技術領域：

本發(fā)明屬于生物工程技術領域，涉及工業(yè)微生物的育種，尤其是一種高產(chǎn)四甲基吡嗪的釀酒酵母及其構建方法。

背景技術：
：

近年來，人們對發(fā)酵食品，不僅注重口感與質(zhì)量，對它的健康功效也非常關注。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品白酒、食醋、醬油中都含有一定的吡嗪類物質(zhì)，不僅具有芳香性，同時具有擴張血管、改善血循環(huán)、護肝(防止酒精對胃黏膜和肝臟的損傷)等功能(釀酒科技，2013(9)：1-6)，而其中四甲基吡嗪的含量最高。2006年在首屆中國白酒與健康學術研討會上，吳建峰先生等人就提出了白酒中的微量成分四甲基吡嗪是有益人體健康的功能性因子，同時他們認為日常適量飲用白酒，酒中含有的四甲基吡嗪就可達到保健和一定程度的治療功效(釀酒，2006，33(6)：13-16)。四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，ttmp)，又稱川芎嗪，作為中藥材川芎根莖的主要活性生物堿成分，具有治療心腦血管疾病，抑制血小板集聚和保肝護肝的藥理作用。ttmp在白酒中具有較低的風味閾值，能對其他香味物質(zhì)起明顯的烘托疊加作用，豐滿白酒的香氣，其在酒體中含量達4-7mg/l，而且其蒸汽壓低、易揮發(fā)，因此在餾酒階段，就可以伴隨酒精一起餾出形成原酒，不需要添加特殊的加工與提取步驟。因此它不但對白酒的風味有重要的貢獻，同時也賦予了白酒有益健康的功能。

業(yè)內(nèi)學者普遍認同ttmp是白酒中重要的健康功能因子，而目前關于白酒中ttmp的相關研究，已成為研究白酒對人體健康作用的重要方向。徐巖等人新分離了一株枯草芽孢桿菌xz1124，能以葡萄糖、蔗糖、糖蜜以及豆餅粉為底物，通過發(fā)酵轉(zhuǎn)化葡萄糖或蔗糖及工業(yè)原料糖蜜和豆餅粉成為內(nèi)源前體乙偶姻，從而提高ttmp的產(chǎn)量。解決了微生物發(fā)酵生產(chǎn)ttmp中產(chǎn)物濃度低、需外源添加前體和前體利用率低的問題(中國專利，200810235366，2008-12-8)。朱兵峰等人則是分別篩選了一株枯草芽孢桿菌和三株地衣芽孢桿菌，在利用還原糖發(fā)酵過程中，通過弱酸脅迫和補加葡萄糖的策略，同時控制了兩個發(fā)酵階段的攪拌轉(zhuǎn)速，積累并提高了前體物質(zhì)乙偶姻的利用率(40.3％)，進而提高ttmp的產(chǎn)量(中國專利，2010102338685.5，2010-07-28)。吳群等人則是發(fā)明了一種以酒糟為原料，加入枯草芽孢桿菌，然后通過酸度調(diào)節(jié)并補加葡萄糖發(fā)酵積累乙偶姻，既防止了酒糟污染環(huán)境，又提升了ttmp的產(chǎn)量(中國專利，201210089617.7，2012-03-30)。目前對白酒中ttmp的研究大多集中在高產(chǎn)ttmp菌株的篩選上，篩選的菌株大多為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，這兩類菌株都是好氧菌種，且只有在ph接近中性的條件下才有較高的ttmp產(chǎn)量。而實際的白酒發(fā)酵過程是在厭氧和高酸度環(huán)境下進行的，這兩類菌種進入發(fā)酵窖池后其生長和代謝很快停止，使其應用受到了很大的限制。只有將這兩類菌種在發(fā)酵窖池外發(fā)酵培養(yǎng)才能生成較高的ttmp產(chǎn)量，因而這些方法一般僅適合于具有窖外堆積培養(yǎng)過程的醬香型白酒和芝麻香型白酒的生產(chǎn)。

釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)可在厭氧和耗氧條件下生長繁殖，且在厭氧條件下酒精發(fā)酵能力更強，同時具有耐酸的特點，它是各類發(fā)酵食品的主要功能菌。釀酒酵母酒精發(fā)酵過程中，ttmp的前體物質(zhì)乙偶姻是由纈氨酸代謝途徑產(chǎn)生的α-乙酰乳酸通過氧化脫羧反應生成雙乙酰后，再由雙乙酰還原酶作用合成的，但生成的乙偶姻會在2，3-丁二醇脫氫酶作用下被還原合成2，3-丁二醇。因此普通的釀酒酵母不會積累乙偶姻，最終在發(fā)酵食品中也不會合成較高ttmp含量。利用分子育種技術構建積累乙偶姻的釀酒酵母工業(yè)菌株，即可實現(xiàn)在酒精發(fā)酵的同時獲得較高的ttmp產(chǎn)量，對提高白酒等發(fā)酵食品行業(yè)的風味質(zhì)量和健康因子含量具有雙重意義。

技術實現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明解決的技術問題之一是提供一株高產(chǎn)四甲基吡嗪(ttmp)釀酒酵母。

所述出發(fā)酵母菌株為釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)cicc32315，保存于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，公眾可購買獲得。

所述工程菌在其它發(fā)酵性能不受影響的情況下，重組菌株比親本菌株的乙偶姻、ttmp含量分別提高了912.06％、314.43％。

所述釀酒酵母工程菌株具體可以通過向出發(fā)釀酒酵母菌株中完全敲除編碼2，3-丁二醇脫氫酶基因(bdh1)，同時在強啟動子pgk1作用下過表達雙乙酰還原酶基因(bdh2)來實現(xiàn)。

所述bdh1基因其geneid為：851239，核苷酸序列如序列表中seqno：1所示；

所述bdh2基因其geneid為：851238，核苷酸序列如序列表中seqno：2所示；

所述啟動子pgk1其geneid為：850370，核苷酸序列如序列表中seqidno：3所示；

上述插入或缺失等可以用常規(guī)的敲除方法獲得。這些方法已有許多文獻報道，如josephsambrook等的《分子克隆實驗指南》第二版，科學出版社，1995。也可用本領域已知的其它方法來構建基因突變的酵母菌。其中較優(yōu)的是通過完全敲除2，3-丁二醇脫氫酶基因(bdh1)并插入一個完整的雙乙酰還原酶基因(bdh2)獲得。該序列是缺失bdh1100％的編碼序列，同時增加了一個完整的bdh2編碼序列。這種通過完全敲除2，3-丁二醇脫氫酶編碼基因(bdh1)并完整過表達雙乙酰還原酶基因(bdh2)獲得的菌株不易產(chǎn)生回復突變，菌株的穩(wěn)定性比利用點突變等方法構建的菌株穩(wěn)定性更高，更有利于工業(yè)化應用。

本發(fā)明所提供的構建上述釀酒酵母工程菌的方法是，將pcr擴增質(zhì)粒獲得的重組基因盒片段，用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將其插入釀酒酵母，得到同源重組后的釀酒酵母基因工程菌株。

所述的重組質(zhì)粒yep-pb2k，是能夠完全敲除釀酒酵母的2，3-丁二醇脫氫酶編碼基因bdh1并插入一個完整的雙乙酰還原酶編碼基因bdh2的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明同時提供了一種專門用于鑒定所述在強啟動子pgk1作用下可過表達bdh2基因重組質(zhì)粒yep-pb2k的基因序列，該基因序列是以pk-u(seqno：4)和pk-d(seqno：5)為引物，以所述重組質(zhì)粒為模板，特異性片段擴增的引物序列為：

pk-u：5’-gcattttatccgtactcctg-3’

pk-d：5’-tgtcaatcctgccttcttcc-3’

擴增片段測序為一特異性序列，核苷酸序列如核序列表中seqno：6所示。

本發(fā)明同時提供了一種專門用于鑒定所述高產(chǎn)ttmp的釀酒酵母工程菌的基因序列，該基因序列是以一組b2-b1s-u(seqno：7)、b2-b1s-d(seqno：8)和二組b2-b1x-u(seqno：9)、b2-b1x-d(seqno：10)為引物，以所述高產(chǎn)ttmp的釀酒酵母工程菌株基因組為模板，進行pcr擴增，驗證重組菌株。引物序列為：

