本發(fā)明涉及細(xì)胞分裂素ortho-topolinriboside(otr)作為一種去甲基化試劑對人白血病細(xì)胞株的抗腫瘤作用，屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

白血病是造血組織的惡性疾病，又稱“血癌”。造血細(xì)胞的某一系列、主要是某一白細(xì)胞系列的前體細(xì)胞失去分化成熟能力，在骨髓中和其他造血組織中呈惡性克隆性增生、積聚，并侵犯肝、脾、淋巴結(jié)，最終浸潤破壞全身組織、器官，使正常造血功能受到抑制。白血病與實(shí)體腫瘤不同，不是生長在局部的贅生物，而是全身散播，可能侵犯各系統(tǒng)、器官和組織的惡性血液病。臨床表現(xiàn)為貧血、出血、感染及各器官浸潤癥狀。根據(jù)國外統(tǒng)計(jì)，白血病約占腫瘤總發(fā)病率的3％左右，是兒童和青年中最常見的一種惡性腫瘤。白血病的發(fā)病率在世界各國中，歐洲和北美發(fā)病率最高，其死亡率為3.2-7.4/10萬人口。亞洲和南美洲發(fā)病率較低，死亡率為2.8-4.5/10萬人口。傳統(tǒng)的治療以聯(lián)合化療為主，而患者的完全緩解率和長期無病生存率均較低，然而常用的化療藥物如阿糖胞苷(ara-c)具有骨髓抑制，神經(jīng)毒性等副作用。因此，尋找有效提高治療效率，毒副作用小的天然藥物來治療白血病是十分必要的。

白血病的發(fā)生發(fā)展是多因素參與、多步驟的復(fù)雜過程,涉及遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變。近年來的研究發(fā)現(xiàn),dna甲基化是人類白血病中普遍存在的現(xiàn)象,與其發(fā)病密切相關(guān)。啟動子區(qū)cpg島高甲基化(hypermethylation)是抑瘤基因、dna修復(fù)基因、促凋亡基因失活的主要方式之一。甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑如5-雜氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycitydine,5-aza-2dc)能使甲基化沉默的基因重新表達(dá),恢復(fù)其正常功能,在白血病治療中具有良好的應(yīng)用前景。國外已有應(yīng)用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑如阿扎胞苷、地西他濱、普魯卡因胺等治療急性髓系白血病(acutemyelogenousleukemia,aml)、骨髓增生異常綜合征(myelodysplasticsyndrome,mds)和慢性粒細(xì)胞白血病(chronicmyelogenousleukemia,cml)的臨床實(shí)驗(yàn)報(bào)道。但是這些臨床試驗(yàn)階段的去甲基化試劑具有胃腸反應(yīng)、骨髓移植、肝損害、神經(jīng)毒性和肺功能衰竭等的較大的毒副作用，限制了臨床應(yīng)用。因此尋找更有效且毒副作用小的天然來源的去甲基化試劑顯得尤為重要。

n6-2-芐胺羥基-9-呋喃核糖基嘌呤(ortho-topolinriboside，otr)是一種存在于黎明時楊樹葉子內(nèi)合成的天然核苷類芳香族細(xì)胞分裂素。2010年根據(jù)美國國立癌癥研究中心(nic)測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，otr對人的9大瘤系60種腫瘤細(xì)胞系(nic60)具有非常顯著的體外增殖抑制活性，其中對白血病細(xì)胞株的藥物敏感性最強(qiáng)(ic50≦1.7μm)。并且通過藥物體內(nèi)篩選模型-中空纖維法發(fā)現(xiàn)otr在體內(nèi)對一些腫瘤模型小鼠無明顯的急性毒性反應(yīng)。上述結(jié)果充分表明otr作為一種核苷類細(xì)胞分裂素具有很強(qiáng)的抗腫瘤臨床應(yīng)用潛力和臨床藥用研發(fā)價值。

人類dna甲基化的修飾主要通過dna甲基轉(zhuǎn)移酶1(dnmt1)和dna甲基轉(zhuǎn)移酶3(dnmt3)完成。其中，dnmt1含量最多，也是調(diào)節(jié)cpg島dna甲基化狀態(tài)最重要的酶。但是目前關(guān)于otr是否通過對dnmt1來調(diào)節(jié)去甲基化作用并發(fā)揮抗腫瘤作用的研究尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了otr在人白血病細(xì)胞株中抗腫瘤的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種去甲基化試劑在人白血病細(xì)胞中的應(yīng)用，步驟如下：

