本發(fā)明屬于生物工程和生物質(zhì)能源
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種耐高溫的酸性嗜熱子囊菌纖維素酶、其制備方法和應(yīng)用。具體地，涉及該纖維素酶的發(fā)酵過程、分離純化工藝以及酶解纖維素為葡萄糖的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：木質(zhì)纖維素資源的生物轉(zhuǎn)化需要四類生化反應(yīng)：生成纖維降解酶類、纖維素和半纖維素的酶水解、葡萄糖等六碳糖的酒精發(fā)酵、木糖等五碳糖的酒精發(fā)酵。在目前研究的纖維素酒精工藝中，這些反應(yīng)通常要由不同的微生物在不同的條件下來完成，例如由木霉菌生產(chǎn)纖維素酶、由酒精酵母發(fā)酵葡萄糖、由畢赤酵母或?qū)ｉT構(gòu)建的代謝工程菌來發(fā)酵木糖等。但目前木質(zhì)纖維素制備燃料酒精技術(shù)的生產(chǎn)成本還比較高，其主要原因有：(1)纖維素酶生產(chǎn)技術(shù)不成熟，同步糖化發(fā)酵(ssf)技術(shù)的工藝尚不成熟；而高活力的纖維素酶，基因重組工程菌株一直被丹麥諾維信等少數(shù)企業(yè)所壟斷，我國迄今為止尚無使用基因重組工程菌株進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的企業(yè)。(2)半纖維素的主要降解產(chǎn)物木糖，不能被釀酒酵母直接利用。盡管國內(nèi)外都開始了木糖代謝途徑的釀酒酵母的構(gòu)建，但是重組酵母中存在木酮糖激酶活力低，乙醇的產(chǎn)率不高等問題。(3)高底物濃度發(fā)酵技術(shù)尚未應(yīng)用在纖維素酒精的生產(chǎn)中，山東一些小木質(zhì)纖維素酒精廠(玉米芯為原料)乙醇含量只有2％，廢水排放十分嚴(yán)重，分離成本高。要實(shí)現(xiàn)纖維素物質(zhì)到再生能源的轉(zhuǎn)化，找到適合于工業(yè)生產(chǎn)的高比活力的纖維素酶系是關(guān)鍵步驟之一。纖維素酶是一類能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，包括內(nèi)切葡聚糖酶(ec3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(ec3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(ec 3.2.1.21)。濾紙酶(fpa)可表征纖維素酶系總的糖化能力。目前纖維素酶廣泛用于食品、醫(yī)藥、化工、能源等領(lǐng)域。纖維素作為一種有巨大潛力的可再生資源，利用微生物纖維素酶降解纖維素可以實(shí)現(xiàn)纖維素的轉(zhuǎn)化利用。為了提高纖維素降解效率，耐極端條件的纖維素酶受到廣泛關(guān)注，比如專利(公布號cn102911952a)公布了一種能在ph6-10、50℃條件下保持較高相對活性的纖維素酶。目前尚需要開發(fā)新的在高溫以及酸性條件下具有良好活性的纖維素酶。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明經(jīng)過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動(dòng)，得到了一種具有耐高溫的酸性嗜熱子囊菌纖維素酶(下文中亦簡稱為纖維素酶)。該纖維素酶由嗜熱子囊菌(thermoascusaurantiacus)經(jīng)過深層發(fā)酵、硫酸銨沉淀、透析、陰離子交換柱和分子篩柱層析等步驟制備。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，該纖維素酶具有良好的熱穩(wěn)定性，催化溫度為60～70℃，并且在酸性條件下相對酶活較高，能夠高效地降解纖維素為葡萄糖，可應(yīng)用于木質(zhì)纖維素綜合利用、洗衣滌劑行業(yè)、食品行業(yè)、紡織行業(yè)和飼料加工等領(lǐng)域。由此提供了下述發(fā)明：本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種制備發(fā)酵醪的方法，包括將保藏號為cgmccno.11334的菌株進(jìn)行活化和發(fā)酵培養(yǎng)的步驟；優(yōu)選地，包括下述步驟：1)將所述菌株接入種子培養(yǎng)基中，于39～45℃培養(yǎng)12－64小時(shí)進(jìn)行活化；優(yōu)選地，培養(yǎng)24－48小時(shí)進(jìn)行活化；2)以體積分?jǐn)?shù)為3％～10％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于39～45℃發(fā)酵培養(yǎng)2－8天得到發(fā)酵醪；優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)6－7天。