一組上游引物b2-b1s-u：5’-cgattgctgatggtggag-3’

一組下游引物b2-b1s-d：5’-ggttgtttatgttcggatg-3’

二組上游引物b2-b1x-u：5’-ttctatgttcgggttcag-3’

二組下游引物b2-b1x-d：5’-acgccatttatttcaggag-3’

一組的pcr產(chǎn)物經(jīng)0.8％的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條約1.2kb的特異性條帶，其大小與預期相當；二組的pcr產(chǎn)物經(jīng)0.8％的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條約1.7kb的特異性條帶，其大小與預期相當，說明重組基因盒片段已成功重組到釀酒酵母基因組中，重組釀酒酵母基因工程菌株構建成功。

本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果：

一是本發(fā)明構建的重組釀酒酵母工程菌所敲除的酵母2，3-丁二醇脫氫酶編碼基因為100％缺失，不易產(chǎn)生回復突變，并且重組菌株中的kanmx抗性基因已經(jīng)敲除，保證了菌株及發(fā)酵產(chǎn)品的安全性；二是本發(fā)明構建的重組釀酒酵母工程菌株能夠提高乙偶姻的生成量，進而提高四甲基吡嗪的生成量，而其它發(fā)酵性能沒有明顯變化，實現(xiàn)了在白酒發(fā)酵過程中同步進行產(chǎn)酒和高產(chǎn)健康因子。

【附圖說明】：

圖1是yep-pb2k質(zhì)粒構建過程

圖2是重組基因盒片段與基因bdh1的重組過程

圖3是bdh1基因敲除的同時bdh2基因過表達重組菌株的驗證

圖4是bdh1基因缺失重組菌株的驗證

【具體實施方式】：

下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。

實施例1：敲除bdh1基因并過表達bdh2基因釀酒酵母菌株的構建

本實例所用的出發(fā)菌株為釀酒酵母cicc32315，所述大腸桿菌dh5a購自takara公司，所述yepd培養(yǎng)基為通用的完全培養(yǎng)基。

重組質(zhì)粒yep-pb2k的構建流程如圖1所示。將ppgk1質(zhì)粒上的pgk1啟動子和終止子基因酶切下來后再與yep352質(zhì)粒連接得到y(tǒng)ep-pgk1；將用pcr方法獲得的來源于釀酒酵母的編碼雙乙酰還原酶bdh2基因插入到pgk1啟動子和終止子之間，得到y(tǒng)ep-pgk1-bdh2；將來源于pug6上的kanmx抗性基因連接得到質(zhì)粒yep-pgk1-bdh2-kan，命名為質(zhì)粒yep-pb2k。

bdh1重組過程如圖2所示。以構建的載體質(zhì)粒yep-pb2k為模板，利用長引物b1c-u(seqno：11)和b1c-d(seqno：12)用pcr方法擴增獲得帶有2，3-丁二醇脫氫酶bdh1基因兩端同源片段b1a和b1b的重組基因盒片段，序列片段擴增的長引物序列為：

b1c-u：5’-cgagggcagcagtttaacatcaagccggatttgctcacgctactttgaccccttttcgtttcgacggagacagctgaagcttcgtacgc-3’

b1c-d：5’-ttctgtctgtttcataacaacaaatattataaaagaaaatacataatcttagatactacaaatgagccgctaacgaacgcagaattttc-3’

用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將擴增得到的重組基因盒片段插入釀酒酵母，通過b1a和b1b片段與酵母染色體上bdh1基因兩側(cè)的同源序列同源重組，從而整合到酵母染色體上并隨染色體一起復制。轉(zhuǎn)化后通過g418抗性篩選重組子，pgk1-bdh2-kan片段替換了酵母染色體上的bdh1基因片段，從而實現(xiàn)該基因的完全敲除并插入了一個完整的bdh2基因。

