本發(fā)明屬于采用仿生手段進行微器件設(shè)計領(lǐng)域，具體涉及一種基于葉脈網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)仿生的多層細胞培養(yǎng)微器件，該細胞培養(yǎng)微器件用于構(gòu)建細胞體外培養(yǎng)動態(tài)穩(wěn)定均一的流體流動微環(huán)境。

背景技術(shù)：

細胞是組成生物體的基本單元，細胞研究對于揭示生命規(guī)律、診斷疾病、篩選藥物等具有重要意義。細胞培養(yǎng)是進行細胞研究的基礎(chǔ)，傳統(tǒng)的細胞體外培養(yǎng)往往采用培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板，是一種靜態(tài)的培養(yǎng)，與細胞在體流動微環(huán)境不同。

微流控器件的微通道網(wǎng)絡(luò)與細胞在體時所處的脈管系統(tǒng)非常相似，可以進行動態(tài)的培養(yǎng)，因此采用微流控技術(shù)進行細胞培養(yǎng)使細胞在體微環(huán)境的體外模擬和控制成為可能。

培養(yǎng)池是微流控細胞培養(yǎng)器件的重要功能單元之一，為保證培養(yǎng)區(qū)內(nèi)的各細胞具有相同的微環(huán)境，要求細胞培養(yǎng)區(qū)的流場具有均一性。同時，為保證實驗的復(fù)現(xiàn)性，要求細胞培養(yǎng)區(qū)的流場具有穩(wěn)定性。因此如何設(shè)計培養(yǎng)池成為微器件設(shè)計的關(guān)鍵。

大自然經(jīng)過長期的進化形成了許多優(yōu)化結(jié)構(gòu)。雙子葉植物葉脈能夠?qū)母窟\至葉柄的液體均勻的輸運至每個葉肉細胞，供給葉肉細胞進行各項生理活動。雙子葉植物葉脈的這種水力特性與結(jié)構(gòu)密不可分。雙子葉植物葉脈具有如下特征：葉脈整體呈網(wǎng)狀分布，且主脈中液體流量變化隨中間脈密度的提高而逐漸趨于穩(wěn)定，因此流量的變化對葉肉細胞影響小、輸送至葉片各區(qū)域養(yǎng)分均勻，并且高密度的閉合葉脈可以保證液體輸運不會由于局部葉脈損壞或混入氣體而阻塞，保證了網(wǎng)眼區(qū)域內(nèi)液體供給的穩(wěn)定性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，采用提取生物體內(nèi)影響流體流動微環(huán)境的微結(jié)構(gòu)的方法，設(shè)計一種能夠構(gòu)建動態(tài)穩(wěn)定均一的細胞體外培養(yǎng)流體流動微環(huán)境的細胞培養(yǎng)微器件，采用微加工技術(shù)制作該微器件并用于細胞體外培養(yǎng)。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種基于葉脈網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)仿生的多層細胞培養(yǎng)微器件，包括細胞進樣層1、中間過渡層2和仿生培養(yǎng)層3，細胞進樣層1位于最上層，中間過渡層2位于中間層，仿生培養(yǎng)層3位于底層；

所述的細胞進樣層1上設(shè)有4個通孔和1個對齊孔，4個通孔分別為培養(yǎng)液進樣孔4、細胞進樣孔5、細胞出樣孔8和廢液排出孔9，對齊孔7位于細胞進樣層1的中心處，培養(yǎng)液進樣孔4和廢液排出孔9對稱位于對齊孔7左右端，細胞進樣孔5和細胞出樣孔8對稱位于對齊孔7上下端；細胞進樣孔5和細胞出樣孔8間通過通道6連通，通道6成對對稱布置；與細胞出樣孔8相連的通道6側(cè)橫向設(shè)有梯形微壩18，用于阻擋細胞被沖出培養(yǎng)池；