優(yōu)選地，上述步驟1)中的活化或步驟2)中的發(fā)酵培養(yǎng)在150～350rpm的恒溫振蕩器中進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的制備發(fā)酵醪的方法，其中：所述種子培養(yǎng)基包括：玉米淀粉15g/l、蛋白胨4g/l、k2hpo41g/l、na2hpo41g/l、mgso40.5g/l；和/或所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括：麩皮3～30g/l，微晶纖維素5～50g/l，蛋白胨0.5～5g/l，kh2po40.3～3g/l，cacl20.1～0.5g/l、mgso40.1～0.8g/l，吐溫-800.1～1％(v:v)，；優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括：麩皮5g/l，微晶纖維素10g/l，蛋白胨2g/l，kh2po42g/l，cacl20.3g/l、mgso40.3g/l，吐溫-800.1％(v:v)；優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基或者發(fā)酵培養(yǎng)基還含有1ml/l的微量元素液；所述微量元素液包含feso4·7h2o5g/l、mnso4·h2o1.6g/l、znso4·7h2o1.4g/l、cocl2·6h2o3.7g/l。本發(fā)明的另一方面涉及一種制備耐高溫酸性嗜熱子囊菌纖維素酶的方法，包括將保藏號為cgmccno.11334的菌株的發(fā)酵醪的上清或者發(fā)酵液的上清進(jìn)行分離純化的步驟；優(yōu)選地，包括下述步驟：將保藏號為cgmccno.11334的菌株的發(fā)酵醪或者發(fā)酵液離心取上清、濃縮、硫酸銨沉淀、透析、陰離子交換柱層析、分子篩柱層析；更優(yōu)選地，包括下述步驟：(1)取保藏號為cgmccno.11334的菌株的發(fā)酵醪或者發(fā)酵液，經(jīng)5000～12000rpm離心，收集上清液，低溫濃縮后，加入硫酸銨至飽和度為60～90％，靜置12～48h，高速離心取沉淀；(2)取上述(1)中的沉淀，加水復(fù)溶，將復(fù)溶液置入8000～14000da的透析袋中，去離子水透析；(3)收集上述(2)中的透析液，低溫濃縮后，進(jìn)行陰離子交換柱層析，依次用pbs和0.1mol/l，0.3mol/l，0.5mol/lnacl(ph5.3)進(jìn)行階段性洗脫；od280nm在線檢測，收集的各洗脫部分；(4)收集上述(3)中的pbs洗脫組分，進(jìn)行分子篩柱層析，取纖維素酶活最高洗脫組分，低溫濃縮后，經(jīng)真空冷凍干燥，即得耐高溫酸性嗜熱子囊菌纖維素酶；優(yōu)選地，上述各發(fā)酵醪獨(dú)立地由本發(fā)明所述的制備發(fā)酵醪的方法制得。本發(fā)明的再一方面涉及一種耐高溫酸性嗜熱子囊菌纖維素酶，其由保藏號為cgmccno.11334的菌株制得；優(yōu)選地，其由上述制備耐高溫酸性嗜熱子囊菌纖維素酶的方法制得。實(shí)施例4－5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的纖維素酶分子量范圍為35～80kda，最適催化溫度為60～70℃，最適ph值為4.0～6.0，mn2+等對酶有一定的促進(jìn)作用；高溫60℃處理1h酶活較未處理時(shí)變化不大，熱穩(wěn)定性較好。本發(fā)明的再一方面涉及一種制備葡萄糖的方法，包括使用本發(fā)明的耐高溫酸性嗜熱子囊菌纖維素酶對秸稈進(jìn)行降解的步驟。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的制備葡萄糖的方法，其中，所述秸稈選自小麥秸稈、玉米秸稈和水稻秸稈中的任意一種、兩種或者三種。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的制備葡萄糖的方法，其中，相對于每g秸稈，所述耐高溫酸性嗜熱子囊菌纖維素酶的用量為≥50u。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述的制備葡萄糖的方法，其特征在于如下的(1)-(3)項(xiàng)中的任意一項(xiàng)、兩項(xiàng)或者三項(xiàng)，(1)降解的溫度為60～70℃，優(yōu)選70℃；(2)ph為4～6，優(yōu)選為5；(3)加入mn2+；優(yōu)選地，mn2+的終濃度為5mm/l。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述的制備葡萄糖的方法，其中，降解的時(shí)間為≥12小時(shí)，優(yōu)選為≥24小時(shí)。