本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別是涉及一種雙向伯克霍爾德氏菌及其復(fù)合生物制劑的制備及應(yīng)用。

技術(shù)背景

目前對伯克霍爾德氏菌屬(burkholderia)的研究已較多，主要集中在應(yīng)用該屬內(nèi)的菌株產(chǎn)生酶或用于治理環(huán)境污染，如以下專利文獻：公開號1195373(日本，中山美香等，公開日2004/03/24)的降解鹵代烴的微生物及應(yīng)用；公開號1484703(日本，早出廣司，公開日2004/03/24)的葡萄糖脫氫酶和生產(chǎn)該脫氫酶的方法；公開號1867676(日本，山口將憲等，公開日2006/11/22)的鯊肌醇的制備方法；公開號101198695(德國，貝賽林等，公開日2008/06/11)的生產(chǎn)脂肪酶的方法；公開號101153272(中國，盛下放等，公開日2008/04/02)的一種鉛鎘抗性細菌及其用于土壤重金屬污染的植物修復(fù)方法；公開號102046778a(日本，古賀一治、增田紳吾，公開日2011/05/04)的降低植物體中的重金屬含量的細菌；公開號101671636(中國，郭軍康等，公開日2010/03/17)的一種抗重金屬植物促生菌制劑及其施用方法。但以上文獻都沒有涉及到植物病原菌生物防治的相關(guān)應(yīng)用。

在植物病害的生物防治方面，任嘉紅等發(fā)現(xiàn)吡咯伯克霍爾德氏菌jk-sh007對楊樹潰瘍病具有防治效果(任嘉紅等，吡咯伯克霍爾德氏菌jk-sh007抗菌蛋白的分離純化，微生物學通報，2010-06-20；任嘉紅等，吡咯伯克霍爾德氏菌jk-sh007的發(fā)酵條件及其對楊樹潰瘍病的防治效果，中國生物防治，2010-08-08；葉建仁等，一種吡咯伯克霍爾德氏菌及其在防治楊樹潰瘍病中的應(yīng)用，中國專利，2009-10-14；)；查傳勇發(fā)現(xiàn)雙向伯克霍爾德氏菌lu10-1能夠產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)(查傳勇等，雙向伯克霍爾德氏菌lu10-1產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化，蠶業(yè)科學，2009-06-15)；林善海等發(fā)現(xiàn)伯克霍爾德氏菌對香蕉褐緣灰斑病具有防治效果(林善海等，拮抗伯克霍爾德氏菌對香蕉褐緣灰斑病的生物防治試驗，中國植物病理學會2007年學術(shù)年會論文集，2007-08-01)。

此外，本申請的申請人多年來對伯克霍爾德氏菌研究較為深入，例如申請人本人于2013年7月30日申請了相關(guān)專利201310326671.2，其中涉及保藏編號為cctccno:m2013145；該菌株是申請人發(fā)現(xiàn)的雙向伯克霍爾德氏菌一代菌株，盡管其發(fā)酵物在防治病原真菌或病原細菌類病害具有一定的效果，然而申請人仍希望分離或篩選出更優(yōu)良的菌株，以及采用更有效的方法培養(yǎng)出抗菌效果更優(yōu)的抗菌劑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對植物病原真菌引起的植物病害提供一種生防菌株，以及在該菌株基礎(chǔ)上制備高效的復(fù)合生物制劑的方法，以及相應(yīng)的復(fù)合生物制劑產(chǎn)品。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的：

一種雙向伯克霍爾德氏菌，其特征在于，該菌種分類命名為雙向伯克霍爾德氏菌(burkholderiaambifaria)，已于2016年10月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通生物中心，其地址位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為cgmccno.13140。

