本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一株豬鏈球菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬鏈球菌(streptococcussuis,ss)是國(guó)家規(guī)定的一種二類動(dòng)物疫病，它是一類人畜共患的急性、熱性的傳染性疾病，是引起豬鏈球菌病的主要病原，主要引起豬腦膜炎以及敗血癥等疫病。根據(jù)豬鏈球菌的莢膜多糖抗原可將之分為35個(gè)血清型，即1～34型和1/2型。對(duì)豬致病性較強(qiáng)的是1型、2型、1/2型、7型和9型。其中豬鏈球菌2型是流行最廣、致病性最強(qiáng)的血清型，其次是9型、7型、1型。近幾年來(lái)，豬2型鏈球菌引起的豬鏈球菌病呈上升趨勢(shì)。該病以急性敗血癥為主，發(fā)病急，死亡快，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并且豬2型鏈球菌可以引起了人的感染和死亡。另外，該病經(jīng)常與豬圓環(huán)病毒、豬繁殖與呼吸綜合征、豬的附紅細(xì)胞體病以及非典型豬瘟混合感染，所以一旦發(fā)生此病將很難控制，從而給養(yǎng)殖戶造成重大經(jīng)濟(jì)財(cái)產(chǎn)損失，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展帶來(lái)巨大的困難。因此該病的研究對(duì)畜牧業(yè)及公共衛(wèi)生業(yè)上均有重要意義。

國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為豬鏈球菌的致病性與其毒力因子有密切關(guān)系，目前研究較多的豬鏈球菌主要毒力因子有莢膜多糖(capsularpolysaccharide，cps)、溶菌酶釋放蛋白(muramidase-releasedprotein，mrp)、胞外因子(extracellularproteinfateror，ef)和溶血素(suilysin，sly)。在先研發(fā)的很多藥物對(duì)豬鏈球菌病都能起到很好的治療效果，但是隨著養(yǎng)殖規(guī)模發(fā)展，大量抗菌藥物的使用，休藥期藥物的不合理使用，都造成病原菌的耐藥現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重，越來(lái)越不利于臨床疾病的預(yù)防和治療。因此亟需研發(fā)一種新的具有較好免疫原性的菌株制備的疫苗。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一株豬鏈球菌及其應(yīng)用，該菌株毒力強(qiáng)，制備的疫苗免疫性好。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一株豬鏈球菌，所述的豬鏈球菌為豬鏈球菌(streptococcussuis)hnss1，保藏編號(hào)：cgmccno：13334，保藏日期：2016年11月22日，保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。

所述的豬鏈球菌為豬鏈球菌2型。

一種豬鏈球菌在制備豬鏈球菌滅活疫苗方面的應(yīng)用。

所述的豬鏈球菌滅活疫苗中，豬鏈球菌菌量為1×10⁹cfu/ml。

所述的豬鏈球菌滅活疫苗的制備方法為：將所述的豬鏈球菌依次經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、收獲和滅活得到疫苗原液后，加入佐劑即得疫苗。

所述的佐劑為氫氧化鋁佐劑。

所述的豬鏈球菌滅活疫苗的制備方法為：將豬鏈球菌接種到tsb液體培養(yǎng)基，置于37℃搖床中培養(yǎng)，18h后收取培養(yǎng)物，測(cè)定濃度，調(diào)整培養(yǎng)物中的菌數(shù)為2×10⁹cfu/ml，加入甲醛至終濃度為0.2％，于37℃滅活12h；滅活后的培養(yǎng)物按體積比1:1加入氫氧化鋁佐劑，混合制得豬鏈球菌滅活疫苗。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明中的菌株hnss1分離自發(fā)生典型呼吸道癥狀及神經(jīng)癥狀死亡的保育豬的腦組織，在tsa固體培養(yǎng)基上分離時(shí)無(wú)其它細(xì)菌生長(zhǎng)，只有豬鏈球菌生長(zhǎng)，在tsb液體培養(yǎng)基中增殖滴度高，達(dá)10⁹cfu/ml以上。