取玉米、小麥或水稻等秸稈，分別加入嗜熱子囊菌纖維素酶酶液(用量為50u/g秸稈)酶解12h，hplc法測定其葡萄糖含量，經(jīng)計(jì)算，其酶解所得的葡萄糖對原料中葡萄糖的得率為50～90％。本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明的耐高溫酸性嗜熱子囊菌纖維素酶在纖維素降解和/或葡萄糖制備中的用途。發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種全新結(jié)構(gòu)的嗜熱子囊菌纖維素酶，具有良好的催化秸稈水解成葡萄糖的活性，其酶解所得的葡萄糖對原料中葡萄糖的得率為50～90％。該酶有望可以應(yīng)用到于木質(zhì)纖維素綜合利用、洗衣滌劑行業(yè)、食品行業(yè)、紡織行業(yè)和飼料加工等領(lǐng)域。該酶的制備方法是以嗜熱子囊菌深層發(fā)酵醪為原料，從中分離純化出具有耐熱的酸性纖維素酶，制備工藝簡單、易行，因此具有廣闊的應(yīng)用前景和潛在的經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明的纖維素酶具有木聚糖酶活、濾紙酶活和cmc酶活(羧甲基纖維素鈉酶活)。附圖說明圖1：嗜熱子囊菌(thermoascusaurantiacus)ujs1412在平板上的形態(tài)。圖1a，45℃條件下培養(yǎng)3天；圖1b，45℃條件下培養(yǎng)5天)。圖2：本發(fā)明嗜熱子囊菌纖維素酶的deae-sepharosefastflow陰離子層析圖。圖3：本發(fā)明嗜熱子囊菌纖維素酶的sds-page圖。圖4：反應(yīng)溫度對本發(fā)明嗜熱子囊菌纖維素酶活的影響。圖5：反應(yīng)ph對本發(fā)明嗜熱子囊菌纖維素酶活的影響。圖6：金屬離子對本發(fā)明嗜熱子囊菌纖維素酶活的影響。圖7：本發(fā)明嗜熱子囊菌纖維素酶的溫度耐受性。關(guān)于生物材料保藏的說明：菌株ujs1412，其于2015年9月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)，保藏編號為cgmccno.11334，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考j.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1：菌株的分離與鑒定1.菌株的分離和保藏高溫堆肥樣品采自江蘇省句容市郊，采樣時(shí)間為2014年8月10日。將采集高溫堆肥樣品用無菌水振蕩，取適量涂布秸稈分離篩選瓊脂平板(1mol/lnaoh預(yù)處理的小麥秸稈10g/l，瓊脂15g/l)。挑取透明水解圈較大的菌落至1mol/lnaoh預(yù)處理的小麥秸稈20g/l，蛋白胨5g/l，k2hpo40.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，kcl0.5g/l，自然ph，40℃200rpm搖瓶培養(yǎng)36h，測定發(fā)酵液中木聚糖酶及纖維素酶酶活，最后得到1株同時(shí)產(chǎn)纖維素酶和木聚糖酶的高產(chǎn)菌株，命名為ujs1412，斜面和冷凍干燥保藏。該菌株ujs1412于2015年9月8日被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)，保藏編號為cgmccno.11334，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。2.菌株的鑒定將菌株ujs1412接種于pda培養(yǎng)基平板上，分別置于40℃，45℃和50℃下培養(yǎng)，觀察菌絲呈乳白色發(fā)散狀生長，菌絲之間呈稀疏網(wǎng)狀(圖1a，45℃條件下培養(yǎng)3天)；5天后漸轉(zhuǎn)為棕黃色至深棕色，培養(yǎng)基背面觀察呈淺黃色(圖1b，45℃條件下培養(yǎng)5天)。玻片培養(yǎng)，顯微鏡下對菌絲、分生孢子梗、分生孢子等形態(tài)特征進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)菌絲呈明顯的子囊菌特征，為無色，光滑，具分枝和隔膜；子囊孢子卵圓形至橢圓形、壁光滑。基于18srdna序列的分子鑒定：。基因組dna提取：采用ezup柱式真菌基因組dna抽提試劑盒(購自生工生物工程(上海)有限公司)提取菌株ujs1412的基因組dna，具體的提取步驟參見產(chǎn)品說明書。pcr擴(kuò)增采用真菌通用引物：its1：5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’(seqidno:1)，以及its4：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’(seqidno:2)，擴(kuò)增菌株整個(gè)its序列(內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，internaltranscriberspacer)。