本發(fā)明屬于細(xì)胞分化技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

表皮細(xì)胞具有多分化潛能，除再生皮膚的多層表皮結(jié)構(gòu)外，還形成汗腺、毛發(fā)和毛囊等皮膚附屬器官。因此，表皮細(xì)胞是構(gòu)建組織工程化皮膚比較理想的種子細(xì)胞。但由于目前獲取與純化表皮細(xì)胞較為困難，從而妨礙了表皮細(xì)胞作為組織工程化皮膚種子細(xì)胞的應(yīng)用。間充質(zhì)干細(xì)胞亦具有多向分化潛能，在不同的誘導(dǎo)條件下可分化為多種組織細(xì)胞，如肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肺細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等，是組織工程較為理想的種子細(xì)胞。最近研究表明：間充質(zhì)干細(xì)胞具有分化為表皮細(xì)胞的潛能。例如：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為表皮干細(xì)胞的研究(龍劍虹，等，中南大學(xué)學(xué)報(bào)，2006,06,32-38)公開(kāi)了將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為表皮干細(xì)胞的方法，該方法是將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞加入誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)液中，進(jìn)行培養(yǎng)，其中所述的誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)液是含有20％胎牛血清、8μg/legf、50％hacat細(xì)胞上清液的dmem培養(yǎng)液；此外一般的誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)液中還需要加入其他生長(zhǎng)因子、青霉素或抗生素等物質(zhì)，現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)的方法中所使用的誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)液對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化能力差，不利于表皮細(xì)胞的形成，分化專(zhuān)一性不強(qiáng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法利用了新的誘導(dǎo)分化液，有利于提高間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的專(zhuān)一性和分化能力。

本發(fā)明具體技術(shù)方法如下：

本發(fā)明提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法包括如下步驟：將間充質(zhì)干細(xì)胞加入誘導(dǎo)分化液中，于37℃、5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行誘導(dǎo)分化；所述誘導(dǎo)分化液主要由分化組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置5-10mg所述分化組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml；所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為10-25mg/ml，所述分化組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：轉(zhuǎn)鐵蛋白1-3份、維生素c0.5-1份、槲皮素5-10份、α-生育酚琥珀酸單酯2-5份、異銀杏雙黃酮10-15份、氫化卵磷脂1-3份和賴(lài)氨酸2-5份。

本發(fā)明采用自體來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化表皮細(xì)胞，所使用的誘導(dǎo)分化液能夠提高間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化表皮細(xì)胞的分化能力和專(zhuān)一性。

進(jìn)一步的改進(jìn)，所述分化組合物還包括重量份數(shù)為0.5-1份的麥芽糖醇、2-5份的磷酸二氫鉀、1-3份的瓊脂和2-3份的生物素。在分化組合物中加入麥芽糖醇、磷酸二氫鉀、瓊脂和生物素不但可以進(jìn)一步提高誘導(dǎo)分化能力，并且還可以縮短誘導(dǎo)分化的時(shí)間，提高誘導(dǎo)分化效率。

進(jìn)一步的改進(jìn)，所述分化組合物還包括重量份數(shù)為1-3份的谷氨酸鈉、0.2-0.5份的磷酯酰絲氨酸和2-5份的氯化硒。通過(guò)在分化組合物中加入氨酸鈉、磷酯酰絲氨酸和氯化硒的混合物可以提高誘導(dǎo)分化液防止細(xì)菌感染的能力，有效抑制細(xì)菌滋生，保障誘導(dǎo)分化液的使用安全，提高分化方法中誘導(dǎo)分化過(guò)程的安全性，進(jìn)而提高誘導(dǎo)后表皮細(xì)胞的存活率。

進(jìn)一步的改進(jìn)，所述方法還包括：在進(jìn)行誘導(dǎo)分化之前對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

進(jìn)一步的改進(jìn)，所述擴(kuò)增培養(yǎng)具體步驟為：將原代間充質(zhì)干細(xì)胞接種于第一培養(yǎng)基中，在37℃、5％co2、飽和濕度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，8h后更換一半量的第一培養(yǎng)基，以后每隔4h更換2/3量的第一培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天后，棄去未貼壁的細(xì)胞，將第一培養(yǎng)基更換成第二培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3-5天，每個(gè)一天更換全量第二培養(yǎng)基，培養(yǎng)完畢后，加入細(xì)胞消化液消化4min，收集間充質(zhì)干細(xì)胞。