2、本發(fā)明中的菌株hnss1對(duì)保育豬具有較強(qiáng)的致病力，引起保育豬發(fā)病死亡，具有良好的免疫原性。

3、根據(jù)本發(fā)明中的菌株hnss1制備的疫苗對(duì)豬的豬鏈球菌病具有較好的保護(hù)效果。

附圖說(shuō)明

圖1為菌株hnss1菌落形態(tài)。

圖2為菌株hnss1菌體革蘭氏染色100×顯微鏡下形態(tài)。

圖3為菌株hnss1的pcr鑒定結(jié)果，圖中的marker為dl2000bp，從上到下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；1為引物ss1，ss2擴(kuò)增gdh基因結(jié)果；2為引物ss3，ss4擴(kuò)增cps2j基因結(jié)果；3為引物mrp1，mrp2擴(kuò)增mrp基因結(jié)果；4為引物sly1，sly2擴(kuò)增sly基因結(jié)果；5為引物epf1，epf2擴(kuò)增epf基因結(jié)果。從圖可以看出，所分離株鑒定為2型豬鏈球菌，并且毒力因子的基因型為sly⁺mrp⁺epf⁺。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1、豬鏈球菌的分離和鑒定

1.1病料采集

病料來(lái)自于2016年11月在河南省?？h某大型養(yǎng)豬場(chǎng)發(fā)生重癥肺炎呼吸困難及神經(jīng)癥狀死亡的2月齡保育豬。

1.2培養(yǎng)基的制備

tsb液體培養(yǎng)基：將tsb肉湯粉(trypticsoybroth，胰蛋白胨大豆肉湯)30g，溶于1000ml超純水中，115℃滅菌15min，加胎牛血清50ml、無(wú)菌1％nad(nicotinamideadeninedinucleotide，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，輔酶ⅰ)1ml。

tsa固體培養(yǎng)基：將tsa瓊脂粉(trypticsoyagar，胰蛋白胨大豆瓊脂)40g，溶于1000ml超純水中，115℃滅菌15min，加胎牛血清50ml、無(wú)菌1％nad1ml；于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3菌株的分離培養(yǎng)

無(wú)菌采集病豬的腦組織接種于含有nad的tsa固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，長(zhǎng)出一致的針尖狀大小、在血平板上單個(gè)菌落0.5～1mm、灰白色半透明，圓形、光滑、邊緣整齊的呈α溶血(見(jiàn)圖1)。純化接種后，進(jìn)行革蘭氏染色(見(jiàn)圖2)，該菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，圓形或卵圓形，鏈狀排列或成雙，鏈的長(zhǎng)短不一，命名為菌株hnss1。

1.4菌株的鑒定

1.4.1設(shè)計(jì)引物

根據(jù)豬鏈球菌gdh基因的序列設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物，用于豬鏈球菌的擴(kuò)增，引物序列如下：

ss1：5’-gcagcgtattctgtcaaacg-3’(seqidno.1)

ss2：5’-ccatggacagataaagatgg-3’(seqidno.2)

擴(kuò)增片段大小為689bp。

根據(jù)豬鏈球菌cps2j基因的序列設(shè)計(jì)一對(duì)豬鏈球菌2型的特異性引物，用于豬鏈球菌2型的擴(kuò)增，引物序列如下：

ss3：5’-tgatagtgatttgtcgggaggg-3’(seqidno.3)

ss4：5’-gagtatctaaagaatgcctattg-3’(seqidno.4)

擴(kuò)增片段大小為557bp。

根據(jù)豬鏈球菌胞外因子(epf)基因的序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用于豬鏈球菌胞外因子(epf)基因的擴(kuò)增，引物序列如下：

epf1：5’-gctacgacggcctcagaaatc-3’(seqidno.5)

epf2：5’-tggatcaaccactggtgttac-3’(seqidno.6)

擴(kuò)增片段大小為626bp。

根據(jù)豬鏈球菌溶菌酶釋放蛋白(mrp)基因的序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用于豬鏈球溶菌酶釋放蛋白(mrp)基因的擴(kuò)增，引物序列如下：

mrp1：5’-atcagaatcaccacttttgg-3’(seqidno.7)

mrp2：5’-tcatacccagtaaatacacg-3’(seqidno.8)

擴(kuò)增片段大小為885bp。

根據(jù)豬鏈球菌溶血素(sly)基因的序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用于豬鏈球溶血素(sly)基因的擴(kuò)增，引物序列如下：

sly1：5’-atgagaaaaagttcgcacttgatt-3’(seqidno.9)

sly2：5’-ttgccagattactctatca-3’(seqidno.10)