pcr反應(yīng)體系如下：試劑體積(μl)模板(基因組dna20-50ng/μl)0.510×buffer(withmg2+)2.5dntp(各2.5mm)1酶0.2f(10um)0.5r(10um)0.5加雙蒸h2o至25pcr循環(huán)條件如下：將pcr產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳：1％瓊脂糖電泳，150v、100ma20min電泳。切割目的dna條帶，純化回收。將pcr產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化、過pcr柱純化，與pgem-t連接，具體步驟按takara18-tvector連接試劑盒操作。經(jīng)過連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，藍(lán)白斑篩選，提取陽性克隆提取質(zhì)粒并純化。用m13+/-引物擴(kuò)增(體系如上)。m13+/-引物測序。測序工作由生工生物工程(上海)有限公司完成，所得的序列如seqidno:3序列所示。acctgcggaaggatcattaaagagttggggtccttcggggcccgatctcccaccctttgttgtcgcgaatttgttgcctcggcgggtttgcctttatggcagacgggctccggcccacccgccgcaggaccattcaaactctgctttaacaatgcagtttgagaagatttaataataaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccccttggtattccgaggggcatgcctgttcgagcgtcatttcaccaatcaagctacgcttggtattgggcgcgcggcttttccttgcgaaaggcccgcccgaaatgcatcggcgaggaaaccgacccccggcgtgttagatttctgaacgtcaggagcaccggtgccctccgccgtacaatctttttttctaaggttgacctcggatcaggtaggaatac(seqidno:3)將菌株的18srdna序列測序結(jié)果用ncbi的blast2.0進(jìn)行同源分析，搜索genbank核酸數(shù)據(jù)庫，對比發(fā)現(xiàn)其與thermoascusaurantiacusatcc204492有95％左右的相似度。因此，將該菌株鑒定為嗜熱子囊菌thermoascusaurantiacus。實(shí)施例2：嗜熱子囊菌發(fā)酵醪的制備將菌株ujs1412接入種子培養(yǎng)基(玉米淀粉15g/l、蛋白胨4 g/l、k2hpo41g/l、na2hpo41g/l、mgso40.5g/l、1ml/l的微量元素液(含feso4·7h2o5g/l、mnso4·h2o1.6g/l、znso4·7h2o1.4g/l、cocl2·6h2o3.7g/l)，ph自然)中40℃培養(yǎng)48h，收集種子液。按5％(v/v)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(麩皮5g/l，微晶纖維素10g/l，蛋白胨2g/l，kh2po42g/l，cacl20.3g/l、mgso40.3g/l，吐溫-800.1％(v:v)，1ml/l的微量元素液(含feso4·7h2o5g/l、mnso4·h2o1.6g/l、znso4·7h2o1.4g/l、cocl2·6h2o3.7g/l)ph6.5)中，42℃培養(yǎng)6天后，制備得到發(fā)酵醪。實(shí)施例3：嗜熱子囊菌纖維素酶的分離純化將實(shí)施例2所得發(fā)酵醪經(jīng)6000rpm離心，收集上清液，低溫濃縮后，加入硫酸銨至飽和度為80％，靜置24h，高速離心取沉淀；將沉淀加少量水復(fù)溶，將復(fù)溶液置入8000～14000da的透析袋中，去離子水透析；透析液經(jīng)低溫濃縮后，進(jìn)行deae-sepharosefastflow陰離子交換柱層析，依次用pbs和0.1mol/l，0.3mol/l，0.5mol/lnacl(ph5.3)進(jìn)行階段性洗脫；od280nm在線檢測，收集的各洗脫部分等組分；收集pbs洗脫組分，進(jìn)行sephadexg75分子篩柱層析，如圖2所示。取纖維素酶活最高洗脫組分，低溫濃縮后，經(jīng)真空冷凍干燥，即得本發(fā)明的耐高溫酸性嗜熱子囊菌纖維素酶。用于下面的實(shí)施例4-7。