進(jìn)一步的，所述第一培養(yǎng)基主要由第一培養(yǎng)組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置5-10mg所述第一培養(yǎng)組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml，所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為6.3-7.8mg/ml。

優(yōu)選地，所述第一培養(yǎng)組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5-10份、谷氨酰胺2-5份、白藜蘆醇2-5份、維生素e1-3份、普魯蘭2-5份和枸櫞酸鈉0.5-2份。

進(jìn)一步的改進(jìn)，所述第二培養(yǎng)基主要由第二培養(yǎng)組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置5-10mg所述第二培養(yǎng)組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml，所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為5-7.5mg/ml。

優(yōu)選地，所述第二培養(yǎng)組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：胎牛血清5-10份、甲殼糖1-3份、硝酸銨0.5-1份、鉬酸鈉0.5-2份、川芎嗪2-5份和l-抗壞血酸-2-磷酸鎂2-5份。

優(yōu)選的，所述細(xì)胞消化液為含0.25％胰酶的pbs緩沖液。

本發(fā)明通過(guò)選擇二次培養(yǎng)的方法并選擇不同的培養(yǎng)基來(lái)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，顯著提高了間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)增殖速度和培養(yǎng)擴(kuò)增數(shù)量。

本發(fā)明另一方面還提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的試劑盒，該試劑盒包括盒體和位于盒體內(nèi)部的若干試劑瓶，若干所述試劑瓶?jī)?nèi)分別盛裝有誘導(dǎo)分化液、第一培養(yǎng)基、第二培養(yǎng)基和細(xì)胞消化液，所述所述誘導(dǎo)分化液主要由分化組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置5-10mg所述分化組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml；所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為10-25mg/ml，所述分化組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：轉(zhuǎn)鐵蛋白1-3份、維生素c0.5-1份、槲皮素5-10份、α-生育酚琥珀酸單酯2-5份、異銀杏雙黃酮10-15份、氫化卵磷脂1-3份和賴(lài)氨酸2-5份；所述第一培養(yǎng)基主要由第一培養(yǎng)組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置5-10mg所述第一培養(yǎng)組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml，所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為6.3-7.8mg/ml；所述第二培養(yǎng)基主要由第二培養(yǎng)組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置5-10mg所述第二培養(yǎng)組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml，所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為5-7.5mg/ml。

本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法采用自體來(lái)源豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化后，得到數(shù)量充足的表皮細(xì)胞，該方法采用的誘導(dǎo)分化液能夠顯著提高見(jiàn)充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為表皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化能力及專(zhuān)一性，并且顯著降低了誘導(dǎo)分化的時(shí)間、提高了誘導(dǎo)分化后表皮細(xì)胞的存活率。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法包括如下步驟：將間充質(zhì)干細(xì)胞加入誘導(dǎo)分化液中，于37℃、5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行誘導(dǎo)分化；所述誘導(dǎo)分化液主要由分化組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置5mg所述分化組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml；所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為10mg/ml，所述分化組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：轉(zhuǎn)鐵蛋白1份、維生素c0.5份、槲皮素5份、α-生育酚琥珀酸單酯2份、異銀杏雙黃酮10份、氫化卵磷脂1份和賴(lài)氨酸2份。

實(shí)施例2

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法包括如下步驟：將間充質(zhì)干細(xì)胞加入誘導(dǎo)分化液中，于37℃、5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行誘導(dǎo)分化；所述誘導(dǎo)分化液主要由分化組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置7.5mg所述分化組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml；所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為15mg/ml，所述分化組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：轉(zhuǎn)鐵蛋白1.5份、維生素c0.6份、槲皮素60份、α-生育酚琥珀酸單酯3份、異銀杏雙黃酮12份、氫化卵磷脂1.5份和賴(lài)氨酸3份。