擴(kuò)增片段大小為1502bp。

1.4.2pcr鑒定

按照dna提取試劑盒的操作步驟提取出菌株hnss1的dna，分光光度計(jì)測(cè)定濃度為100μg/ml，進(jìn)行pcr鑒定。

pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μl：10×緩沖液2.5μl，2.5mm(each)dntpsmix0.5μl，10μm/l通用引物ss1，ss2各1μl，5u/μlrtaq1μl，100μg/mldna模板1μl，加入ddh2o至25μl。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，進(jìn)入循環(huán)：95℃1min，57℃1min，72℃30s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，pcr產(chǎn)物4℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳，每孔加樣10μl，1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察結(jié)果(見(jiàn)圖3)。結(jié)果擴(kuò)增出689bp片段，測(cè)序與豬鏈球菌ss2-1株(genbankno：cp018908)100％同源，測(cè)序結(jié)果如下，證明菌株hnss1為豬鏈球菌(streptococcussuis)。

gcagcgtattctgtcaaacgagcgcggcgtttttctttgatgtccaccaagaggtcgaagtcgataccagtttcgtcaatgatgtaaccatttgagtctgaaacagaaataacttttgcaccaagttcagtcgctttttgaacagcatattgggcaacgttaccagaacctgagataaggacagtttggtctttgaaggatttaccgtttgctgccaacatgttatcagtgaagtaaaccaaaccgtaaccagttgcttctgggcggatcaatgaaccaccgaagccaagaggtttaccagtcaagacacctgcatcaaactggcggaggcgtttgtattgaccgtacatgtaaccgatctcacgaccaccgacaccgatgtcaccagcagggacgtcaagtgaaggtccgatgtgtttttgcaattcagtcatgaagctttggcagaagcgcatgatttcagcatcagtttttcctttaggatcaaagtctgaaccacctttaccaccgccgattggaagaccagtcaagacgtttttgaagatttgctcaaaaccgaggaacttcaagatggattggtttacagttgggtggaagcgaagaccgcctttataaggacctacagctgagttgaactgaacacggtagccacggttgacttgaacatttccatctttatctgtccatgg(seqidno.11)

1.4.3血清型鑒定

參照1.4.2方法，用豬鏈球菌2型的特異性引物ss3，ss4擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出557bp大小片段(見(jiàn)圖3)，測(cè)序與豬鏈球菌ss2-1株(genbankno:cp018908)100％同源，證明菌株hnss1為2型豬鏈球菌。

1.4.4毒力因子鑒定

參照1.4.2方法，用豬鏈球菌豬鏈球菌胞外因子(epf)基因、溶菌酶釋放蛋白(mrp)基因、溶血素(sly)基因引物擴(kuò)增，結(jié)果分別擴(kuò)增出626bp、885bp、1502bp大小片段，測(cè)序與豬鏈球菌ss2-1株(genbankno：cp018908)100％同源，證明所分離的2型豬鏈球菌的毒力因子的基因型為sly⁺mrp⁺epf⁺。

1.5毒力試驗(yàn)

試驗(yàn)動(dòng)物為4～7周齡斷奶健康的保育豬10只。試驗(yàn)動(dòng)物分為兩組，對(duì)照組5只，試驗(yàn)組5只。將hnss1接種tsb液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)18h后，測(cè)定菌體濃度，連續(xù)10倍稀釋涂布固體平板，低倍鏡下活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算原液菌體濃度，為2.5×10⁹cfu/ml，再調(diào)整至10⁸cfu/ml，試驗(yàn)組動(dòng)物通過(guò)頸部肌肉注射接種3ml豬鏈球菌液體培養(yǎng)物，對(duì)照組動(dòng)物通過(guò)頸部肌肉注射接種3ml滅菌的tsb液體培養(yǎng)基。注射后連續(xù)觀察2周，觀察并記錄其發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)等情況。

試驗(yàn)組動(dòng)物在接種豬鏈球菌24h后表現(xiàn)出明顯高熱、關(guān)節(jié)腫、角弓反張、四肢劃水、呼吸困難、鼻孔流血等癥狀，3天內(nèi)全部死亡。對(duì)照組動(dòng)物在試驗(yàn)期間體溫正常且無(wú)明顯的呼吸道癥狀。試驗(yàn)結(jié)束后剖殺試驗(yàn)組動(dòng)物，同時(shí)剖殺4頭對(duì)照組動(dòng)物。采集病料，進(jìn)行豬鏈球菌分離。試驗(yàn)組剖檢肺出血腫大，關(guān)節(jié)積液，腦部出血。對(duì)照組剖檢均未發(fā)生明顯的病理變化，對(duì)照組的4份病料均未分離到豬鏈球菌，試驗(yàn)組的4份病料中均分離到豬鏈球菌，pcr鑒定結(jié)果與hnss1一致。