本發(fā)明所涉及的上述雙向伯克霍爾德氏菌菌株的16srdna序列如附件所示。

進一步地，本發(fā)明提供上述雙向伯克霍爾德氏菌在制備防治植物病原真菌引起的植物病害抗菌劑中的應(yīng)用。

所述植物病原真菌為核桃炭疽病菌(glieosporiumrugonmculans(berk)thtim)、油菜菌核(sclerotiniasclerotiorum(lib.)debary)、草莓灰霉(strawberrygraymould)、小麥赤霉(fusahumgraminearumsehw)、番茄灰霉(botrytiscinerea)。

進一步地，本發(fā)明提供一種制備植物病害抗菌劑的方法，其特征在于，該方法在于將所述雙向伯克霍爾德氏菌接入改進的lb液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，其特征在于培養(yǎng)條件如下：按照5％的接種量，將24～36h菌齡的種子接種于裝有100mllb液體發(fā)酵液的500ml三角瓶中，以180r/min在25℃條件下培養(yǎng)36h；所述改進lb培養(yǎng)基配方為(g/l)：葡萄糖30、蛋白胨15、牛肉膏5、硫酸鎂0.5、氯化鈉1、磷酸氫二鉀5、水1l，ph7.0～7.2。發(fā)酵結(jié)束后通過離心或者板框過濾獲得微生物菌體，然后使用硅藻土吸附來制備菌劑，所述微生物菌體與硅藻土的體積比為1:5-10。

優(yōu)選地，微生物菌體與硅藻土二者的體積比為1:6。

進一步地，本發(fā)明提供一種新型復(fù)合生物制劑，其特征在于，所述復(fù)合生物制劑包括上述抗菌劑與5％的苦參堿混合；二者的重量比為2:1-1:3。

優(yōu)選地，二者的重量比為1:2。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1、相比在先專利201310326671.2，本專利涉及的生防菌cgmccno.13140分離于健康果實表面，屬于植物表面定殖的益生菌，作為生防菌更加安全可靠；

2、菌株cgmccno.13140來源于健康植物表面，因此，該菌株作為生防菌在防治過程中更易定殖于果實和植株表面，能夠起到長效防治的效果；

3、本專利選用植物源的苦參堿與其菌劑復(fù)合組成強效生物制劑，相比于單一的微生物制劑，混合生物制劑的抑菌譜更廣，且兼容了苦參堿速效防治效果和微生物制劑長效防治的特點，抑菌效果顯著提高。本復(fù)合生物制劑對番茄灰霉的抑制率為92.45％，對核桃炭疽病菌的抑制率為85％，對油菜菌核的防效為83％，對草莓灰霉的室內(nèi)生防效果也達78％，此外，對小麥赤霉、香蕉炭疽病、荔枝霜疫霉病等均具有良好的防效；

4、相比在先專利201310326671.2中所涉及到的保藏編號為cctccno:m2013145的雙向伯克霍爾德氏菌而言，二者的來源不同，在先專利從土壤中分離；此外二者能有效防治的對象也不同，本發(fā)明所分離的菌株具有更好的應(yīng)用前景。

附圖說明：

圖1：生防菌伯克霍爾德氏菌菌落形態(tài)照片

圖2：生防菌伯克霍爾德氏菌顯微照片

圖3：生防菌伯克霍爾德氏菌16srrna測序序列

圖4：生防菌伯克霍爾德氏菌的進化樹

圖5：生防菌伯克霍爾德氏菌對多種植物病原真菌的抑制

圖6：生防菌伯克霍爾德氏菌劑對番茄灰霉的抑制

圖7：生防菌劑與苦參堿組成復(fù)合生物制劑與單純菌劑對番茄灰霉的平板抑制比較

圖8：生防菌劑與苦參堿組成的復(fù)合生物制劑對番茄灰霉的抑制的植物離體實驗

具體實施方式

實施例1：保藏編號為cgmccno.13140的特定雙向伯克霍爾德氏菌菌株的篩選及鑒定

1、菌株的篩選

(1)果實樣品的采集

以陜西省洛川縣為基地，選擇樹齡較小的蘋果示范園，挑選樹勢旺盛的植株，選取健康蘋果采摘，用無菌袋裝好后帶回實驗備用。

(2)植物表面微生物富集

將新鮮采集的蘋果，在超凈工作臺里用無菌水清洗表面，將清洗表面的水加入lb液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，富集培養(yǎng)48h。然后將富集好的發(fā)酵液逐級稀釋，分別選擇10^-2,10^-4,10^-5稀釋液作為分離源。

