本發(fā)明屬于生物處理技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株高效降解土壤中新煙堿類農(nóng)藥的菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

新煙堿類殺蟲(chóng)劑來(lái)源于植物源農(nóng)藥煙堿，主要作用于害蟲(chóng)的乙酰膽堿酯酶受體。煙堿很早就被人們用作殺蟲(chóng)劑，早在17世紀(jì)民間就有了用煙葉粉殺蟲(chóng)的歷史。新煙堿類殺蟲(chóng)劑是繼有機(jī)氯、有機(jī)磷、擬除蟲(chóng)菊酯、氨基甲酸脂之后，推出的一類高效、高選擇性的新型殺蟲(chóng)劑，由于其殺蟲(chóng)譜廣、用量低、作用機(jī)制新穎等特點(diǎn)，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)得到了快速的發(fā)展。啶蟲(chóng)脒是氯化煙堿類殺蟲(chóng)劑的代表性品種，屬于亞甲基雜環(huán)類化合物，廣泛用于水稻尤其是蔬菜、瓜果的蚜蟲(chóng)、飛虱以及部分鱗翅目害蟲(chóng)等的防治，由于廣泛的在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)生活的使用，啶蟲(chóng)脒廣泛的存在于環(huán)境中，極易通過(guò)土壤進(jìn)入地下水等飲用水資源，其在土壤和水環(huán)境中不易降解，不僅會(huì)破壞土壤的結(jié)構(gòu)，阻礙或抑制土壤中微生物的生命活動(dòng)，對(duì)人類的身體健康存在著潛在的威脅。

農(nóng)藥在土壤中的殘留備受關(guān)注，利用微生物修復(fù)是一種有效的措施。微生物由于廣泛的存在于自然界、并且具有種類繁多、繁殖迅速和對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，在農(nóng)藥的生物降解過(guò)程中起到了重要作用。相比細(xì)菌，真菌具有較強(qiáng)的抗毒性和環(huán)境適應(yīng)能力，生長(zhǎng)環(huán)境要求不高，易培養(yǎng)。鐮刀菌是一種常見(jiàn)的真菌，在環(huán)境中廣為存在，其對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，容易培養(yǎng)。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究者已分離到一些啶蟲(chóng)脒的降解菌，并研究了其降解特性，但大多主要集中在細(xì)菌方面，對(duì)真菌的研究很少，尤其是鐮刀菌對(duì)啶蟲(chóng)脒的降解在國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道。王光利等分離得到菌株pigmentiphagasp.aap-1在2.5h內(nèi)可以完全降解100mg/l的啶蟲(chóng)脒。swapnils.phugare等分離得到菌株rhodococcussp.bch2能將250mg/l的啶蟲(chóng)脒降解14％。因此，篩選高效廣譜降解新煙堿類農(nóng)藥啶蟲(chóng)脒的菌株，在土壤的微生物的修復(fù)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)土壤中啶蟲(chóng)脒殘留問(wèn)題，提供一種高效廣譜降解新煙堿類農(nóng)藥啶蟲(chóng)脒的菌株。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述菌株在土壤修復(fù)過(guò)程中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一株降解土壤中新煙堿類農(nóng)藥的菌株，其分類命名為鐮刀菌(fusarium.sp)，菌株號(hào)為cs-3，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱cctcc)，保藏編號(hào)為cctccno：m2017137，保藏日期為2017年3月21日，保藏地址為：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)。

本發(fā)明所述的fusarium.spcs-3篩選方法：在以啶蟲(chóng)脒為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽養(yǎng)基(ph7.0)中，對(duì)含啶蟲(chóng)脒的土壤降解菌株進(jìn)行分離篩選。