實(shí)施例3

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法包括如下步驟：將間充質(zhì)干細(xì)胞加入誘導(dǎo)分化液中，于37℃、5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行誘導(dǎo)分化；所述誘導(dǎo)分化液主要由分化組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置10mg所述分化組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml；所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為25mg/ml，所述分化組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：轉(zhuǎn)鐵蛋白3份、維生素c1份、槲皮素10份、α-生育酚琥珀酸單酯5份、異銀杏雙黃酮15份、氫化卵磷脂3份、賴(lài)氨酸5份、麥芽糖醇1份、磷酸二氫鉀5份、瓊脂3份和生物素3份。

實(shí)施例4

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法包括如下步驟：將間充質(zhì)干細(xì)胞加入誘導(dǎo)分化液中，于37℃、5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行誘導(dǎo)分化；所述誘導(dǎo)分化液主要由分化組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置6mg所述分化組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml；所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為20mg/ml，所述分化組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：轉(zhuǎn)鐵蛋白2.5份、維生素c0.7份、槲皮素7份、α-生育酚琥珀酸單酯4份、異銀杏雙黃酮13份、氫化卵磷脂2份、賴(lài)氨酸3.5份、麥芽糖醇0.5份、磷酸二氫鉀2份、瓊脂1份和生物素2份。

實(shí)施例5

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法包括如下步驟：將間充質(zhì)干細(xì)胞加入誘導(dǎo)分化液中，于37℃、5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行誘導(dǎo)分化；所述誘導(dǎo)分化液主要由分化組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置8mg所述分化組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml；所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為12.5mg/ml，所述分化組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：轉(zhuǎn)鐵蛋白1.2份、維生素c0.8份、槲皮素8份、α-生育酚琥珀酸單酯3.5份、異銀杏雙黃酮14份、氫化卵磷脂2.5份、賴(lài)氨酸4份、麥芽糖醇0.7份、磷酸二氫鉀3份、瓊脂1.5份、生物素2.2份、谷氨酸鈉1份、磷酯酰絲氨酸0.2份和氯化硒2份。

實(shí)施例6

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法包括如下步驟：將間充質(zhì)干細(xì)胞加入誘導(dǎo)分化液中，于37℃、5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行誘導(dǎo)分化；所述誘導(dǎo)分化液主要由分化組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置9mg所述分化組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml；所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為17.5mg/ml，所述分化組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：轉(zhuǎn)鐵蛋白2.5份、維生素c0.75份、槲皮素9份、α-生育酚琥珀酸單酯2.5份、異銀杏雙黃酮11份、氫化卵磷脂2.2份、賴(lài)氨酸2.5份、麥芽糖醇0.6份、磷酸二氫鉀4份、瓊脂2份、生物素2.5份、谷氨酸鈉3份、磷酯酰絲氨酸0.5份和氯化硒5份。

實(shí)施例7

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法包括如下步驟：將間充質(zhì)干細(xì)胞加入誘導(dǎo)分化液中，于37℃、5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行誘導(dǎo)分化；所述誘導(dǎo)分化液主要由分化組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置7.5mg所述分化組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml；所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為20mg/ml，所述分化組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：轉(zhuǎn)鐵蛋白2份、維生素c0.7份、槲皮素7.5份、α-生育酚琥珀酸單酯3.5份、異銀杏雙黃酮12.5份、氫化卵磷脂1.5份、賴(lài)氨酸4.5份、麥芽糖醇0.8份、磷酸二氫鉀3.5份、瓊脂2.5份、生物素2.5份、谷氨酸鈉2份、磷酯酰絲氨酸0.3份和氯化硒3.5份。