(3)分離方法

吸取100μl稀釋液到預(yù)先倒好的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的90mm培養(yǎng)皿中，用滅菌的玻璃刮刀涂布均勻，待晾干，作好標記和日期，培養(yǎng)皿倒置，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間24h，將平板上長出的單菌落挑出后到新的培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，對全部分離獲得的菌株進行編號，然后，以植物病原真菌為指示菌進行拮抗活性的初篩和復(fù)篩。

(4)拮抗劑的初篩和復(fù)篩

初篩方法：將分離獲得的菌株進行發(fā)酵，離心獲得發(fā)酵液。按照5％，將發(fā)酵液加入到pda，待凝固后，在pda平板中央接種病原指示菌，以不加發(fā)酵液的pda平板接種病原指示真菌作為對照，培養(yǎng)5d，測量指示菌菌落，篩選具有抑制效果的。

復(fù)篩方法：用打孔器在培養(yǎng)好的番茄灰霉和草莓灰霉等病原真菌的菌落邊緣打孔取直徑5mm的菌塊，接種到pda平板中央，再將初篩獲得菌株活化后接種于番茄灰霉和草莓灰霉的菌絲體周圍2～3cm處，每個處理3次重復(fù)。在25～30℃下培養(yǎng)3d，然后測量待測菌株與病原真菌之間的抑菌帶寬寬度，作為拮抗活性強弱的指標。

經(jīng)過上述初篩和復(fù)篩，獲得一株對番茄灰霉和草莓灰霉等多種病原菌具有強烈抑制作用的菌株，編號為snnh-08。

2、菌株鑒定

形態(tài)鑒定：在lb培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h，菌落為圓形，乳白色，邊緣完整，凸起，菌落不透明，如圖1所示。顯微照片顯示，該菌為小桿狀，如圖2所示。

分子生物學鑒定：dna提取采用試劑盒。pcr選用通用引物27f5′-agagtttgatcctggctcag-3′,1504r5′-aaggaggtgatccagccgca-3′。測序工作由華大基因(北京)有限公司完成，得到的序列長度為1395bp，如圖3所示。將所測的16srrna序列采用clustalx1.83軟件對菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析,采用鄰接法(neighbor-joining)法,用mega5.05構(gòu)建供試菌株和實驗菌株之間的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖4所示。該菌株與burholderiaambifariaammd(af043302)具有最高的相似性。

實施例2、本發(fā)明菌株對多種植物病原真菌的抑制作用

(1)供試菌株

供試病原真菌分別選擇核桃炭疽病菌(glieosporiumrugonmculans(berk)thtim)、油菜菌核(sclerotiniasclerotiorum(lib.)debary)、草莓灰霉(strawberrygraymould)、小麥赤霉(fusahumgraminearumsehw)、番茄灰霉(botrytiscinerea)。這些病原真菌都是由發(fā)病植株分離且鑒定過。

(2)對多種植物病原真菌的抑制作用

將活化24h的雙向伯克霍爾德氏菌(burkholderiaambifaria)cgmccno.13146接種于裝有100ml改進lb液體發(fā)酵培養(yǎng)液中，培養(yǎng)溫度35℃，200rpm恒溫搖床培養(yǎng)36h；

試驗組：將獲得的發(fā)酵液按照5％的量加入45～50℃的pda培養(yǎng)基中，待凝固后，在pda平板中央接種預(yù)先活化好的各種病原真菌，28℃，培養(yǎng)3d，測定菌落直徑dsy；

