本發(fā)明涉及白細(xì)胞介素17，尤其是涉及大黃魚白細(xì)胞介素17c2基因大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

白細(xì)胞介素17(interleukin-17，il-17)屬于一類新的細(xì)胞因子家族，能夠誘導(dǎo)促炎因子(如il-6、g-csf、tnf-α)、趨化因子(如cxcl1、cxcl2、ccl20等)，以及炎癥效應(yīng)因子(急性期蛋白、補(bǔ)體)等多種基因表達(dá)，在抗胞外細(xì)菌感染，炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。il-17對炎癥反應(yīng)過程中白細(xì)胞遷移也具有重要的協(xié)調(diào)作用(iwakura,y.,ishigame,h.,saijo,s.,nakae,s.,2011,functionalspecializationofinterleukin-17familymembers[j].immunity34,149-162)。il-17家族現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)6個(gè)成員，包括il-17a、il-17b、il-17c、il-17d、il-17e和il-17f，各個(gè)成員之間的序列相似性并不高，但是具有類似的蛋白結(jié)構(gòu)，都含有四個(gè)保守的半胱氨酸殘基以維系其三維構(gòu)型(gu,c.,wu,l.,li,x.,2013.il-17family:cytokines,receptorsandsignaling[j].cytokine64,477-485)。作為il-17家族的一員，il-17c主要參與宿主的黏膜免疫，可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，刺激促炎細(xì)胞因子，趨化因子及抗菌肽的表達(dá)(song,x.,zhu,s.,shi,p.,liu,y.,shi,y.,levin,s.d.,qian,y.,2011.il-17reisthefunctionalreceptorforil-17candmediatesmucosalimmunitytoinfectionwithintestinalpathogens[j].nat.immunol.12,1151-1158)。此外，il-17c可誘導(dǎo)tnf-α和il-1β在單核細(xì)胞系thp-1中表達(dá)，并促進(jìn)誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞遷移(iwakura,y.,ishigame,h.,saijo,s.,nakae,s.,2011,functionalspecializationofinterleukin-17familymembers[j].immunity34,149-162)。與哺乳動物不同，魚類具有2個(gè)il-17c的同源基因：il-17c1和il-17c2，二者序列相似性較高。魚類il-17c主要表達(dá)在黏膜相關(guān)組織中，在lps誘導(dǎo)或細(xì)菌感染后表達(dá)量顯著升高，表明il-17c參與魚類的抗細(xì)菌免疫反應(yīng)(kono,t.,korenaga,h.,sakai,m.,2011.genomicsoffishil-17ligandandreceptors:areview[j].fishshellfishimmunol.31,635-643.)。目前，在魚類中還未展開對il-17c功能的相關(guān)研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供大腸桿菌bl21/pet-32a-lcil-17c2(escherichiacolibl21/pet-32a-lcil-17c2)。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種大黃魚白細(xì)胞介素17c2基因大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物及其制備方法。

本發(fā)明的目的之三在于提供大黃魚il-17c2重組蛋白的應(yīng)用。

所述大腸桿菌bl21/pet-32a-lcil-17c2(escherichiacolibl21/pet-32a-lcil-17c2)已于2016年12月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctccno：m2016782，中國典型培養(yǎng)物保藏中心的地址為中國，武漢，武漢大學(xué)。

所述大黃魚白細(xì)胞介素17c2基因大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物，為分子量約34kda的大黃魚il-17c2重組蛋白。

所述大黃魚白細(xì)胞介素17c2基因大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的制備方法包括以下步驟：

1)克隆大黃魚il-17c2基因全長cdna序列，再采用pcr技術(shù)擴(kuò)增出編碼第25～171位氨基酸的大黃魚il-17c2成熟肽基因片段；

2)將步驟1)得到的大黃魚il-17c2成熟肽基因片段克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pet-32a，得到含大黃魚il-17c2成熟肽基因片段的重組表達(dá)載體pet-32a-lcil-17c2；