實(shí)施例4：耐高溫的酸性嗜熱子囊菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)表征sds-page測定相對分子量：采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)判定純化的耐高溫酸性的嗜熱子囊菌纖維素酶和純度和相對分子量，其在電泳上為單一條帶，分子量范圍為35～80kda。如圖3所示。maldi-tof-ms分析純化酶的肽指紋圖譜：將sds-page電泳得到的目的蛋白條帶經(jīng)0.1μg/μl胰蛋白酶4℃酶解30min，進(jìn)行maldi-tof-ms(其中激光強(qiáng)度范圍：20～30，質(zhì)譜掃描范圍750+， 串聯(lián)質(zhì)譜碰撞誘導(dǎo)解離強(qiáng)度范圍：120～150)分析。經(jīng)mascot網(wǎng)站上將檢測到的肽指紋圖譜與ncbi冗余蛋白庫進(jìn)行搜尋鑒定，該酶含有的肽段序列為：rsgmgqgivgyitgdaplpry(seqidno:4)。實(shí)施例5：耐高溫的酸性嗜熱子囊菌纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)1.反應(yīng)溫度對纖維素酶活的影響1.1將實(shí)施例3制得的纖維素酶用0.05mol/l，ph4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解并稀釋適當(dāng)倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)組：加入1.0mlph4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液，50mg濾紙條、0.5ml酶液。空白管：加入1.5ml緩沖液。酶對照組：1.0ml緩沖液、0.5ml酶液。底物對照組：1.5ml緩沖液+濾紙條。將各管反應(yīng)溫度分別調(diào)節(jié)為30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃反應(yīng)60分鐘后，立即加入3.0ml二硝基水楊酸(dns)混合終止酶反應(yīng)，沸水中水浴5min，然后移至冰水中冷卻。取0.2ml反應(yīng)物加2.5ml水稀釋，然后在540nm處測吸光度，用空白組調(diào)零。通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程求出葡萄糖的含量，計(jì)算既得濾紙酶活。1.2將待測酶液用0.05mol/l，ph4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)組(加入1.0ml1％(w/v)cmc溶液、0.5ml酶液)，再取3支試管分別為空白管(加入1.5ml緩沖液)、酶對照組(1.0ml緩沖液、0.5ml酶液)、底物對照組(0.5ml緩沖液、1％(w/v)cmc溶液)。將反應(yīng)溫度分別調(diào)節(jié)為30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃反應(yīng)30分鐘后后，加入3.0mldns混勻，沸水浴5min，然后移至冰水中冷卻。取0.2ml混合物加2.5ml水稀釋，然后在540nm處 測吸光度，用空白管調(diào)零。通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程求出葡萄糖的含量，計(jì)算cmc酶活。濾紙酶活/cmc酶活計(jì)算公式：x—纖維素酶(u/ml)；w—葡萄糖生成量(mg)；v—反應(yīng)液中酶液加入量；5.56—1mg的葡萄糖的μmol數(shù)(1000/180＝5.56)；n—樣品稀釋倍數(shù)；t—反應(yīng)時(shí)間(分鐘)；1.3將待測酶液用0.05mol/l，ph5.3的乙酸緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)組(加入1.0ml1％(w/v)木聚糖溶液、1.0ml酶液)，再取3支試管分別為空白管(加入2.0ml緩沖液)、酶對照組(1.0ml緩沖液、1.0ml酶液)、底物對照組(1.0ml緩沖液、1.0ml1％(w/v)木聚糖溶液)。將反應(yīng)溫度分別調(diào)節(jié)為30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃反應(yīng)30min，取出。迅速、準(zhǔn)確地向三支試管中加入dns試劑3.0ml，于空白管中準(zhǔn)確加入稀釋好的待測酶液1.0ml，將三支試管同時(shí)置于沸水浴中，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，煮沸5min后取出，迅速冷卻至室溫，用水定容至25ml。