空白組：直接將活化好的病原真菌接種于pda平板中央，28℃培養(yǎng)3d，測定菌落直徑dck；

抑制率計算：

抑制率(％)＝(dck-dsy)×100/dck

本發(fā)明菌株對多種植物病原真菌和細菌的抑制效果(如圖5所示)

綜上所述，本發(fā)明菌株對多種重要的植物病原真菌均具有抑制作用，為廣譜拮抗菌，可用于防治多種植物病害，尤其是對番茄灰霉的防治效果最佳。

(3)本發(fā)明菌株對番茄灰霉的拮抗效果(如圖6所示)

將預(yù)先活化好的植物病原真菌用無菌打孔器打孔，挑取一小塊菌塊接種于預(yù)先倒好的pda平板上。將生防菌接種于pda平板的兩邊，28℃培養(yǎng)3d，如圖6所示。結(jié)果可以看出，雙向伯克霍爾德氏菌對番茄灰霉具有很好的拮抗作用。

實施例3本發(fā)明微生物復(fù)合菌劑的制備

(1)固體斜面菌種的制備

將雙向伯克霍爾德氏菌(burkholderiaambifaria)接種于營養(yǎng)瓊脂(na)斜面培養(yǎng)基上，于37℃恒溫靜置培養(yǎng)24h備用。

所用的na培養(yǎng)基配方(g/l)：蛋白胨10，牛肉膏粉3，氯化鈉5，瓊脂15，蒸餾水1000ml，ph7.3。121℃，滅菌20min。

(2)搖瓶液體種子制備

取上述活化好的斜面種子一環(huán)，接種于裝有50ml液體發(fā)酵液的250ml的搖瓶中，于37℃，200rpm，恒溫搖床培養(yǎng)24h，獲得搖瓶種子。

搖瓶種子培養(yǎng)基配方(g/l)：葡萄糖20,蛋白胨10，牛肉膏5，氯化鈉1，蒸餾水1000ml，ph7.4,121℃，滅菌20min。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)

按照5％的接種量將上述獲得的搖瓶種子接種于裝有7l發(fā)酵培養(yǎng)液的10l發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度37℃，轉(zhuǎn)速400rpm，通氣量1vvm，發(fā)酵周期36h。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/l):葡萄糖30，蛋白胨15，牛肉膏5，硫酸鎂0.5，氯化鈉1，磷酸氫二鉀5，蒸餾水1000ml，ph7.2，121℃滅菌30min。

(4)菌體分離

按照上述發(fā)酵條件獲得的發(fā)酵液，通過離心機離心獲得菌體，離心機轉(zhuǎn)速為6000rpm。

(5)菌劑制備

將上述獲得的菌泥按照體積比1:6的比例與硅藻土混勻晾干，制備成固體菌劑。

(6)復(fù)合生物制劑制備

將上述獲得的固體菌劑按照1:2的重量比與5％的苦參堿混勻制成復(fù)合生物制劑。

實施例4本發(fā)明復(fù)合生物制劑與單純微生物菌劑對植物病原菌的抑制作用

1、復(fù)合生物制劑對番茄灰霉病抑制的平板試驗

將預(yù)先制備好的復(fù)合生物制劑(發(fā)酵液離心獲得菌泥之后，按照1:6的比例與硅藻土混勻晾干，并按照1:2的重量比與5％的苦參堿混勻柘城復(fù)合生物制劑。其中，活菌濃度為5×10¹⁰cfu/g)和單純菌劑(發(fā)酵液離心獲得菌泥之后，按照1:6的比例與硅藻土混勻晾干，其中，活菌濃度為8×10¹⁰cfu/g)制成100倍水溶液；((2)分別按照5％的加量將配置好的復(fù)合生物制劑和單純菌劑添加到50℃的pda培養(yǎng)基中，等待冷卻，對照組添加等量的無菌水，其中復(fù)合生物制劑為試驗組，單純菌劑為對照組。(3)將預(yù)先活化好的番茄灰霉接種于冷卻的pda培養(yǎng)基中央，28℃，恒溫培養(yǎng)3d，測定病原菌的直徑