然后將通過g418抗性篩選得到的重組子進行pcr驗證，在bdh1基因上游外部和kanmx序列內(nèi)部設計一對上下游定點驗證引物b2-b1s-u、b2-b1s-d，在pgk1序列內(nèi)部和bdh1基因下游外部設計一對上下游定點驗證引物b2-b1x-u、b2-b1x-d，用于驗證bdh1基因敲除同時bdh2基因過表達菌株構建的成功，純化兩代。

pcr驗證結(jié)果如圖3所示，泳道m(xù)為marker；泳道1、2、3所示分別為以重組菌株轉(zhuǎn)化子、純化一代、純化二代菌株基因組為模板，以b2-b1s-u和b2-b1s-d為引物，擴增出來了大小為1162bp的片段，而泳道4以出發(fā)菌株基因組為模板則不能擴增得到該片段；泳道5、6、7所示分別為以重組菌株轉(zhuǎn)化子、純化一代、純化二代菌株基因組為模板，以b2-b1x-u和b2-b1x-d為引物，擴增出來了大小為1696bp的片段，而泳道8以出發(fā)菌株基因組為模板則不能擴增得到該片段，因此驗證說明bdh1基因敲除同時bdh2基因過表達重組菌株構建成功，且通過純化傳代并未發(fā)生突變，再將轉(zhuǎn)化子中的抗性基因kanmx去除，以得到可應用的釀酒酵母基因工程菌株。

實施例2：bdh1基因完全缺失釀酒酵母菌株的構建

根據(jù)實施例1中的方法，設計以下方案獲得敲除bdh1基因的釀酒酵母重組菌株，本實例所用的出發(fā)菌株也為釀酒酵母cicc32315，所述yepd培養(yǎng)基為通用的完全培養(yǎng)基。

以pug6質(zhì)粒上的kanmx抗性基因為模板，核苷酸序列如核苷酸序列表中seqno：13所示。利用長引物b1k-u(seqno：14)和b1k-d(seqno：15)進行pcr方法擴增獲得帶有2，3-丁二醇脫氫酶bdh1基因兩端同源片段b1ka和b1kb的重組基因片段，序列片段擴增的長引物序列為：

b1k-u：5’-ggaactaaaaaaagttttaattaattatgagagctttggcatatttcaacagctgaagcttcgtacgc-3’

b1k-d：5’-cgcgaggggccccaaatattattttgtcattacttcatttcaccgtgcataggccactagtggatctg-3’

用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將擴增得到的重組基因片段b1ka-kanmx-b1kb插入釀酒酵母，通過b1ka和b1kb片段與酵母染色體上bdh1基因兩側(cè)的同源序列同源重組，從而整合到酵母染色體上并隨染色體一起復制。轉(zhuǎn)化后通過g418抗性篩選重組子，kanmx基因片段替換了酵母染色體上的bdh1基因片段，從而實現(xiàn)該bdh1基因的完全敲除。

然后將通過g418抗性篩選得到的重組子進行pcr驗證，在bdh1基因上下游外部和kanmx序列內(nèi)部設計一組定點驗證引物k-b1s-u(seqno：16)、k-b1s-d(seqno：17)和二組定點驗證引物k-b1x-u(seqno：18)、k-b1x-d(seqno：19)，用于驗證bdh1基因敲除的成功，純化兩代，序列片段驗證的引物序列為：

一組上游引物k-b1s-u：5’-aagccgataatgagaaga-3’

一組下游引物k-b1s-d：5’-ctgagcgagacgaaatac-3’

一組上游引物k-b1x-u：5’-aatcaggtgcgacaatct-3’

一組下游引物k-b1x-d：5’-ttcttggctgctgttcta-3’

pcr驗證結(jié)果如圖4所示，泳道m(xù)為marker；泳道1、2、3所示分別為以重組菌株轉(zhuǎn)化子、純化一代、純化二代菌株基因組為模板，以k-b1s-u和k-b1s-d為引物，擴增出來了大小為1473bp的片段，而泳道4以出發(fā)菌株基因組為模板則不能擴增得到該片段；泳道5、6、7所示分別為以重組菌株轉(zhuǎn)化子、純化一代、純化二代菌株基因組為模板，以k-b1x-u和k-b1x-d為引物，擴增出來了大小為1461bp的片段，而泳道8以出發(fā)菌株基因組為模板則不能擴增得到該片段，因此驗證說明bdh1基因缺失重組菌株構建成功，且通過純化傳代并未發(fā)生突變，再將轉(zhuǎn)化子中的抗性基因kanmx去除，以得到可應用的釀酒酵母基因工程菌株。