所述的中間過渡層2上設(shè)有3個通孔，從左到右依次為培養(yǎng)液進樣通孔10、培養(yǎng)池連通孔11和廢液排出通孔12，培養(yǎng)液進樣通孔10與細胞進樣層1的培養(yǎng)液進樣孔4相通，廢液排出通孔12與細胞進樣層1的廢液排出孔9相通，培養(yǎng)池連通孔11與細胞進樣層1的對齊孔7相對，且形狀大小相同；

所述的仿生培養(yǎng)層3上設(shè)有培養(yǎng)液儲液池13、仿生培養(yǎng)池15和廢液儲液池17，培養(yǎng)液從培養(yǎng)液進樣孔4通過培養(yǎng)液進樣通孔10進入培養(yǎng)液儲液池13，培養(yǎng)液儲液池13與仿生培養(yǎng)池15間通過培養(yǎng)液進樣通道14相連，仿生培養(yǎng)池15與廢液儲液池17間通過廢液出樣通道16相連；

所述的培養(yǎng)液儲液池13分為儲液區(qū)19和溢流區(qū)20，儲液區(qū)19位于培養(yǎng)液儲液池13的最內(nèi)部，儲液區(qū)19由多個柵欄微柱21圍成，儲液區(qū)19的內(nèi)切圓直徑不小于培養(yǎng)液進樣通孔10的內(nèi)切圓直徑，培養(yǎng)液通過柵欄微柱間隙22進入溢流區(qū)20，溢流區(qū)20與培養(yǎng)液進樣通道14相通；

所述的仿生培養(yǎng)池15設(shè)有兩層微柱，為內(nèi)微柱層和外微柱層，內(nèi)微柱層是由多個排布緊密的內(nèi)微柱24圍成的多邊形結(jié)構(gòu)，由內(nèi)微柱24圍成的多邊形結(jié)構(gòu)內(nèi)部為細胞培養(yǎng)區(qū)23，培養(yǎng)液通過內(nèi)微柱24間的內(nèi)微柱間隙28進入細胞培養(yǎng)區(qū)23；外微柱層位于內(nèi)微柱層外側(cè)，外微柱層中排布的外微柱25的數(shù)量與多邊形的邊數(shù)相同，將仿生培養(yǎng)池15內(nèi)部的通道分為一級分岔子通道26和二級分岔子通道27；一級分岔子通道26為仿生培養(yǎng)池15與外微柱層間形成的通道、外微柱層中外微柱25間形成的通道，一級分岔子通道26的水力直徑符合murray定律，即一級分岔子通道26水力直徑的三次方之和等于培養(yǎng)液進樣通道14水利直徑的三次方；二級分岔子通道27為外微柱層和內(nèi)微柱層間形成的通道，二級分岔子通道27為最后一級子通道，模擬葉片最細的葉脈，與一級分岔子通道26具有相同的水力直徑。

所述的細胞進樣層1上面的通道6關(guān)于對齊孔7成對對稱布置，使細胞從多個方向進入培養(yǎng)池，利于細胞均勻的分布于細胞培養(yǎng)區(qū)23內(nèi)；所述的細胞進樣層1上面的通道6與對齊孔7具有相同的深度；所述的細胞進樣層1上面的梯形微壩18的高度與通道6的深度相同；所述的細胞進樣層1上面的對齊孔7與培養(yǎng)池連通孔11、細胞培養(yǎng)區(qū)23具有相同的形狀和大小，便于鍵合對準。

所述的仿生培養(yǎng)層3設(shè)計靈感來源于雙子葉植物葉片內(nèi)的葉脈結(jié)構(gòu)。葉脈等級分岔和閉合的結(jié)構(gòu)特點增加了葉片內(nèi)水分輸運的冗余度，為葉脈內(nèi)調(diào)整液體流量變化提供了多條路徑。受這一現(xiàn)象的啟發(fā)，本發(fā)明設(shè)計了仿葉脈結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)層，主要是仿葉脈細脈處的結(jié)構(gòu)。所述仿生培養(yǎng)層3上的培養(yǎng)液進樣通道14、一級分岔子通道26、二級分岔子通道27模擬葉脈網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，具有等級分岔特點；所述仿生培養(yǎng)層3上的仿生培養(yǎng)池15模擬網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)，具有多邊形特點；所述仿生培養(yǎng)池上的內(nèi)微柱間隙28模擬葉脈導(dǎo)管側(cè)壁上的紋孔結(jié)構(gòu)，用于連接二級分岔子通道27與細胞培養(yǎng)區(qū)23。