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：將人白血病細(xì)胞株thp-1懸浮于含有滅活胎牛血清的無菌rpmi1640培養(yǎng)液中，置于濃度為5％co2、相對濕度為90％、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長至培養(yǎng)瓶底面積的70％～80％傳代1次；

(2)藥物配制：ara-c用無菌rpmi1640培養(yǎng)基溶解，otr用0.1％dmso溶解，繼續(xù)用無菌rpmi1640培養(yǎng)基將溶解好的ara-c和otr稀釋至濃度為0.1μm-30μm，過濾除菌，室溫保存；

(3)處理細(xì)胞：將處于對數(shù)生長期的5×10³～1×10⁴個細(xì)胞接種于每孔含有100μlrpmi1640培養(yǎng)液的96孔板中，設(shè)置10組實(shí)驗(yàn)，每組4個復(fù)孔，第1組：空白對照組；第2組：0.1％dmso組；第3組：0.3μμotr組；第4組：1.5μμotr組；第5組：15μμotr組；第6組：30μμotr組；第7組：0.3μμara-c組；第8組：1.5μμara-c組；第9組：15μμara-c組；第10組：0.3μμara-c組，分別向各組中加入對應(yīng)的藥物，置于濃度為5％co2、相對濕度為90％、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中孵育3-5天，細(xì)胞計(jì)數(shù)；

(4)檢測細(xì)胞增殖抑制率：將處于對數(shù)生長期的5×10³～1×10⁴個細(xì)胞接種于每孔含有100μlrpmi1640培養(yǎng)液的96孔板中，依據(jù)步驟(3)處理細(xì)胞的方法再一次處理細(xì)胞，置于濃度為5％co2、相對濕度為90％、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中孵育3-5天，各4個復(fù)孔；采用cck-8試劑盒進(jìn)行檢測，每孔細(xì)胞懸液中加10μlcck-8溶液，置于37℃，co2培養(yǎng)箱中孵育2h，測定450nm處各組細(xì)胞的吸光度，記錄數(shù)據(jù)；

(5)檢測細(xì)胞亞倍體峰：將生長狀態(tài)活躍的thp-1細(xì)胞用otr處理48h后，用流式管分裝成三個樣品，按照annexinv-fitc凋亡檢測試劑盒說明書配制染色緩沖液，每個樣品加入500μl染色緩沖液37℃避光孵育30min，最后用pbs洗一次；300目篩網(wǎng)過濾后用bdfacscalibur流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，計(jì)算細(xì)胞凋亡率；

(6)檢測otr對dnmt1酶活性的影響：提取步驟(3)各組處理后的細(xì)胞核蛋白，按照epiquickdna甲基轉(zhuǎn)移酶活性/抑制分析試劑盒用酶標(biāo)儀在450nm讀取吸光值并計(jì)算dnmt活性；dnmt1進(jìn)行體外表達(dá)克隆和純化，在450nm下讀取吸光值檢測otr對dnmt1的抑制活性；

(7)生物信息學(xué)分子對接實(shí)驗(yàn)：采用生物信息學(xué)分子對接模擬方法，將甲基轉(zhuǎn)移酶(dnmt)的天然底物s-腺苷高半胱氨酸(sah)與dnmt1模擬對接空間作用力以及otr與dnmt1模擬對接空間作用力。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的數(shù)據(jù)建立在otr對人的9大瘤系60種腫瘤細(xì)胞系具有非常顯著的體外增殖抑制活性，其中對白血病細(xì)胞株的藥物敏感性最強(qiáng)的基礎(chǔ)之上。

附圖說明

圖1為細(xì)胞分裂素otr對人白血病細(xì)胞增殖的抑制作用。

圖2為不同濃度otr處理thp-1細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目變化。

圖3為otr對人白血病細(xì)胞凋亡的作用。3(a)對照組。3(b)1.5μμotr處理48h后thp-1細(xì)胞的細(xì)胞周期。

圖4為otr對dnmt1酶活性抑制作用。4(a)不同濃度otr作用白血病細(xì)胞株48h后總dnmt的活性變化。4(b)不同濃度otr體外對dnmt1克隆酶活性的影響，1：dnmt1；2：0.1μμotr；3：0.1μμotr+dnmt1；4：0.5μμotr+dnmt1；5：1μμotr+dnmt1；6：5μμotr+dnmt1；7：10μμotr+dnmt1。