具體地，以含啶蟲(chóng)脒的土壤菌群作為篩選目標(biāo)，利用含40mg/l啶蟲(chóng)脒的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基作為介質(zhì)，連續(xù)富集馴化具有啶蟲(chóng)脒降解能力的菌株，將富集培養(yǎng)基稀釋涂布至含有200mg/l啶蟲(chóng)脒的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3-4d，挑取在平板上有透明圈的的啶蟲(chóng)脒降解菌株進(jìn)行劃線分離獲得純培養(yǎng)，命名為菌株cs-3，再次驗(yàn)證純種微生物菌株cs-3對(duì)農(nóng)藥啶蟲(chóng)脒的降解能力，利用液相色譜檢測(cè)啶蟲(chóng)脒的殘余含量；

具體地，所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基是用硝酸銨1.0g，氯化鈉1.0g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鉀1.5g，硫酸鎂0.1g加水定容至1.0l配制，調(diào)節(jié)ph值至7.0，固體培養(yǎng)基加入瓊脂15.0g，15min、121℃滅菌，使用前添加終濃度40mg/l的啶蟲(chóng)脒作為碳源。本發(fā)明所述的fusarium.spcs-3在ypd固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，30℃，72h可形成直徑為4cm的黃白色菌落，菌落大且呈絨毛狀，無(wú)光澤，干燥，粗糙，不透明，營(yíng)養(yǎng)菌絲緊緊的插如培養(yǎng)基中，菌株fusarium.spcs-3生理生化鑒定的結(jié)果與鐮刀菌屬的特征最為接近。

具體地，所述的ypd培養(yǎng)基是由蛋白胨20.0g，葡萄糖20.0g，酵母粉15.0g，加水定容至1.0l配制，調(diào)節(jié)ph值至7.0，固體培養(yǎng)基加入瓊脂15.0g、20min、115℃滅菌。

一種含有本發(fā)明所述的啶蟲(chóng)脒降解菌株fusarium.spcs-318srdna序列的克隆載體。

所述的重組克隆載體，優(yōu)選出發(fā)載體為pmd19t。

含所述的啶蟲(chóng)脒降解菌株fusarium.spcs-318srdna序列的基因工程菌escherichcolidh5α(pmd19t-18s)。

所述的基因工程菌escherichcolidh5α構(gòu)建方法：利用引物its1：5`-tccgtaggtgaacctgcgg-3`和its4：5`-tcctccgcttattgatatgc-3`擴(kuò)增菌株cs-3的18srdna，通過(guò)t/a克隆的方式連接至克隆載體pmd19t，構(gòu)建重組克隆載體pmd19t-18s，將其轉(zhuǎn)化到克隆宿主菌escherichcolidh5α獲得重組微生物escherichcolidh5α(pmd19t-18s)，將所獲得的重組微生物外源片段進(jìn)行測(cè)序，ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)該18srdna序列，在分子水平上將菌株cs-3鑒定至鐮刀菌屬。

上述菌株cs-3在降解土壤中新煙堿類農(nóng)藥中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

其中，所述的新煙堿類農(nóng)藥優(yōu)選為啶蟲(chóng)脒。

其中，土壤中啶蟲(chóng)脒濃度為50-100mg/l。

一株新煙堿類農(nóng)藥啶蟲(chóng)脒降解菌株fusarium.spcs-3在土壤農(nóng)藥殘留處理過(guò)程中的應(yīng)用，具體步驟如下：

(1)菌株cs-3種子液培養(yǎng)：菌株cs-3種子液采用ypd液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，取平板保藏的菌株cs-3，用接種環(huán)挑去菌落接入含有100mlypd液體培養(yǎng)基的三角瓶，30℃振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速180r·min^-1，獲得的菌體經(jīng)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基重懸洗滌兩次后，菌懸液作為降解試驗(yàn)種子液；

(2)菌株cs-3降解啶蟲(chóng)脒的動(dòng)力學(xué)：在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加終濃度為50mg/l的啶蟲(chóng)脒，按5％v/v接種量接入種子液，于30℃，180r·min^-1振蕩培養(yǎng)，每隔2h取樣一次，hplc檢測(cè)啶蟲(chóng)脒的殘留濃度。