實(shí)施例8

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法與實(shí)施例1不同的是：在進(jìn)行誘導(dǎo)分化之前對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，所述擴(kuò)增培養(yǎng)具體步驟為：將原代間充質(zhì)干細(xì)胞接種于第一培養(yǎng)基中，在37℃、5％co2、飽和濕度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，8h后更換一半量的第一培養(yǎng)基，以后每隔4h更換2/3量的第一培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天后，棄去未貼壁的細(xì)胞，將第一培養(yǎng)基更換成第二培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3天，每個(gè)一天更換全量第二培養(yǎng)基，培養(yǎng)完畢后，加入細(xì)胞消化液消化4min，收集間充質(zhì)干細(xì)胞，所述第一培養(yǎng)基主要由第一培養(yǎng)組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置5mg所述第一培養(yǎng)組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml，所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為6.3mg/ml，所述第一培養(yǎng)組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5份、谷氨酰胺2份、白藜蘆醇2份、維生素e1份、普魯蘭2份和枸櫞酸鈉0.5份；所述第二培養(yǎng)基主要由第二培養(yǎng)組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置5mg所述第二培養(yǎng)組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml，所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為5mg/ml；所述第二培養(yǎng)組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：胎牛血清5份、甲殼糖1份、硝酸銨0.5份、鉬酸鈉0.5份、川芎嗪2份和l-抗壞血酸-2-磷酸鎂2份。

實(shí)施例9

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法與實(shí)施例3不同的是：在進(jìn)行誘導(dǎo)分化之前對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，所述擴(kuò)增培養(yǎng)具體步驟為：將原代間充質(zhì)干細(xì)胞接種于第一培養(yǎng)基中，在37℃、5％co2、飽和濕度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，8h后更換一半量的第一培養(yǎng)基，以后每隔4h更換2/3量的第一培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天后，棄去未貼壁的細(xì)胞，將第一培養(yǎng)基更換成第二培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5天，每個(gè)一天更換全量第二培養(yǎng)基，培養(yǎng)完畢后，加入細(xì)胞消化液消化4min，收集間充質(zhì)干細(xì)胞，所述第一培養(yǎng)基主要由第一培養(yǎng)組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置10mg所述第一培養(yǎng)組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml，所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為7.8mg/ml，所述第一培養(yǎng)組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10份、谷氨酰胺5份、白藜蘆醇5份、維生素e3份、普魯蘭5份和枸櫞酸鈉2份；所述第二培養(yǎng)基主要由第二培養(yǎng)組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置10mg所述第二培養(yǎng)組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml，所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為7.5mg/ml；所述第二培養(yǎng)組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：胎牛血清10份、甲殼糖3份、硝酸銨1份、鉬酸鈉2份、川芎嗪5份和l-抗壞血酸-2-磷酸鎂5份。

實(shí)施例10

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法與實(shí)施例5不同的是：在進(jìn)行誘導(dǎo)分化之前對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，所述擴(kuò)增培養(yǎng)具體步驟為：將原代間充質(zhì)干細(xì)胞接種于第一培養(yǎng)基中，在37℃、5％co2、飽和濕度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，8h后更換一半量的第一培養(yǎng)基，以后每隔4h更換2/3量的第一培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天后，棄去未貼壁的細(xì)胞，將第一培養(yǎng)基更換成第二培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4天，每個(gè)一天更換全量第二培養(yǎng)基，培養(yǎng)完畢后，加入細(xì)胞消化液消化4min，收集間充質(zhì)干細(xì)胞，所述第一培養(yǎng)基主要由第一培養(yǎng)組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置7.5mg所述第一培養(yǎng)組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml，所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為7mg/ml，所述第一培養(yǎng)組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子7.5份、谷氨酰胺3份、白藜蘆醇4份、維生素e2份、普魯蘭3.5份和枸櫞酸鈉1份；所述第二培養(yǎng)基主要由第二培養(yǎng)組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置7.5mg所述第二培養(yǎng)組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml，所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為6mg/ml；所述第二培養(yǎng)組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：胎牛血清7份、甲殼糖2份、硝酸銨0.75份、鉬酸鈉1.5份、川芎嗪4份和l-抗壞血酸-2-磷酸鎂3份。