圖5為天然配體sah與dnmt1模擬對接空間作用力示意圖及排名前十的libdockscore值。

圖6為otr與dnmt1模擬對接空間作用力示意圖及排名前十的libdockscore值。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和技術(shù)方案，進(jìn)一步說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式。

本發(fā)明使用的細(xì)胞、試劑盒以及試劑：人白血病thp-1細(xì)胞株，胎牛血清、雙抗(青霉素/鏈霉素)，rpmi1640培養(yǎng)基，cck-8試劑盒，細(xì)胞凋亡染色試劑盒，ara-c和otr。

實(shí)施例1

otr對人白血病細(xì)胞的體外增殖抑制活性：將復(fù)蘇的人白血病細(xì)胞thp-1培養(yǎng)于含有10％fbs滅活胎牛血清、1％青霉素/1％鏈霉素(雙抗)的無菌rpmi1640培養(yǎng)液中，置于懸浮細(xì)胞瓶中，在37℃、5％co2及飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長至70％-80％左右傳代1次。繼續(xù)培養(yǎng)得到生長狀態(tài)活躍的人白血病細(xì)胞，收集細(xì)胞。將處于對數(shù)生長期的5×10³個細(xì)胞接種于每孔含有100μlrpmi1640培養(yǎng)液的96孔板中，按照實(shí)驗(yàn)需求，處理組分別加入0.1％dmso、0.3μm、1.5μm、15μm、30μm濃度的ara-c或otr，放入培養(yǎng)箱中孵育3～5天，各4個復(fù)孔。采用cck-8試劑盒進(jìn)行檢測，每孔細(xì)胞懸液中加10μlcck-8溶液，置于37℃，co2培養(yǎng)箱中孵育2h。測定450nm處各組細(xì)胞的吸光度，記錄數(shù)據(jù)，采用重復(fù)測量資料的方差分析方法來分析各組數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖2所示。圖2可見，施用不同濃度的otr對人白血病細(xì)胞thp-1的增殖速率顯著低于ara-c和dmso，表明otr可以抑制人白血病細(xì)胞thp-1的增殖速率。

實(shí)施例2

otr誘導(dǎo)thp-1細(xì)胞凋亡：將生長狀態(tài)活躍的thp-1細(xì)胞用0.3μm的otr處理48h后，按照annexinv-fitc凋亡檢測試劑盒說明書配制染色緩沖液，每個樣品加入500μl染色緩沖液37℃避光孵育30min，最后用pbs洗一次。300目篩網(wǎng)過濾后用bdfacscalibur流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。結(jié)果如圖3所示，圖3可見，細(xì)胞凋亡時dna發(fā)生斷裂，造成細(xì)胞內(nèi)dna含量減少出現(xiàn)亞倍體峰。與對照組(1.21％)相比，otr處理組(19.23％)thp-1細(xì)胞出現(xiàn)明顯的亞倍體峰(圖3)，說明在相同實(shí)驗(yàn)條件下，otr能誘導(dǎo)thp-1細(xì)胞發(fā)生凋亡。

實(shí)施例3

為了進(jìn)一步說明otr是一種去甲基化試劑，我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，otr作用后多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)dna甲基轉(zhuǎn)移酶1(dnmt1)的表達(dá)量明顯降低。通過生物信息學(xué)分子對接模擬發(fā)現(xiàn)，otr與dnmt1的天然底物sam相比同樣可以嵌合在dnmt1結(jié)晶模型的活化位點(diǎn)內(nèi)；小分子親和性打分函數(shù)libdockscore值分析表明，otr與sah的分值相差甚微(圖5和圖6)，上述結(jié)果初步表明otr對dnmt1的活性影響更大，因此我們進(jìn)一步對其進(jìn)行體外表達(dá)克隆和純化后發(fā)現(xiàn)otr明顯抑制dnmt1的活性，該結(jié)果提示otr通過抑制dnmt1的活性發(fā)揮了otr的抗腫瘤作用。試驗(yàn)結(jié)果可見，otr是一種去甲基化試劑，但是否可以作為一種臨床去甲基化藥物現(xiàn)在并不確定。