(3)溫度和底物初始濃度對(duì)菌株cs-3降解啶蟲(chóng)脒的影響：在啶蟲(chóng)脒終濃度為50mg/l的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按5％接種量接入種子液，分別于20℃、25℃、30℃、37℃、42℃，ph7.0，180r·min^-1振蕩培養(yǎng)；分別于啶蟲(chóng)脒初始濃度50mg/l、100mg/1、150mg/l、200mg/l的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按5％v/v接種量接入種子液，30℃、180r·min^-1振蕩培養(yǎng)，測(cè)定溫度和啶蟲(chóng)脒初始濃度對(duì)菌株cs-3降解啶蟲(chóng)脒的影響。

(4)菌株cs-3對(duì)啶蟲(chóng)脒中間產(chǎn)物2-氯-5羥甲基吡啶的降解能力測(cè)定：在終濃度為100mg/l的含2-氯-5羥甲基吡啶的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按5％v/v接種量接入種子液，于30℃，180r·min^-1振蕩培養(yǎng)，高效液相色譜(hplc)測(cè)定菌株cs-3對(duì)2-氯-5羥甲基吡啶的降解能力。

本發(fā)明的有益效果在于：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，該菌株對(duì)啶蟲(chóng)脒的降解是高效的，且是第一次有報(bào)道鐮刀菌可以降解啶蟲(chóng)脒。此外，該菌株對(duì)含啶蟲(chóng)脒殘留土壤的修復(fù)能力也是高效的，適合應(yīng)用在農(nóng)藥殘留土壤的生物治理上。

附圖說(shuō)明

圖1是菌株cs-3降解啶蟲(chóng)脒效果圖。

圖2a是溫度對(duì)菌株cs-3生長(zhǎng)的影響示意圖。

圖2b是ph值對(duì)菌株cs-3生長(zhǎng)的影響示意圖。

圖3a是溫度對(duì)菌株cs-3降解啶蟲(chóng)脒的影響示意圖。

圖3b是底物初始濃度對(duì)菌株cs-3降解啶蟲(chóng)脒的影響示意圖。

圖4是菌株cs-3降解2-氯-5羥甲基吡啶效果圖。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

下述的實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法無(wú)特殊說(shuō)明均為常規(guī)方法。

下述的實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)試劑耗材等無(wú)特殊說(shuō)明均可從商業(yè)用途購(gòu)買。

實(shí)施例1：

啶蟲(chóng)脒降解菌株fusarium.spcs-3的分離篩選：

取5g啶蟲(chóng)脒污染的土壤樣品置于100ml含30mg/l啶蟲(chóng)脒的富集培養(yǎng)基中，于30℃、180r·min^-1培養(yǎng)7d。用高效液相色譜(hplc)測(cè)定富集液對(duì)啶蟲(chóng)脒的降解情況，確定啶蟲(chóng)脒被降解后，以5％的接種量接入到含40mg/l啶蟲(chóng)脒富集培養(yǎng)基中，繼續(xù)富集并測(cè)定降解情況，按此方法直至啶蟲(chóng)脒濃度提高至100mg/l，并傳代3次。

將啶蟲(chóng)脒富集液經(jīng)梯度稀釋后涂布以200mg/l啶蟲(chóng)脒為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽平板上，于30℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)5d。將平板上長(zhǎng)出的菌落形態(tài)不同的單菌落分別劃線于lb平板純化，并接種于以40mg/l啶蟲(chóng)脒為唯一碳源的液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30℃、180r·min^-1搖床培養(yǎng)2d后，取2ml樣品12000rpm離心5min取上清，上清加入等體積的二氯甲烷，漩渦振蕩儀劇烈振蕩1min，靜置分層后收集有機(jī)相，加入少量無(wú)水硫酸鈉以除去有機(jī)相中的殘余水分，吸取1ml二氯甲烷抽提液于通風(fēng)櫥自然揮發(fā)干，殘留物用等體積的色譜純甲醇溶解，經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后，高效液相色譜(hplc)檢測(cè)。液相色譜條件：250mm×4.6mmc18反相色譜柱；流動(dòng)相為50％乙腈；流速為0.5ml·min^-1；柱溫25℃；waters2487紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為248nm；進(jìn)樣量20μl。