以空白管在分光光度計(jì)540nm下較零，分別測量二支試管中樣品的吸光度，取平均值，通過木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程求出木糖的含量。木聚糖酶活計(jì)算公式：x—木聚糖酶(u/ml)；w—木糖生成量(mg)；v—反應(yīng)液中酶液加入量；6.67—1mg的木聚糖的μmol數(shù)(1000/150＝6.67)；n—樣品稀釋倍數(shù)；t—反應(yīng)時(shí)間(分鐘)。結(jié)果如圖4所示。測定耐高溫酸性的嗜熱子囊菌纖維素酶的合適反應(yīng)溫度為60－70℃；綜合考慮，特別是考慮濾紙酶活，最適反應(yīng)溫度為70℃左右。2.反應(yīng)ph對纖維素酶活的影響將底物分別溶于ph2、3、4、5、6、7、8、9、10的緩沖液中，配成所需濃度的溶液。分別參照上述1.中的操作方法，測定不同ph條件下該酶的濾紙酶活、纖維素酶活和木聚糖酶活。結(jié)果如圖5所示。合適發(fā)反應(yīng)ph為4－6；經(jīng)綜合考慮，特別是考慮濾紙酶活，該酶最適ph為5.0左右。3.金屬離子對纖維素酶活的影響3.1取等量酶液，分別加入等量的10mm的agno3、cacl2、cocl2、zncl2、mgso4、cuso4、feso4、mnso4溶液混勻，將待測酶液用0.05mol/l，ph4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)組(加入1.0mlph4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液，50mg濾紙條、0.5ml酶液)，再取3支試管分別是空白管(加入1.5ml緩沖液)、酶對照組(1.0ml緩沖液、0.5ml酶液)、底物對照組(1.5ml緩沖液+濾紙條)。放入50℃水浴60分鐘，水浴結(jié)束后，立即加入3.0ml二硝基水楊酸(dns)混合終止酶反應(yīng)，沸水中水浴5min，然后移至冰水中冷卻。取0.2ml反應(yīng)物加2.5ml水稀釋，然后在540nm處測吸光度，用空白組調(diào)零。通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程求出葡萄糖的含量，計(jì)算濾紙酶活。3.2取等量酶液，分別加入等量的10mm的agno3、cacl2、cocl2、zncl2、mgso4、cuso4、feso4、mnso4溶液混勻，將待測酶液用0.05mol/l，ph4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)組(加入1.0ml1％(w/v)cmc溶液、0.5ml酶液)，再取3支試管分別為空白管(加入1.5ml緩沖液)、酶對照組(1.0ml緩沖液、0.5ml酶液)、底物對照組(0.5ml緩沖液、1％(w/v)cmc溶液)。將試管放入50℃水浴鍋中水浴30分鐘，水浴后，加入3.0mldns混勻，沸水浴5min，然后移至冰水中冷卻。取0.2ml混合物加2.5ml水稀釋，然后在540nm處測吸光度，用空白管調(diào)零。通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn) 曲線線性回歸方程求出葡萄糖的含量，計(jì)算cmc酶活。3.3取等量酶液，分別加入等量的10mm的agno3、cacl2、cocl2、zncl2、mgso4、cuso4、feso4、mnso4溶液混勻，將待測酶液用0.05mol/l，ph5.3的乙酸緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)組(加入1.0ml1％(w/v)木聚糖溶液、1.0ml酶液)，再取3支試管分別為空白管(加入2.0ml緩沖液)、酶對照組(1.0ml緩沖液、1.0ml酶液)、底物對照組(1.0ml緩沖液、1.0ml1％(w/v)木聚糖溶液)。置于40℃條件下反應(yīng)30min，取出。迅速、準(zhǔn)確地向三支試管中加入dns試劑3.0ml，于空白管中準(zhǔn)確加入稀釋好的待測酶液1.0ml，將三支試管同時(shí)置于沸水浴中，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，煮沸5min后取出，迅速冷卻至室溫，用水定容至25ml。以空白管在分光光度計(jì)540nm下較零，分別測量二支試管中樣品的吸光度，取平均值，通過木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程求出木糖的含量，分別計(jì)算木聚糖酶活。結(jié)果如圖6所示，mn2+等對相對酶活有一定的促進(jìn)作用，達(dá)到110％(主要考慮濾紙酶活)。4.