所述的細胞進樣層1、中間過渡層2和仿生培養(yǎng)層3采用熱固性聚合物聚二甲基硅氧烷(pdms)，或者熱塑性聚合物聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)或聚苯乙烯(ps)或聚碳酸酯(pc)材料。

所述的細胞進樣層1、中間過渡層2和仿生培養(yǎng)層3采用微加工工藝制作而成，制作過程為：采用光刻技術(shù)和干法刻蝕技術(shù)制作微模具、采用軟刻蝕技術(shù)或熱壓技術(shù)將微模具上的圖形轉(zhuǎn)移至微器件材料上。

所述的中間過渡層2使用的材料厚度小于等于模具上的微柱的高度，以形成通孔。

所述的細胞進樣層1采用微流控芯片專用打孔器在培養(yǎng)液進樣孔4、細胞進樣孔5、細胞出樣孔8和廢液排出孔9對應(yīng)位置打出通孔。

所述的細胞進樣層1、中間過渡層2和仿生培養(yǎng)層3通過氧等離子體處理或者熱壓的方法鍵合在一起。

所述的鍵合過程中，細胞進樣層1與中間過渡層2之間需要對準，中間過渡層2與仿生培養(yǎng)層3之間需要對準，所述的對準過程采用可視化的顯微成像技術(shù)，將對準過程呈現(xiàn)在計算機屏幕上，通過調(diào)整上下平臺間的位置使芯片層之間實現(xiàn)對準。

所述的細胞培養(yǎng)微器件在鍵合好之后通入無水乙醇以保持封閉通道及培養(yǎng)池內(nèi)表面的親水性，并且起到消毒滅菌的作用。

所述的細胞培養(yǎng)微器件通過示蹤粒子測速的方法來測量細胞培養(yǎng)區(qū)23內(nèi)流體的流動速度。

所述的細胞培養(yǎng)微器件、硅膠管和管接頭在用于細胞培養(yǎng)之前高溫高壓滅菌1小時，滅好菌后包被鼠尾膠原蛋白或纖連蛋白，包被好膠原后置于孵育箱過夜，利于后續(xù)細胞貼壁。

所述的細胞培養(yǎng)微器件在注入細胞后靜置片刻，置于顯微鏡下觀察細胞注入情況，放入co2孵育箱靜態(tài)孵育至大多數(shù)細胞貼壁。

所述的細胞培養(yǎng)微器件在細胞貼壁后開始進行動態(tài)培養(yǎng)。

所述的細胞培養(yǎng)微器件在動態(tài)培養(yǎng)過程中每隔24小時對培養(yǎng)池內(nèi)的細胞進行一次觀察拍照至細胞鋪滿整個培養(yǎng)池。統(tǒng)計每個時間段內(nèi)細胞的數(shù)量，繪制細胞生長曲線。

本發(fā)明的有益效果：成對對稱分布的細胞進樣通道通過多通道多方向的細胞注入實現(xiàn)培養(yǎng)池內(nèi)細胞的均勻分布；通過模擬植物葉脈網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)構(gòu)建的仿生培養(yǎng)池可以精確的控制培養(yǎng)池內(nèi)的流體流動微環(huán)境，模擬細胞在體流動微環(huán)境，提高細胞體外實驗結(jié)果的可靠性；仿生培養(yǎng)池具有一定的魯棒性，可以抵抗外部擾動，減少由于增加微泵、微閥、微通道、濃度梯度發(fā)生器或者通道破壞堵塞造成的培養(yǎng)池內(nèi)流場的變化，提高實驗的可重復(fù)性，且該仿生培養(yǎng)池可以集成到多種細胞操控微器件中，在保證細胞培養(yǎng)微環(huán)境的同時，實現(xiàn)細胞的大批量培養(yǎng)；該微器件具有較高的生物兼容性，制作簡單，成本低，可以實現(xiàn)大批量生產(chǎn)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明中細胞培養(yǎng)微器件的三維結(jié)構(gòu)圖。