3)將重組表達(dá)載體pet-32a-lcil-17c2轉(zhuǎn)化大腸桿菌(escherichiacoli)bl21菌株，經(jīng)氨芐青霉素篩選及測序鑒定后，獲得含有大黃魚il-17c2成熟肽基因片段的大腸桿菌bl21/pet-32a-lcil-17c2工程菌；同時(shí)，表達(dá)載體pet-32a轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21菌株，獲得的大腸桿菌bl21/pet-32a作為對照菌株；

4)大腸桿菌bl21/pet-32a-lcil-17c2工程菌在lb培養(yǎng)基中經(jīng)0.1mmiptg誘導(dǎo)、37℃振蕩培養(yǎng)4h，將培養(yǎng)物離心收集菌體，buffera重懸后，超聲破碎，分別收集菌體裂解液上清和菌體裂解液沉淀，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳sds-page分析證明大黃魚il-17c2重組蛋白以包涵體形式表達(dá)；

在步驟4)中，所述lb培養(yǎng)基的配方為：10g/l蛋白胨、5g/l酵母抽提物、10g/l氯化鈉；所述buffera的組成可為20mmtris-hcl、150mmnacl、0.5％tritonx-100和30mm咪唑，ph7.9。

5)利用鎳離子鰲合親和層析介質(zhì)(ni-nta)純化該重組蛋白：離心收集大腸桿菌bl21/pet-32a-lcil-17c2工程菌培養(yǎng)物中菌體，用包涵體洗滌液重懸菌體，第1次超聲破碎，離心收集沉淀，再用包涵體裂解液重懸沉淀，第2次超聲破碎，離心收集上清后上柱，4℃結(jié)合2h，用雜蛋白洗滌液洗柱，再用6m尿素洗柱，最后用變性蛋白洗脫液洗脫，獲得大黃魚il-17c2重組蛋白，純化后的大黃魚il-17c2重組蛋白分別經(jīng)緩沖液1、緩沖液2和緩沖液3進(jìn)行3步透析，即得到有活性的大黃魚il-17c2重組蛋白；所述緩沖液1的配方為：3m尿素、20mmtris-hcl、150mmnacl、0.25m咪唑、0.1mm氧化型谷胱甘肽、0.5mm還原型谷胱甘肽、5％甘油和0.005％tween20；所述緩沖液2的配方為：1m尿素、20mmtris-hcl、150mmnacl、0.125m咪唑、0.1mm氧化型谷胱甘肽、0.5mm還原型谷胱甘肽、5％甘油和0.005％tween20；所述緩沖液3的配方為：20mmtris-hcl、150mmnacl和5％甘油。

在步驟5)中，所述包涵體洗滌液的配方可為：2m尿素、20mmtris-hcl、150mmnacl、1mmedta和0.5％tritonx-100，ph7.9；所述第1次超聲破碎的時(shí)間可為10min；所述包涵體裂解液的配方可為：8m尿素、20mmtris-hcl、150mmnacl、0.1％β‐巰基乙醇、0.2％tritonx-100和30mm咪唑，ph7.9；第2次超聲破碎的時(shí)間可為5min；所述雜蛋白洗滌液的配方可為：6m尿素、20mmtris-hcl、150mmnacl、0.1％β‐巰基乙醇和30mm咪唑，ph6.0；所述變性蛋白洗脫液的配方可為：6m尿素、20mmtris-hcl、150mmnacl和0.5m咪唑，ph4.5。

所述大黃魚il-17c2重組蛋白的應(yīng)用之一在于其可誘導(dǎo)大黃魚外周血白細(xì)胞表達(dá)趨化因子(cxcl8、cxcl12、cxcl13)、促炎因子(tnf-α、il-1β、il-6、ifng)及抗菌肽hepcidin等基因。