實施例3：敲除bdh1基因并過表達bdh2基因釀酒酵母菌株發(fā)酵實驗

(1)重組菌株與出發(fā)菌株的玉米濃醪發(fā)酵實驗

將重組菌株和出發(fā)菌株分別同時進行玉米濃醪發(fā)酵實驗，發(fā)酵工藝路線為：玉米粉→浸泡→液化→糖化→冷卻→接菌→發(fā)酵→蒸酒→測定指標；

工藝條件：

浸泡條件：60～70℃，浸漬20min；液化條件：85～90℃，加入耐高溫α-淀粉酶，液化90min；糖化條件：55～60℃，加入糖化酶，糖化20min。

發(fā)酵結(jié)束后測定菌株co2累積排放量、酒精度和殘還原糖等發(fā)酵性能指標，結(jié)果如表1，重組菌株發(fā)酵后的酒精含量和殘?zhí)呛颗c出發(fā)菌株相比沒有明顯差別，本例中基因敲除和過表達的操作不會對菌株基本發(fā)酵性能產(chǎn)生不利影響。

表1親本菌株和重組菌株的發(fā)酵性能測定

注：所示數(shù)據(jù)為三個平行試驗結(jié)果的平均值。

(2)乙偶姻和四甲基吡嗪(ttmp)產(chǎn)量的測定

由表2可知，重組菌株的乙偶姻、2，3-丁二醇和四甲基吡嗪(ttmp)的含量分別為880.82mg/l、236.95mg/l和55.53mg/l，比出發(fā)菌株的乙偶姻、ttmp分別提高了912.06％、314.43％，2，3-丁二醇的生成量降低了約68.11％。因此從結(jié)果可以看出，bdh1基因完全缺失的同時在強啟動子pgk1作用下過表達了bdh2基因的重組菌株增強了雙乙酰到乙偶姻的轉(zhuǎn)化而減弱了乙偶姻到2，3-丁二醇的轉(zhuǎn)化從而使乙偶姻的產(chǎn)量大量積累，進而提高四甲基吡嗪(ttmp)的產(chǎn)量。

表2親本菌株和重組菌株主要產(chǎn)物生成量

注：所示數(shù)據(jù)為三個平行試驗結(jié)果的平均值。

實施例4：bdh1基因完全缺失釀酒酵母菌株發(fā)酵實驗

將重組菌株和出發(fā)菌株根據(jù)實施例3的方法分別同時進行玉米濃醪發(fā)酵實驗，測得發(fā)酵性能指標和主產(chǎn)物生成量如下列兩張表所示。

由表3可知，重組菌株發(fā)酵后的酒精含量和殘?zhí)呛颗c出發(fā)菌株相比沒有明顯差別，說明本例中基因敲除的操作不會對菌株基本發(fā)酵性能產(chǎn)生不利影響。

表3親本菌株和重組菌株的發(fā)酵性能測定

注：所示數(shù)據(jù)為三個平行試驗結(jié)果的平均值。

由表4可知，重組菌株的乙偶姻、2，3-丁二醇和四甲基吡嗪(ttmp)的含量分別比出發(fā)菌株提高了594.91％、188.75％，2，3-丁二醇的生成量降低了約67.23％。因此從結(jié)果可以看出，bdh1基因完全缺失減弱了乙偶姻到2，3-丁二醇的轉(zhuǎn)化從而使乙偶姻的產(chǎn)量大量積累，進而提高四甲基吡嗪(ttmp)的產(chǎn)量。

表4親本菌株和重組菌株主要產(chǎn)物生成量

注：所示數(shù)據(jù)為三個平行試驗結(jié)果的平均值。