圖2是本發(fā)明中細胞進樣層1的二維俯視圖。

圖3是圖2中m局部放大圖，梯形壩18用于阻止細胞被沖出培養(yǎng)池。

圖4是細胞進樣層1上細胞出樣區(qū)域三維結(jié)構(gòu)圖，梯形壩19位于通道6內(nèi)，其高度與通道6的深度相同。

圖5是本發(fā)明中仿生培養(yǎng)層3的二維俯視圖。

圖6為圖5中a-a剖面上的三維剖視圖，該圖展示了培養(yǎng)液儲液區(qū)19、溢流區(qū)20、培養(yǎng)液進樣通道14、細胞培養(yǎng)區(qū)23、廢液出樣通道16和廢液儲液池17具有相同的深度。

圖7為圖5中培養(yǎng)液儲液池13的放大示意圖。

圖8為圖5中仿生培養(yǎng)池的放大示意圖。

圖9為圖8中n局部放大圖，內(nèi)微柱間隙28模擬葉脈導(dǎo)管壁上的紋孔結(jié)構(gòu)，用以連接二級分岔子通道27與細胞培養(yǎng)區(qū)23，將培養(yǎng)液輸運至細胞培養(yǎng)區(qū)23，并將細胞培養(yǎng)區(qū)23內(nèi)的廢液導(dǎo)出。

圖10是在本發(fā)明仿生細胞培養(yǎng)微器件內(nèi)進行示蹤粒子測速的粒子軌跡圖。

圖11是本發(fā)明仿生細胞培養(yǎng)微器件的培養(yǎng)池內(nèi)均勻分布的28個粒子的平均速度。

圖12是本發(fā)明仿生細胞培養(yǎng)微器件的培養(yǎng)池內(nèi)平均流速隨著培養(yǎng)液進樣通道14處流速變化的曲線圖。

圖13是本發(fā)明仿生細胞培養(yǎng)微器件的細胞培養(yǎng)區(qū)23內(nèi)細胞在不同時間段的生長狀況圖。

圖14是本發(fā)明仿生細胞培養(yǎng)微器件的細胞培養(yǎng)區(qū)23內(nèi)細胞培養(yǎng)84小時后使用dapi染色后的細胞圖片。

圖15是本發(fā)明仿生細胞培養(yǎng)微器件的細胞培養(yǎng)區(qū)23內(nèi)細胞的生長曲線圖。

圖中：1細胞進樣層；2中間過渡層；3仿生培養(yǎng)層；4培養(yǎng)液進樣孔；

5細胞進樣孔；6通道；7對齊孔；8細胞出樣孔；9廢液排出孔；

10培養(yǎng)液進樣通孔；11培養(yǎng)池連通孔；12廢液排出通孔；

13培養(yǎng)液儲液池；14培養(yǎng)液進樣通道；15仿生培養(yǎng)池；16廢液出樣通道；

17廢液儲液池；18梯形微壩；19儲液區(qū)；20溢流區(qū)；21柵欄微柱；

22柵欄微柱間隙；23細胞培養(yǎng)區(qū)；24內(nèi)微柱；25外微柱；

26一級分岔子通道；27二級分岔子通道；28內(nèi)微柱間隙。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和技術(shù)方案，進一步說明本發(fā)明的具體實施方式。