所述大黃魚il-17c2重組蛋白的應(yīng)用之二在于其參與調(diào)節(jié)對大黃魚外周血白細(xì)胞的趨化作用，表明大黃魚il-17c2重組蛋白具有明顯的促進(jìn)炎癥反應(yīng)及增強(qiáng)宿主抗細(xì)菌防御的功能，顯示出其在水產(chǎn)免疫增強(qiáng)劑研發(fā)中的良好應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為大黃魚il-17c2成熟肽基因片段pcr擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳分析。在圖1中，m泳道為dl1000dnamarker；1泳道為大黃魚il-17c2成熟肽基因片段的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2為純化的大黃魚il-17c2重組蛋白的sds-page分析。在圖2中，m泳道為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1泳道是純化的trx重組蛋白；2泳道是純化的大黃魚il-17c2重組蛋白。箭頭所指的是大黃魚il-17c2重組蛋白。

圖3為大黃魚il-17c2重組蛋白對大黃魚外周血白細(xì)胞中下游基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。在圖3中，a為趨化因子cxcl8，b為趨化因子cxcl12，c為趨化因子cxcl13；d為促炎因子tnf-α，e為促炎因子il-1β，f為促炎因子il-6；g為抗菌肽hepcidin；h為促炎因子ifng。

圖4為大黃魚il-17c2重組蛋白參與促進(jìn)對大黃魚外周血白細(xì)胞的趨化作用。在圖4中，標(biāo)記a表示trx重組蛋白處理的大黃魚外周血白細(xì)胞培養(yǎng)基；b表示1l-17c2重組蛋白處理的大黃魚外周血白細(xì)胞培養(yǎng)基；c表示trx重組蛋白，d表示1l-17c2重組蛋白。取50ng/ml的大黃魚il-17c2重組蛋白處理大黃魚外周血白細(xì)胞，再收集處理后的大黃魚外周血白細(xì)胞培養(yǎng)基上清分析對大黃魚外周血白細(xì)胞的趨化活性。對照蛋白是50ng/ml的trx重組蛋白，用于檢驗(yàn)大黃魚il-17c2重組蛋白對大黃魚外周血白細(xì)胞趨化活性的特異性。^*p<0.05，^**p<0.01。

具體實(shí)施方式

一、大黃魚il-17c2基因cdna的獲得

通過對大黃魚脾臟轉(zhuǎn)錄組文庫分析，發(fā)現(xiàn)了部分大黃魚il-17c2cdna序列，經(jīng)過5’-race和3’-racepcr,獲得了大黃魚il-17c2的全長cdna，該序列全長897個(gè)核苷酸，編碼一個(gè)由172個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。

所述大黃魚il-17c2基因cdna及其推斷的氨基酸序列如下：

其中，下劃線部分為預(yù)測的大黃魚il-17c2信號肽；陰影部分表示il-17保守結(jié)構(gòu)域；方框標(biāo)示保守的半胱氨酸殘基；星號表示終止密碼子。

二、含大黃魚il-17c2成熟肽基因的大腸桿菌bl21/pet-32a-lcil-17c2工程菌的構(gòu)建

1.含大黃魚il-17c2成熟肽基因的重組表達(dá)載體pet-32a-lcil-17c2的構(gòu)建

(1)大黃魚il-17c2成熟肽基因片段的pcr擴(kuò)增：合成帶有限制性核酸內(nèi)切酶ecori位點(diǎn)的正向引物il-17c2-f：ccggaattctcatcttgctcag和帶有xhoi位點(diǎn)的反向引物il-17c2-r：ccgctcgagcttggatgatatt；使用takara公司的hsdnapolymerase按照說明書進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr體系為：

雙蒸水補(bǔ)至50μl。

pcr程序如下：

pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件：電壓120v，時(shí)間15min。使用凝膠成像儀觀察，可見一條大小為450個(gè)核苷酸的條帶(圖1)，與預(yù)期相符，然后用omega公司膠回收試劑盒回收pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

