適于藥用真菌靈芝高產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法與流程

文檔序號：12816676閱讀：354來源：國知局

本發(fā)明涉及利用微生物獲取目標產(chǎn)物的微生物技術，尤其涉及利用藥用真菌靈芝高產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基以及基于該培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法。

背景技術：

“靈芝”在中國已經(jīng)有2000多年的應用歷史，但是這個真菌種類曾經(jīng)被誤認為是亮蓋靈芝ganodermalucidum(curtis.)p.karst.多年。直到2012年，科學家基于大量樣品的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)該種實際應為一個新種，根據(jù)漢語學名命名為靈芝ganodermalingzhishengh.wu,y.cao&y.c.dai。

靈芝的生物活性成分十分豐富，包括多糖、甾醇、三萜、核酸、呋喃、生物堿、蛋白質(zhì)、油脂、有機鍺、礦物元素等，其中靈芝多糖是靈芝的關鍵藥效成分，有廣泛的生物活性，如調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、通過增強宿主免疫調(diào)節(jié)達到抑腫瘤作用、促進體內(nèi)生理代謝、通過提高氧化酶活性而清除體內(nèi)自由基達到抗氧化、抗衰老目的、鎮(zhèn)靜、強心、降血糖血脂等。

然而，以前往往通過野外采集或人工栽培靈芝，生長周期長、所需條件苛刻，成分比例不穩(wěn)定且易受環(huán)境因素影響，使得提取靈芝多糖遠不能滿足市場需求。靈芝液體發(fā)酵產(chǎn)物中的多糖組分主要分為發(fā)酵液胞外多糖和菌絲體胞內(nèi)多糖，胞外多糖存在于發(fā)酵液中，通過離心、醇沉等方法容易得到，得率也相對較高。本發(fā)明提供了一種適于藥用真菌靈芝高產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法，能夠提高發(fā)酵液中胞外多糖的含量，為靈芝多糖的開發(fā)、利用提供基礎生產(chǎn)資料。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種適于藥用真菌靈芝高產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基。為了達成該目的，本發(fā)明對應的技術方案如下：

適于藥用真菌靈芝高產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的成分包括：葡萄糖、酵母浸粉、維生素b1、吐溫80以及天冬氨酸，這些組分由左及右按重量份的配比為(550～650):(100～110):(0.4～0.5):(90～110):(80～100)。

為了達成本發(fā)明的上述目的之一，在基于上述初始的技術方案的基礎上，在某些實施例中，所述培養(yǎng)基的組分還由碳酸鈣、磷酸二氫鉀、蛋白胨、硫酸鋅、甘露醇、硫酸鎂組成。

為了達成本發(fā)明的上述目的之一，在基于上述初始的技術方案的基礎上，在某些實施例中，所述培養(yǎng)基的初始ph值為5.0。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種適于藥用真菌靈芝高產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)方法。為了達成該目的，本發(fā)明對應的技術方案如下：

適于藥用真菌靈芝高產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)方法，所述方法所用的液體培養(yǎng)基是權利要求1或2或3或4所述的培養(yǎng)基。

為了達成本發(fā)明的上述目的之二，在基于上述初始的技術方案的基礎上，在某些實施例中，所述方法所用的固體培養(yǎng)基由馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、維生素b1、磷酸二氫鉀、蛋白胨、硫酸鎂組成。

為了達成本發(fā)明的上述目的之二，在基于上述初始的技術方案的基礎上，在某些實施例中，所述固體培養(yǎng)基中各個組分按重量份的配比為3000:200:200:0.1:10:50:5。

為了達成本發(fā)明的上述目的之二，在基于上述初始的技術方案的基礎上，在某些實施例中，按如下步驟進行：

a.將藥用真菌靈芝于固體培養(yǎng)基上活化；

b.將步驟a的培養(yǎng)物制成種子發(fā)酵懸液；

c.采用本發(fā)明目的之一的所述培養(yǎng)基培養(yǎng)種子發(fā)酵懸液，培養(yǎng)一段時間后獲得含所述藥用真菌靈芝胞外多糖的溶液。

本發(fā)明培養(yǎng)基以及培養(yǎng)方法能夠使藥用真菌靈芝高產(chǎn)胞外多糖，為胞外多糖的獲取和利用提供了高產(chǎn)基礎。

本發(fā)明人已經(jīng)在此發(fā)明內(nèi)容章節(jié)總地描述了本發(fā)明的精神；以下實施例的舉例是為了方便本領域普通技術人員進一步了解本發(fā)明的實施過程所進行的描述，不能理解為對本發(fā)明精神具體化的限制。

具體實施方式

以下實施例所用的菌株為靈芝(ganodermalingzhi)菌株si21，采自山東省泰安市泰山景區(qū)，寄主為櫟樹。

以下實施例中靈芝胞外多糖的提取如下：將所得含所述藥用真菌靈芝胞外多糖的溶液經(jīng)60℃真空濃縮至原體積的1/10，按濃縮液4倍體積加入預冷的無水乙醇，充分混勻后于4℃條件下醇沉靜置過夜，12000rpm離心30min得沉淀。將沉淀溶解后透析48h，經(jīng)冷凍干燥后加入3％(w/w)蛋白酶于42℃反應3h，冷卻后加入25％(v/v)sevag試劑[氯仿:正丁醇＝5:1(v/v)]劇烈震蕩20min，于分液漏斗中靜置20min，棄去下層有機相得上清液。將上清液經(jīng)透析后冷凍干燥稱重，即得靈芝胞外多糖，以g/l發(fā)酵液計。

以下實施例中所用多糖含量的測定方法如下：采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，以葡萄糖作為標準品。

其中，標準曲線的制作如下：準確配制0、0.2、0.4、0.8、1.0mg/ml葡萄糖標準液。分別吸取1.0ml葡萄糖標準液于10ml具塞刻度試管中，加入1.0ml6.0％(v/v)苯酚溶液，隨后快速加入4.0ml濃硫酸(與液面垂直加入，勿接觸試管壁，以便于反應液充分混合)，靜置10min，充分混勻后置于30℃水浴反應20min，于490nm處測定吸光值。設3個重復，求平均值。以反應體系中葡萄糖標準液的濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標作標準曲線，計算回歸方程為：y＝1.867x+1.012，相關系數(shù)r²＝0.9917。

其中，多糖含量的測定如下：稱取10.0mg靈芝多糖樣品，溶解并定容至10.0ml。吸取1.0ml樣品溶液于10ml具塞刻度試管中，按制作標準曲線的方法進行多糖含量測定。以去離子水替代樣品溶液同體積的反應混合液為對照，多糖含量以培養(yǎng)液中葡萄糖當量計。

實施例一

配置固體培養(yǎng)基：馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、維生素b1、磷酸二氫鉀、蛋白胨、硫酸鎂按重量份3000:200:200:0.1:10:50:5調(diào)配，初始ph5.0，1×10⁵pa高壓滅菌30min。

配置液體培養(yǎng)基：葡萄糖、酵母浸粉、碳酸鈣、維生素b1、磷酸二氫鉀、蛋白胨、吐溫80、硫酸鋅、甘露醇、硫酸鎂以及天冬氨酸按重量份650:105:2:0.5:10:15:100:3:15:5:90調(diào)配，初始ph5.0，1×10⁵pa高壓滅菌30min。