水中，用0.22μm濾器過(guò)濾除菌，分裝至高壓滅菌的2ml離心管內(nèi)，用封口膜封口后保存于-20℃?zhèn)溆谩?實(shí)驗(yàn)方法2.1單克隆抗體的制備給每只8-10周齡雌性balb/c小鼠腹腔注射0.2ml液體石蠟。在此期間，對(duì)陽(yáng)性單克隆雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。一周后，將擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞從細(xì)胞瓶中吹下，用高壓過(guò)的pbs重懸，洗滌兩次遍，1000r/min離心10min，苔盼蘭染色計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)至1～2×106個(gè)/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml細(xì)胞懸液。接種細(xì)胞后每天觀察小鼠腹部，待小鼠腹部明顯膨大，行動(dòng)困難時(shí)，將小鼠頸椎脫臼處死，用無(wú)菌注射器從小鼠腹部吸出暗紅色的液體，3000r/min離心20min，取清亮的上清分裝、標(biāo)記，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2單克隆抗體特性的鑒定2.2.1抗體亞類(lèi)的測(cè)定吸取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清200μl，用isostripmousemonoclonalantibodyisotypingkit抗體亞類(lèi)試劑盒對(duì)單抗進(jìn)行亞型鑒定。取雜交瘤細(xì)胞上清20μl，加入ph7.2的pbs180μl做1:10稀釋?zhuān)蝗≡撓♂屢?50μl加入含有蘭色粉末的實(shí)驗(yàn)管中，輕輕震蕩混勻，至蘭色粉末完全融化；將isotrip膠體金試紙條插入管底，5～10min內(nèi)觀察結(jié)果。2.2.2腹水效價(jià)的測(cè)定為測(cè)定腹水中抗igm單克隆抗體效價(jià)，用純化的igm重組蛋白作為包被抗原，將小鼠腹水作2倍梯度稀釋?zhuān)瑥?:1000～1:256000倍，用間接elisa方法檢測(cè)腹水效價(jià)。同時(shí)用sp2/0細(xì)胞上清、正常小鼠腹水作陰性對(duì)照，用抗體稀釋液做空白對(duì)照，以重組蛋白免疫小鼠血清做陽(yáng)性對(duì)照，具體判定標(biāo)準(zhǔn)為：p/n>2.0時(shí)的腹水最大稀釋倍數(shù)為腹水的elisa效價(jià)。2.2.3單克隆抗體對(duì)熱穩(wěn)定性試驗(yàn)取粗純的腹水用滅菌的pbs1:1000稀釋?zhuān)?6℃水浴中4h、8h、12h、24h、36h和48h，然后用間接elisa檢測(cè)其od450值的變化，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制穩(wěn)定性變化曲線。2.2.4單克隆抗體對(duì)酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn)酸穩(wěn)定性試驗(yàn)：將腹水用ph2.2的鹽酸溶液1:10倍稀釋?zhuān)?℃保存4h、8h、12h、24h、36h和48h，再用ph7.2的pbs稀釋到1:1000，elisa檢測(cè)其od450值變化，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制穩(wěn)定性變化曲線。堿穩(wěn)定性試驗(yàn)：用包被液(ph9.6的碳酸鹽緩沖液)按上述方法進(jìn)行堿穩(wěn)定性試驗(yàn)。2.2.5單克隆抗體識(shí)別抗原表位的測(cè)定用間接elisa相加法檢測(cè)3株單克隆抗體的抗原表位。用純化的igm重組蛋白包被酶標(biāo)板，先用間接elisa法測(cè)定腹水中mcab與包被抗原反應(yīng)達(dá)到飽和時(shí)的稀釋度。然后進(jìn)行間接elisa相加實(shí)驗(yàn)，用上述濃度的抗原包被酶標(biāo)板，先在酶標(biāo)板上橫向加入3株單抗腹水，反應(yīng)1h后，再縱向依次加入上述腹水，反應(yīng)1h后顯色測(cè)定od450nm值。按照如下公式分別計(jì)算2株單抗疊加后的ai值：ai＝(a1+2-a1)/a2×100％，其中a1+2表示2株單抗疊加后的od450nm值，a1表示表示第1株單抗的od450nm值，a2表示第2株單抗的od450nm值；每組重復(fù)試驗(yàn)3次，取其平均值。當(dāng)ai＞10％即可認(rèn)為兩種單克隆抗體識(shí)別不同的抗原表位；若ai≤10％，表明這2株單抗所識(shí)別的抗原位點(diǎn)相近或相同。