(2)酶切反應(yīng)：回收的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物和大腸桿菌原核表達(dá)載體pet-32a分別進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶ecori和xhoi雙酶切，酶切反應(yīng)體系：

10×酶切緩沖液2μl

ecori1μl

xhoi1μl

載體1μg/pcr產(chǎn)物(400ng)

雙蒸水補(bǔ)至20μl。

酶切條件：37℃反應(yīng)3h。酶切產(chǎn)物使用omega公司膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

(3)連接反應(yīng)：使用takara公司t4dna連接酶連接雙酶切后的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物和pet-32a載體，連接體系如下：

雙蒸水補(bǔ)至10μl。

反應(yīng)條件：16℃反應(yīng)4h。

(4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化novogen公司大腸桿菌e.colitop10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落pcr篩選陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后，使用omega公司質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，并測序驗(yàn)證，從而獲得了含大黃魚il-17c2成熟肽基因片段的重組表達(dá)載體pet-32a-lcil-17c2。

2.大腸桿菌bl21/pet-32a-lcil-17c2工程菌的構(gòu)建

將含有大黃魚il-17c2成熟肽基因片段的重組表達(dá)載體pet-32a-lcil-17c2轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的lb平板上，37℃靜置培養(yǎng)16h，長出單菌落，得到含有大黃魚il-17c2成熟肽基因的大腸桿菌bl21/pet-32a-lcil-17c2工程菌。

培養(yǎng)基配方：

lb液體培養(yǎng)基：10g/l蛋白胨、5g/l酵母抽提物和10g/l氯化鈉；

lb平板：10g/l蛋白胨、5g/l酵母抽提物、10g/l氯化鈉和15g/l瓊脂粉。

三、大黃魚il-17c2基因在大腸桿菌中表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物純化

1.大黃魚il-17c2重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及sds-page分析

將上述構(gòu)建的大腸桿菌bl21/pet-32a-lcil-17c2工程菌，挑取單菌落接種至5ml含100μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，180r/min過夜振蕩培養(yǎng)。第二天按1︰100比例接種于100ml含100μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基的中，37℃，180r/min振蕩培養(yǎng)。待培養(yǎng)物od600至0.4～0.5時(shí)，加入終濃度為0.1mm的iptg誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4h，將培養(yǎng)物離心，收集菌體。

用10mlbuffera重懸收集的菌體，超聲破碎10min，再將裂解液在4℃，12000r/min，離心20min，收集裂解液上清，并用10mlbuffera重懸裂解液沉淀。菌體裂解液、菌體裂解液上清，菌體裂解液沉淀各取50μl，并加入等體積蛋白電泳上樣緩沖液，沸水煮10min，然后進(jìn)行濃度為15％的sds-page電泳。結(jié)果顯示，對照菌株bl21/pet-32a的菌體裂解液中出現(xiàn)了一條約20kda左右的蛋白條帶，為空載體pet-32a所表達(dá)的重組蛋白trx。而在大腸桿菌bl21/pet-32a-lcil-17c2工程菌的菌體裂解液中則出現(xiàn)了一條約34kda左右的蛋白條帶，說明了大黃魚il-17c2重組蛋白在大腸桿菌中得到了表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)il-17c2重組蛋白含量在菌體裂解液沉淀中顯著多于菌體裂解液上清中，說明大黃魚il-17c2重組蛋白在大腸桿菌bl21/pet-32a-lcil-17c2工程菌中主要以包涵體的形式表達(dá)?；诖耍罄m(xù)采用包涵體蛋白純化方法對大黃魚il-17c2重組蛋白進(jìn)行純化。

buffera：20mmtris-hcl、150mmnacl、0.5％tritonx-100和30mm咪唑，ph7.9。

2.親和層析法純化大黃魚il-17c2重組蛋白

參照invitrogen公司鎳離子鰲合親和層析介質(zhì)(ni-nta)推薦的方法進(jìn)行重組蛋白的純化：首先4℃，5000r/min離心10min收集100mliptg誘導(dǎo)后的大腸桿菌bl21/pet-32a-lcil-17c2工程菌菌體，用10ml包涵體洗滌液重懸菌體，超聲破碎10min，然后4℃，12000r/min，離心10min收集菌體裂解液沉淀，再用10ml包涵體裂解液重懸沉淀，超聲破碎5min，18000r/min，4℃，離心20min離心收集包涵體上清備用。