菌株fusarium.spcs-3可以降解啶蟲(chóng)脒至hplc檢測(cè)不到物質(zhì)，說(shuō)明菌株cs-3可以完全礦化上述底物。(圖1)

實(shí)施例2：

啶蟲(chóng)脒降解菌株fusarium.spcs-3的鑒定及其生長(zhǎng)特性：

fusarium.spcs-3在lb平板上生長(zhǎng)較慢，但在ypd平板上生長(zhǎng)較快，30℃，72h可形成菌落大且呈絨毛狀，無(wú)光澤，干燥，粗糙，不透明，營(yíng)養(yǎng)菌絲緊緊的插如培養(yǎng)基中，基于其18srdna序列(如seqidno.：1所示)以及生理生化特征，菌株cs-3被鑒定為fusarium屬。

菌株cs-3的最適生長(zhǎng)溫度為30℃，在25℃也可以很好的生長(zhǎng)，但在較高溫度(40℃)時(shí)，其生長(zhǎng)則受到明顯抑制(圖2a)。菌株cs-3在ph7.0時(shí)，生長(zhǎng)良好，為其最適生長(zhǎng)ph；當(dāng)ph為4時(shí)，其生長(zhǎng)就受到明顯抑制(圖2b)。

實(shí)施例3：

啶蟲(chóng)脒降解菌fusarium.spcs-3的降解特性：

從ypd平板上挑取菌株cs-3單菌落，分別接種于5mlypd液體培養(yǎng)基中于30℃，搖床180r·min^-1培養(yǎng)48h。然后將該菌株的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到100ml新鮮的液體ypd培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)20h。8000r·min^-1離心10min，收集菌體，用滅菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基洗滌兩次后，即種子液。在啶蟲(chóng)脒終濃度為100mg/l的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按5％v/v接種量接入菌株cs-3種子液，于30℃、180r·min^-1振蕩培養(yǎng)，每隔12h取樣一次，hplc檢測(cè)啶蟲(chóng)脒的濃度。

實(shí)施例4：

啶蟲(chóng)脒降解菌fusarium.spcs-3對(duì)2-氯5羥甲基吡啶的降解：

ypd平板上挑取菌株cs-3單菌落，分別接種于5mlypd液體培養(yǎng)基中于30℃，搖床180r·min^-1培養(yǎng)48h。然后將該菌株的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到100ml新鮮的液體ypd培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)20h。8000r·min^-1離心10min，收集菌體，用滅菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基洗滌兩次后，即種子液。在啶蟲(chóng)脒終濃度為100mg/l的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按5％v/v接種量接入菌株cs-3種子液，于30℃、180r·min^-1振蕩培養(yǎng)72h，2ml樣品12000rpm離心5min取上清，經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后，高效液相色譜(hplc)檢測(cè)。液相色譜條件：250mm×4.6mmc18反相色譜柱；流動(dòng)相為60％甲醇；流速為0.6ml·min^-1；柱溫25℃；waters2487紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm；進(jìn)樣量20μl。

菌株fusarium.spcs-3可以降解2-氯5羥甲基吡啶至hplc檢測(cè)不到物質(zhì)，說(shuō)明菌株cs-3可以完全礦化上述底物(圖4)。

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<110>南京工業(yè)大學(xué)

<120>一株降解土壤中新煙堿類農(nóng)藥的菌株及其應(yīng)用

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