實(shí)施例11

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的試劑盒，該試劑盒包括盒體和位于盒體內(nèi)部的若干試劑瓶，若干所述試劑瓶?jī)?nèi)分別盛裝有誘導(dǎo)分化液、第一培養(yǎng)基、第二培養(yǎng)基和細(xì)胞消化液，所述所述誘導(dǎo)分化液主要由分化組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置7.5mg所述分化組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml；所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為20mg/ml，所述分化組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：轉(zhuǎn)鐵蛋白2份、維生素c0.7份、槲皮素7.5份、α-生育酚琥珀酸單酯3.5份、異銀杏雙黃酮12份、氫化卵磷脂2份和賴(lài)氨酸3.5份；所述第一培養(yǎng)基主要由第一培養(yǎng)組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置5-10mg所述第一培養(yǎng)組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml，所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為7mg/ml；所述第二培養(yǎng)基主要由第二培養(yǎng)組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置7.5mg所述第二培養(yǎng)組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml，所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為6mg/ml，所述第一培養(yǎng)組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子7.5份、谷氨酰胺3份、白藜蘆醇3.5份、維生素e2份、普魯蘭3.5份和枸櫞酸鈉1份；所述第二培養(yǎng)組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：胎牛血清7.5份、甲殼糖2份、硝酸銨0.7份、鉬酸鈉1份、川芎嗪3.5份和l-抗壞血酸-2-磷酸鎂3.5份。

對(duì)照例1

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法包括如下步驟：將間充質(zhì)干細(xì)胞加入誘導(dǎo)分化液中，于37℃、5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行誘導(dǎo)分化；所述誘導(dǎo)分化液主要由分化組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置5mg所述分化組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml；所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為10mg/ml，所述分化組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子1份、維生素c0.5份、青霉素5份、α-生育酚琥珀酸單酯2份、異銀杏雙黃酮10份、氫化卵磷脂1份和賴(lài)氨酸2份。

對(duì)照例2

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法包括如下步驟：將間充質(zhì)干細(xì)胞加入誘導(dǎo)分化液中，于37℃、5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行誘導(dǎo)分化；所述誘導(dǎo)分化液主要由分化組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置5mg所述分化組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml；所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為10mg/ml，所述分化組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：轉(zhuǎn)鐵蛋白1份、維生素c0.5份、槲皮素5份、氫化卵磷脂1份和賴(lài)氨酸2份。

對(duì)照例3

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法包括如下步驟：將間充質(zhì)干細(xì)胞加入誘導(dǎo)分化液中，于37℃、5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行誘導(dǎo)分化；所述誘導(dǎo)分化液主要由分化組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置5mg所述分化組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml；所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為10mg/ml，所述分化組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：胎牛血清20份、egf8份、hacat細(xì)胞上清液50份。

對(duì)照例4

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法包括如下步驟：將間充質(zhì)干細(xì)胞加入誘導(dǎo)分化液中，于37℃、5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行誘導(dǎo)分化；所述誘導(dǎo)分化液主要由分化組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置10mg所述分化組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml；所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為25mg/ml，所述分化組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：轉(zhuǎn)鐵蛋白3份、維生素c1份、槲皮素10份、α-生育酚琥珀酸單酯5份、異銀杏雙黃酮15份、氫化卵磷脂3份、賴(lài)氨酸5份、葡萄糖1份、瓊脂3份和生物素3份。

對(duì)照例5

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法包括如下步驟：將間充質(zhì)干細(xì)胞加入誘導(dǎo)分化液中，于37℃、5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行誘導(dǎo)分化；所述誘導(dǎo)分化液主要由分化組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置10mg所述分化組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml；所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為25mg/ml，所述分化組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：轉(zhuǎn)鐵蛋白3份、維生素c1份、槲皮素10份、α-生育酚琥珀酸單酯5份、異銀杏雙黃酮15份、氫化卵磷脂3份、賴(lài)氨酸5份、麥芽糖醇1份、磷酸二氫鉀5份、阿拉伯膠3份。

對(duì)照例6

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法包括如下步驟：將間充質(zhì)干細(xì)胞加入誘導(dǎo)分化液中，于37℃、5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行誘導(dǎo)分化；所述誘導(dǎo)分化液主要由分化組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置8mg所述分化組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml；所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為12.5mg/ml，所述分化組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：轉(zhuǎn)鐵蛋白1.2份、維生素c0.8份、槲皮素8份、α-生育酚琥珀酸單酯3.5份、異銀杏雙黃酮14份、氫化卵磷脂2.5份、賴(lài)氨酸4份、麥芽糖醇0.7份、磷酸二氫鉀3份、瓊脂1.5份、生物素2.2份、谷氨酸鈉1份、絲氨酸0.2份和氯化鈉2份。