2.3本發(fā)明中保藏雜交瘤細(xì)胞株的確定根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定分泌抗羊igmμ鏈單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞保藏株，并將該細(xì)胞株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1單抗的亞型鑒定經(jīng)mousemonoclonalantibodyisotypingkit檢測(cè)后，2d11、3e4和5d1單克隆抗體亞型均為igg1，輕鏈類(lèi)型為κ(見(jiàn)圖2)。3.2腹水效價(jià)的測(cè)定將3株雜交瘤細(xì)胞株的腹水梯度稀釋后用間接elisa檢測(cè)方法測(cè)定效價(jià)，從表4可知：2d11株單抗的腹水效價(jià)為3.2×104，3e4株單抗的腹水效價(jià)為6.4×104，5d1株單抗的腹水效價(jià)為2.56×105。表4單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞腹水抗體效價(jià)制備腹水的抗體的效價(jià)≥32k，滿(mǎn)足檢測(cè)要求。3.3單抗腹水穩(wěn)定性試驗(yàn)(1)單抗腹水熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)3株雜交瘤細(xì)胞株的腹水經(jīng)熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制其效價(jià)熱消減曲線，見(jiàn)圖3。表5單克隆抗體熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果*陽(yáng)性對(duì)照均為未處理的腹水(1:1000)(2)單抗腹水酸穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)3株雜交瘤細(xì)胞株的腹水經(jīng)酸穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分別繪制3株單抗效價(jià)酸消減曲線，見(jiàn)圖4。表6單克隆抗體酸穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果*陽(yáng)性對(duì)照均為未處理的腹水(1:1000)(3)單抗腹水堿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)3株雜交瘤細(xì)胞株的腹水經(jīng)堿穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分別繪制3株單抗效價(jià)堿消減曲線，見(jiàn)圖5。表7單克隆抗體堿穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果*陽(yáng)性對(duì)照均為未處理的腹水(1:1000)由單抗腹水穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果確定，3株細(xì)胞制備的腹水抗體耐熱、耐酸、耐堿，穩(wěn)定性好，可用于診斷。3.4單抗識(shí)別抗原表位分析經(jīng)測(cè)定腹水中的mcab與包被抗原反應(yīng)的飽和濃度。根據(jù)mcab飽和濃度用間接elisa法相加實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3株單抗識(shí)別抗原表位分析，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表8、圖6、表9。根據(jù)表中數(shù)據(jù)計(jì)算：ai＝(a1+2-a1)/a2×100％。式中：a1為mcab1的od450值；a2為mcab2的od450值；a1+2為mcab1疊加mcab2的od450值。ai≤10％表明兩株單抗針對(duì)的抗原位點(diǎn)相近或相同，ai＞10％表明兩株針對(duì)的抗原位點(diǎn)不同點(diǎn)，ai值越大，抗原位點(diǎn)重疊的可能性越小。計(jì)算結(jié)果顯示，3株單克隆抗體所識(shí)別的抗原表位均相同，ai值均小于10％，其中2d11株識(shí)別的抗原表位包含于3e4株的識(shí)別表位中。表8單抗腹水飽和度實(shí)驗(yàn)表9抗原表位分析檢測(cè)結(jié)果3.5本發(fā)明中保藏雜交瘤細(xì)胞株的確定根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定5d1為本發(fā)明所述的能夠穩(wěn)定分泌抗羊源igmμ鏈單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并將該細(xì)胞株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmccno.11283。最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12