結(jié)果如圖7所示，從左到右依次為空白組，對照組和試驗組。其中，單純菌劑制備的防效為75％，復(fù)合生物制劑的防效為88％。因此，相比于單純菌劑，復(fù)合生物制劑對番茄灰霉的抑制率顯著增強。

2、復(fù)合生物制劑對番茄灰霉病抑制的離體試驗

(1)挑選大小一致的番茄若干個，分成3份；

(2)將預(yù)先制備好的復(fù)合生物制劑和單純菌劑配制成100倍的水溶液；

(3)空白組：用水噴番茄；

試驗組：用復(fù)合生物制劑的100倍水溶液噴灑番茄；

對照組：用單純菌劑的100倍水溶液噴灑番茄

(4)接種病原菌，將預(yù)先活化好的番茄灰霉接種于處理過的番茄表面，于人工氣候箱培養(yǎng)3d，培養(yǎng)溫度28℃，濕度50％；

(5)防效評估，將上述接過病原菌的番茄培養(yǎng)3d，測定病原菌在番茄表面的菌落直徑。

抑制率(％)＝(dck-dsy)×100/dck

其中dck為對照組的病原菌直徑，dsy為試驗組的病原菌直徑。

結(jié)果如圖8所示，從左到右依次為空白組、對照組和試驗組。因此，可以看出，相比于單一菌體制劑，復(fù)合生物制劑對番茄灰霉的抑制效果顯著提高。其中，復(fù)合生物制劑對番茄灰霉的抑制率達到95％，而單一菌株制劑對番茄灰霉的抑制率為65％,抑制率增效145。

本發(fā)明的復(fù)合生物制劑已經(jīng)通過具體的實例進行了描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可借鑒本發(fā)明內(nèi)容，適當改變原料、工藝條件等環(huán)節(jié)來實現(xiàn)相應(yīng)的其它目的，其相關(guān)改變都沒有脫離本發(fā)明的內(nèi)容，所有類似的替換和改動對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，都被視為包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

gtgaccgtcctccttgcggttagactagccacttctggtaaaacccactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaagacccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcatgcactcgagttgcagagtgcaatccggactacgatcggttttctgggattagctccccctcgcgggttggcacaccctctgttccgaccattgtatgacgtgtgaagccctacccataagggccatgaggacttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctccttagagtgctcttgcgtagcaactaaggacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtgcgccggttctctttcgagcactcccacctctcagcaggattccgaccatgtcaagggtaggtaaggtttttcgcgttgcatcgaattaatccacatcatccaccgcttgtgcgggtccccgtcaattcctttgagttttaatcttgcgaccgtactccccaggcggtcaacttcacgcgttagctacgttactaaggaaatgaatccccaacaactagttgacatcgtttagggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgtgcatgagcgtcagtattggcccagggggctgccttcgccatcggtattcctccacatctctacgcatttcactgctacacgtggaattctacccccctctgccatactctagcctgccagtcaccaatgcagttcccaggttgagcccggggatttcacatcggtcttaacaaaccgcctgcgcacgctttacgcccagtaattccgattaacgctcgccaccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccggtgcttattcttccggtaccgtcatcccccggctagtattagaaccaaggatttctttccggacaaaagtgctttacaacccgaaggccttcttcacacacgcggcattgctggatcaggctttcgcccattgtccaaaattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggctggtcgtcctctcagaccagctactgatcgtcgccttggtaggcctttaccccaccaactagctaatcagccatcggccaaccctatagcgcgaggcccgaaggtcccccgctttcatccgtagatcgtatgcggtattaatccggctttcgccgggctatcccccactacaggacatgttccgatgtattactcacccgttcgccactcgccaccaggtgcaagcacccgtgctgccgt