實(shí)施例2、疫苗的制備、安全性和效力試驗(yàn)

2.1疫苗的制備

將豬鏈球菌菌株hnss1接種到tsb液體培養(yǎng)基，置于37℃搖床中培養(yǎng)，18h后收取培養(yǎng)物，測(cè)定濃度，調(diào)整培養(yǎng)物中的菌數(shù)為2×10⁹cfu/ml，加入甲醛至終濃度為0.2％，于37℃滅活12h。滅活后的培養(yǎng)物按體積比1:1加入氫氧化鋁佐劑，混合制得豬鏈球菌滅活疫苗。

2.2疫苗的安全性試驗(yàn)

選取14日齡健康保育豬10頭，分為2組，每組5頭。疫苗組：頸部肌肉注射4ml本疫苗；對(duì)照組：頸部肌肉注射4ml滅菌生理鹽水。測(cè)定動(dòng)物體溫，觀察臨床表現(xiàn)，共觀察2周。觀察期間，疫苗組和對(duì)照組的保育豬在整個(gè)觀察期間呼吸、食欲、精神狀態(tài)都正常，說(shuō)明本發(fā)明的滅活疫苗安全。

2.3疫苗的效力試驗(yàn)

選取2周齡健康仔豬30頭，分為6組，每組5頭。具體為：疫苗1-4組：每組分別注射本疫苗0.5ml、1ml、1.5ml和2ml，第5組為未免疫組，第6組為健康對(duì)照組，注射2ml滅菌生理鹽水。疫苗組和健康對(duì)照組3周后二免注射同等劑量的疫苗或滅菌生理鹽水。二免后14天各組用10⁹cfu的hnss1菌液采取滴鼻攻毒。觀察仔豬的臨床表現(xiàn)，并每日測(cè)定體溫，共觀察2周。對(duì)死亡豬肺臟等器官進(jìn)行傳染性胸膜肺炎放線桿菌分離培養(yǎng)。

觀察結(jié)果：疫苗組與未免疫組有明顯的差異，攻毒后第二天，未免疫組開(kāi)始出現(xiàn)臨床癥狀，體溫升高，呼吸困難，角弓反張，第三天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，1周內(nèi)5頭全部死亡。剖檢死亡豬肺臟腫大淤血或出血，關(guān)節(jié)積液，腦膜出血。健康對(duì)照組的仔豬均未發(fā)病。而疫苗組中，0.5ml疫苗組的5頭仔豬中有3頭出現(xiàn)臨床癥狀和病例變化；1ml疫苗組的5頭仔豬中有2頭出現(xiàn)臨床癥狀和病例變化；1.5ml疫苗組的5頭仔豬中有1頭出現(xiàn)臨床癥狀和病例變化；2ml疫苗組的5頭仔豬沒(méi)有發(fā)病。免疫攻毒保護(hù)情況見(jiàn)下表。

注：“—”表示不適用。

由上表可以看出，本疫苗的最小免疫保護(hù)劑量為0.5ml含菌量為1×10⁹cfu/ml。說(shuō)明本發(fā)明的滅活苗具有良好的保護(hù)效果。

以上所述僅為本發(fā)明最佳的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所

<120>一株豬鏈球菌及其應(yīng)用

<160>11

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gcagcgtattctgtcaaacg20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ccatggacagataaagatgg20

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<212>dna

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<400>3

tgatagtgatttgtcgggaggg22

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<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gagtatctaaagaatgcctattg23

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<212>dna

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gctacgacggcctcagaaatc21

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<212>dna

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tggatcaaccactggtgttac21

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atcagaatcaccacttttgg20

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tcatacccagtaaatacacg20

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<212>dna

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atgagaaaaagttcgcacttgatt24

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<212>dna

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ttgccagattactctatca19

<210>11

<211>689

<212>dna

<213>豬鏈球菌（streptococcussuis）

<400>11

gcagcgtattctgtcaaacgagcgcggcgtttttctttgatgtccaccaagaggtcgaag60

tcgataccagtttcgtcaatgatgtaaccatttgagtctgaaacagaaataacttttgca120

ccaagttcagtcgctttttgaacagcatattgggcaacgttaccagaacctgagataagg180

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