對(duì)照例7

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法包括如下步驟：將間充質(zhì)干細(xì)胞加入誘導(dǎo)分化液中，于37℃、5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行誘導(dǎo)分化；所述誘導(dǎo)分化液主要由分化組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置8mg所述分化組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml；所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為12.5mg/ml，所述分化組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：轉(zhuǎn)鐵蛋白1.2份、維生素c0.8份、槲皮素8份、α-生育酚琥珀酸單酯3.5份、異銀杏雙黃酮14份、氫化卵磷脂2.5份、賴(lài)氨酸4份、麥芽糖醇0.7份、磷酸二氫鉀3份、瓊脂1.5份、生物素2.2份、磷酯酰絲氨酸0.2份和氯化硒2份。

對(duì)照例8

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法與實(shí)施例1不同的是：在進(jìn)行誘導(dǎo)分化之前對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，所述擴(kuò)增培養(yǎng)具體步驟為：將原代間充質(zhì)干細(xì)胞接種于第一培養(yǎng)基中，在37℃、5％co2、飽和濕度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，8h后更換一半量的第一培養(yǎng)基，以后每隔4h更換2/3量的第一培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天后，棄去未貼壁的細(xì)胞，將第一培養(yǎng)基更換成第二培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3天，每個(gè)一天更換全量第二培養(yǎng)基，培養(yǎng)完畢后，加入細(xì)胞消化液消化4min，收集間充質(zhì)干細(xì)胞，所述第一培養(yǎng)基主要由第一培養(yǎng)組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置5mg所述第一培養(yǎng)組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml，所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為6.3mg/ml，所述第一培養(yǎng)組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5份、谷氨酸2份、維生素e1份、普魯蘭2份和枸櫞酸鈉0.5份；所述第二培養(yǎng)基主要由第二培養(yǎng)組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置5mg所述第二培養(yǎng)組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml，所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為5mg/ml；所述第二培養(yǎng)組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：胎牛血清5份、甲殼糖1份、硝酸銨0.5份、鉬酸鈉0.5份、川芎嗪2份和l-抗壞血酸-2-磷酸鎂2份。

對(duì)照例9

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法與實(shí)施例1不同的是：在進(jìn)行誘導(dǎo)分化之前對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，所述擴(kuò)增培養(yǎng)具體步驟為：將原代間充質(zhì)干細(xì)胞接種于第一培養(yǎng)基中，在37℃、5％co2、飽和濕度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，8h后更換一半量的第一培養(yǎng)基，以后每隔4h更換2/3量的第一培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天后，棄去未貼壁的細(xì)胞，將第一培養(yǎng)基更換成第二培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3天，每個(gè)一天更換全量第二培養(yǎng)基，培養(yǎng)完畢后，加入細(xì)胞消化液消化4min，收集間充質(zhì)干細(xì)胞，所述第一培養(yǎng)基主要由第一培養(yǎng)組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置5mg所述第一培養(yǎng)組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml，所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為6.3mg/ml，所述第一培養(yǎng)組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5份、谷氨酰胺2份、白藜蘆醇2份、維生素e1份、普魯蘭2份和枸櫞酸鈉0.5份；所述第二培養(yǎng)基主要由第二培養(yǎng)組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置5mg所述第二培養(yǎng)組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml，所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為5mg/ml；所述第二培養(yǎng)組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：胎牛血清5份、甲殼糖1份、硝酸銨0.5份、鉬酸鈉0.5份。