先用1ml鎳離子鰲合親和層析介質(zhì)裝柱，用5倍柱體積雙蒸水洗柱，再加入5倍柱體積包涵體裂解液平衡層析柱，液體流凈后，步驟1)中收集的包涵體上清上柱，4℃孵育2h，然后用10ml雜蛋白洗滌液洗柱，重復(fù)洗10次，洗去未結(jié)合的蛋白，再用10ml6m尿素洗柱，重復(fù)5次，最后用1ml變性蛋白洗脫液洗脫目的蛋白，重復(fù)收集5次。

包涵體洗滌液：2m尿素、20mmtris-hcl、150mmnacl、1mmedta和0.5％tritonx-100，ph7.9；

包涵體裂解液：8m尿素、20mmtris-hcl、150mmnacl、0.1％β‐巰基乙醇、0.2％tritonx-100和30mm咪唑，ph7.9；

雜蛋白洗滌液：6m尿素、20mmtris-hcl、150mmnacl、0.1％β‐巰基乙醇和30mm咪唑，ph6.0；

變性蛋白洗脫液：6m尿素、20mmtris-hcl、150mmnacl和0.5m咪唑，ph4.5。

同時(shí)，通過相同的方法純化trx重組蛋白。

3.大黃魚il-17c2重組蛋白透析

純化后大黃魚il-17c2重組蛋白用依次用緩沖液1、緩沖液2和緩沖液3透析，每步不低于4h。透析后，4℃，12000r/min離心30min去除沉淀，同時(shí)通過相同的方法透析trx重組蛋白。取少量進(jìn)行sds-page電泳分析，結(jié)果顯示得到了純度較高的大黃魚il-17c2重組蛋白(參見圖2)，剩余的保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

透析緩沖液配方：

緩沖液1：3m尿素、20mmtris-hcl、150mmnacl、0.25m咪唑、0.1mm氧化型谷胱甘肽、0.5mm還原型谷胱甘肽、5％甘油和0.005％tween20；

緩沖液2：1m尿素、20mmtris-hcl、150mmnacl、0.125m咪唑、0.1mm氧化型谷胱甘肽、0.5mm還原型谷胱甘肽、5％甘油和0.005％tween20；

緩沖液3：20mmtris-hcl、150mmnacl和5％甘油。

四、大黃魚il-17c2重組蛋白對大黃魚外周血白細(xì)胞中免疫基因的調(diào)節(jié)作用分析

(1)將大黃魚外周血白細(xì)胞以1×10⁶個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2mlleibovitz'sl15培養(yǎng)基(gibico公司)，于25℃生化培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；

(2)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入大黃魚il-17c2重組蛋白至終濃度為50ng/ml，分別于處理后6、12、24和48h收集細(xì)胞培養(yǎng)物，使用微量rna提取試劑盒(svtotalrnaisolationsystem，promega公司)提取細(xì)胞總rna，并按照逆轉(zhuǎn)錄酶m-mlv(rnaseh-，takara公司)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄pcr。同時(shí)，設(shè)置trx重組蛋白處理的細(xì)胞為陰性對照組。