本發(fā)明纖維素酶的溫度耐受性4.1將酶液分別放入40、50、60、70、80℃水浴中保溫0.5、1.0、1.5h，將待測酶液用0.05mol/l，ph4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)組(加入1.0mlph4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液，50mg濾紙條、0.5ml酶液)，再取3支試管分別是空白管(加入1.5ml緩沖液)、酶對照組(1.0ml緩沖液、0.5ml酶液)、底物對照組(1.5ml緩沖液+濾紙條)。放入50℃水浴60分鐘，水浴結(jié)束后，立即加入3.0ml二硝基水楊酸(dns)混合終止酶反應(yīng)，沸水中水浴5min，然后移至冰水中冷卻。取0.2ml反應(yīng)物加2.5ml水稀釋，然后在540nm處測吸光度，用空白組調(diào)零。通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程求出葡萄糖的含量，計(jì)算濾紙酶活。4.2將酶液分別放入40、50、60、70、80℃水浴中保溫0.5、1.0、1.5h，將待測酶液用0.05mol/l，ph4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)組(加入1.0ml1％(w/v)cmc溶液、0.5ml酶液)，再取3支試管分別為空白管(加入1.5ml緩沖液)、酶對照組(1.0ml緩沖液、0.5ml酶液)、底物對照組(0.5ml緩沖液、1％(w/v)cmc溶液)。將試管放入50℃水浴鍋中水浴30分鐘，水浴后，加入3.0mldns混勻，沸水浴5min，然后移至冰水中冷卻。取0.2ml混合物加2.5ml水稀釋，然后在540nm處測吸光度，用空白管調(diào)零。通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程求出葡萄糖的含量，計(jì)算cmc酶活。4.3將酶液分別放入40、50、60、70、80℃水浴中保溫0.5、1.0、1.5h，將待測酶液用0.05mol/l，ph5.3的乙酸緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)組(加入1.0ml1％(w/v)木聚糖溶液、1.0ml酶液)，再取3支試管分別為空白管(加入2.0ml緩沖液)、酶對照組(1.0ml緩沖液、1.0ml酶液)、底物對照組(1.0ml緩沖液、1.0ml1％(w/v)木聚糖溶液)。置于40℃條件下反應(yīng)30min，取出。迅速、準(zhǔn)確地向三支試管中加入dns試劑3.0ml，于空白管中準(zhǔn)確加入稀釋好的待測酶液1.0ml，將三支試管同時(shí)置于沸水浴中，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，煮沸5min后取出，迅速冷卻至室溫，用水定容至25ml。以空白管在分光光度計(jì)540nm下較零，分別測量二支試管中樣品的吸光度，取平均值，通過木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程求出木糖的含量，分別計(jì)算木聚糖酶活。結(jié)果如圖7所示，該酶在60℃處理1h后，相對酶活為93％(主要考慮濾紙酶活)。實(shí)施例6：水解玉米秸稈實(shí)驗(yàn)取干燥粉碎后粒徑為40目的玉米秸稈5g，經(jīng)hplc法(色譜條件：shodexsugersh1011(8.0mmi.d×300mm)；流動(dòng)相：0.005mol/l 的稀硫酸溶液；流速：0.6ml/min；檢測器：示差檢測器；柱溫：50℃；進(jìn)樣量：10μl)測定，葡萄糖在原料中的含量分別為56％。另取干燥粉碎后粒徑為40目的玉米秸稈10g，加入嗜熱子囊菌纖維素酶酶液(用量為50u/g秸稈)酶解12h，參照上面的hplc法測定其葡萄糖含量，經(jīng)計(jì)算，其酶解所得的葡萄糖對原料中葡萄糖的得率為81％。葡萄糖得率的計(jì)算公式為：其中：i：葡萄糖的得率(％)，c1：酶解秸稈所產(chǎn)的葡萄糖濃度(g/l)，c0：秸稈樣品中葡萄糖濃度(稀硫酸水解)(g/l)。實(shí)施例7：水解水稻秸稈實(shí)驗(yàn)取干燥粉碎后粒徑為30目的水稻秸稈5g，經(jīng)hplc法(色譜條件：shodexsugersh1011(8.0mmi.d×300mm)；流動(dòng)相：0.005mol/l的稀硫酸溶液；流速：0.6ml/min；檢測器：示差檢測器；柱溫：50℃；進(jìn)樣量：10μl)測定，葡萄糖和木糖在原料中的含量分別為48％和24％。另取干燥粉碎后粒徑為30目的水稻秸稈15g，加入嗜熱子囊菌纖維素酶酶液(用量為50u/g秸稈)酶解24h，參照上面的hplc法測定其葡萄糖含量，經(jīng)實(shí)施例6中公式計(jì)算，其酶解所得的葡萄糖對原料中葡萄糖的得率為89％。盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。當(dāng)前第1頁12