對(duì)照例10

一種間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，該方法與實(shí)施例1不同的是：在進(jìn)行誘導(dǎo)分化之前對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，所述擴(kuò)增培養(yǎng)具體步驟為：將原代間充質(zhì)干細(xì)胞接種于第一培養(yǎng)基中，在37℃、5％co2、飽和濕度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)2天后，棄去未貼壁的細(xì)胞，將第一培養(yǎng)基更換成第二培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3天，培養(yǎng)完畢后，加入細(xì)胞消化液消化4min，收集間充質(zhì)干細(xì)胞，所述第一培養(yǎng)基主要由第一培養(yǎng)組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置5mg所述第一培養(yǎng)組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml，所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為6.3mg/ml，所述第一培養(yǎng)組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5份、谷氨酰胺2份、白藜蘆醇2份、維生素e1份和枸櫞酸鈉0.5份；所述第二培養(yǎng)基主要由第二培養(yǎng)組合物和dmem培養(yǎng)基水溶液配置而成；配置5mg所述第二培養(yǎng)組合物所用的dmem培養(yǎng)基水溶液的體積為1ml，所述dmem培養(yǎng)基水溶液的濃度為5mg/ml；所述第二培養(yǎng)組合物主要由如下重量份數(shù)的成分制備而成：胎牛血清5份、麥芽糖1份、硝酸銨0.5份、氯化鈉0.5份、川芎嗪2份和l-抗壞血酸-2-磷酸鎂2份。

間充質(zhì)干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化效果評(píng)價(jià)

1.分化效果比較

利用熒光定量pcr儀分別檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)實(shí)施例1、實(shí)施例3、對(duì)照例1-5的方法進(jìn)行誘導(dǎo)分化的0天、3天、5天和7天，表皮細(xì)胞中特異性蛋白ck10及ck19的表達(dá)情況，檢測(cè)ck10及ck19的相對(duì)表達(dá)率(％)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1表皮細(xì)胞中特異性蛋白ck10及ck19的相對(duì)表達(dá)率(％)

由上述結(jié)果可知，采用實(shí)施例1的方法對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化與對(duì)照例1-3的方法對(duì)比，實(shí)施例3的方法對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化與對(duì)照例4-5的方法對(duì)比，誘導(dǎo)分化為表皮細(xì)胞中的特異性蛋白ck-10及ck-19的相對(duì)表達(dá)率均明顯較高，說(shuō)明采用本發(fā)明提供的方法可顯著提高間充質(zhì)干細(xì)胞向表皮細(xì)胞的分化效果和誘導(dǎo)分化速度。

并且將實(shí)施例3與實(shí)施例1相比，采用實(shí)施例3的方法誘導(dǎo)分化表皮細(xì)胞的能夠和速度顯著高于實(shí)施例1，說(shuō)明在分組組合物中加入麥芽糖醇、磷酸二氫鉀、瓊脂和生物素不但可以進(jìn)一步提高誘導(dǎo)分化能力，并且還可以縮短誘導(dǎo)分化的時(shí)間，提高誘導(dǎo)分化效率。

安全性評(píng)價(jià)

1.誘導(dǎo)分化過(guò)程的安全性評(píng)價(jià)

取實(shí)施例5、對(duì)照例6、對(duì)照例7的方法中所使用的誘導(dǎo)分化液，均在溫度為25℃±2℃，相對(duì)濕度為60％±10％的條件下密閉保存12個(gè)月，檢測(cè)誘導(dǎo)分化液中的細(xì)菌總數(shù)。

表2誘導(dǎo)分化液中細(xì)菌總數(shù)統(tǒng)計(jì)

由上述結(jié)果可知，在誘導(dǎo)分化液中加入氨酸鈉、磷酯酰絲氨酸和氯化硒的混合物可以提高誘導(dǎo)分化液防止細(xì)菌感染的能力，有效抑制細(xì)菌滋生，保障誘導(dǎo)分化液的使用安全，提高分化方法中誘導(dǎo)分化過(guò)程的安全性。

培養(yǎng)擴(kuò)增效果評(píng)價(jià)

采取間充質(zhì)干細(xì)胞，按照實(shí)施例8、對(duì)照例8-10的方法擴(kuò)增培養(yǎng)，采用臺(tái)盼藍(lán)經(jīng)典染色法對(duì)培養(yǎng)后的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別統(tǒng)計(jì)原代和第3代活間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增倍數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增效果評(píng)價(jià)

由上述結(jié)果可以得出，采用本發(fā)明提供的方法培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增效果明顯優(yōu)于對(duì)照例8-10的方法，說(shuō)明本發(fā)明提供的方法能夠顯著提高間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖速度和擴(kuò)增倍數(shù)。

最后應(yīng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。