(3)通過實(shí)時(shí)熒光定量pcr(real-timepcr)檢測趨化因子(cxcl8、cxcl12、cxcl13)、促炎因子(tnf-α、il-1β、il-6、ifng)及抗菌肽hepcidin在大黃魚外周血白細(xì)胞中的表達(dá)水平。real-timepcr于mastercyclerepgradientrealplex4熒光定量pcr儀(eppendorf公司)進(jìn)行反應(yīng)，條件如下：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，58℃退火15s，72℃延伸15s并獲取熒光，40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因。各基因引物如表1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-^δδct法進(jìn)行分析。結(jié)果顯示大黃魚il-17c2重組蛋白可顯著上調(diào)大黃魚外周血白細(xì)胞中趨化因子(cxcl8、cxcl12、cxcl13)、促炎因子(tnf-α、il-1β、il-6、ifng)及抗菌肽hepcidin等基因的表達(dá)，上述基因的表達(dá)量約上升了10～30倍。

大黃魚il-17c2重組蛋白對大黃魚外周血白細(xì)胞中下游基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用參見圖3，50ng/ml的大黃魚il-17c2重組蛋白處理大黃魚外周血白細(xì)胞6、12、24和48h后，收集處理細(xì)胞并利用real-timepcr檢測其中趨化因子(cxcl8、cxcl12、cxcl13)、促炎因子(tnf-α、il-1β、il-6、ifng)及抗菌肽hepcidin的基因變化水平。對照蛋白為50ng/ml的trx重組蛋白。以大黃魚β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，標(biāo)準(zhǔn)化上述基因的相對表達(dá)量。上述基因的倍數(shù)變化為大黃魚il-17c2重組蛋白處理外周血白細(xì)胞中標(biāo)準(zhǔn)化的基因相對表達(dá)量除以trx重組蛋白處理細(xì)胞中標(biāo)準(zhǔn)化的基因相對表達(dá)量。

五、大黃魚il-17c2重組蛋白參與調(diào)節(jié)大黃魚外周血白細(xì)胞的趨化作用

參照transwell法(harunn.o.,zouj.,zhangy.a.,niep.,secombesc.j.,2008.thebiologicaleffectsofrainbowtrout(oncorhynchusmykiss)recombinantil-8[j].dev.comp.immunol.32,673-681)對大黃魚il-17c2重組蛋白體外趨化活性進(jìn)行分析：

表1real-timepcr實(shí)驗(yàn)所需引物序列

(1)將大黃魚外周血白細(xì)胞以1×10⁶個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2mll15培養(yǎng)基，于25℃生化培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)；

(2)將所獲得的大黃魚il-17c2重組蛋白經(jīng)過0.22μm濾膜過濾除菌后，加入細(xì)胞培養(yǎng)基中至終濃度為50ng/ml，于處理后24h收集細(xì)胞培養(yǎng)基，并以600g離心力于4℃離心10min，取上清；

(3)將離心后的培養(yǎng)基上清液加入到corning公司的transwell下層小室中，每孔500μl。對照為500μl的trx重組蛋白處理的大黃魚外周血白細(xì)胞培養(yǎng)基，以及含50ng/ml的大黃魚il-17c2重組蛋白或trx重組蛋白的l15培養(yǎng)基。每組設(shè)置3個(gè)平行樣。然后向transwell上層小室加入分離的大黃魚外周血白細(xì)胞100μl(細(xì)胞數(shù)量約為10⁵個(gè))，將transwell板置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，收集下層小室中的細(xì)胞，計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示大黃魚il-17c2重組蛋白處理的外周血白細(xì)胞培養(yǎng)基對大黃魚白細(xì)胞具有明顯的趨化活性，趨化的大黃魚白細(xì)胞數(shù)約為2.5×10⁴個(gè)。而大黃魚il-17c2重組蛋白對大黃魚白細(xì)胞則無明顯的趨化活性(圖4)，表明大黃魚il-17c2參與增強(qiáng)對大黃魚白細(xì)胞的趨化作用。

序列表

<110>國家海洋局第三海洋研究所

<120>大黃魚白細(xì)胞介素17c2基因大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物及其制備方法與應(yīng)用

<130>1

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>897

<212>dna

<213>大黃魚<larimichthyscrocea>

<400>1

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