實施例

如圖1所示，一種用于構(gòu)建細胞體外培養(yǎng)動態(tài)穩(wěn)定微環(huán)境的仿生細胞培養(yǎng)微器件，該微器件由三層結(jié)構(gòu)組成，分別為細胞進樣層1、中間過渡層2和仿生培養(yǎng)層3，細胞進樣層1位于最上層，中間過渡層2位于中間，仿生培養(yǎng)層3位于底層。細胞進樣層1上的培養(yǎng)液進樣孔4與中間過渡層2上的培養(yǎng)液進樣通孔10具有相同的尺寸，直徑為0.5～1.5mm,本實施例中為1mm；細胞進樣層1上的廢液排出孔9和中間過渡層2上的廢液排出通孔12具有相同的尺寸，直徑為0.5～1.5mm,本實施例中為1mm；中間過渡層2上培養(yǎng)池連通孔11的大小形狀與對齊孔7、細胞培養(yǎng)區(qū)23相同，形狀可以為正方形、正六邊形、正八邊形或正十邊形，多邊形的內(nèi)切圓直徑為0.5～2mm,本實施例中為內(nèi)切圓直徑1mm的正八邊形；細胞進樣層上1的通道6成對對稱分布，通道的深度為30～100微米，通道的寬度為100～300微米，本實施例中通道6的深度和寬度分別為50微米和100微米；與細胞出樣孔8相連的通道6一側(cè)中的梯形微壩18(如圖3所示)的上底和下底分別為10～30微米和5～20微米，本實施例上底和下底分別為20微米和10微米，梯形微壩18的高度與通道的深度相同，本實施例為50微米；仿生培養(yǎng)層3上的培養(yǎng)液儲液池13的直徑為1～3mm，本實施例中為1.5mm，儲液區(qū)19的直徑為0.5～1.5mm，與培養(yǎng)液進樣孔4大小相同，柵欄微柱21陣列的外圓直徑為1.5mm～2.5mm，柵欄微柱21的周向?qū)挾葹?0～150微米，本實施例中為90微米，柵欄微柱21的高度與培養(yǎng)液儲液池14的深度相同，為50～200微米，本實施例中為60微米；培養(yǎng)液進樣通道14的寬度為100～300微米，本實施例為200微米；一級分岔通道26與二級分岔通道27與培養(yǎng)液進樣通道14深度相同，一級分岔通道的寬度由其水力直徑計算得到，一級分岔子通道26的水力直徑的三次方之和等于培養(yǎng)液進樣通道14的水力直徑的三次方，符合murray定律，本實施例中一級分岔通道26的寬度為69微米，二級分岔子通道27的寬度與一級分岔子通道26的寬度相同；細胞培養(yǎng)區(qū)23的形狀為正多邊形，正方形、正六邊形、正八邊形、正十邊形，正多邊形的內(nèi)切圓直徑為0.5～2mm，本實施例中為內(nèi)切圓直徑為1mm的正八邊形，深度與培養(yǎng)液進樣通道14相同；細胞培養(yǎng)區(qū)23周圍的內(nèi)微柱24徑向?qū)挾葹?0～200微米，本實施例中為100微米，內(nèi)微柱間隙28徑向中線均經(jīng)過細胞培養(yǎng)區(qū)內(nèi)切圓的圓心，周向?qū)挾葹?～10微米，本實施例中為6微米，深度與細胞培養(yǎng)區(qū)23相同；廢液出樣通道16與培養(yǎng)液進樣通道14關(guān)于細胞培養(yǎng)區(qū)23的內(nèi)切圓呈對稱分布。所述的仿生培養(yǎng)池可以集成到依據(jù)murray定律計算的等級分岔微通道網(wǎng)絡(luò)中，實現(xiàn)細胞的大批量培養(yǎng)。

實施例中細胞培養(yǎng)微器件通過示蹤粒子測速的方法來測量培養(yǎng)池內(nèi)流體的流動速度。具體的操作為先向微器件內(nèi)注滿去離子水，采用預(yù)先制作好的實心塞子將細胞進出樣孔密封住，然后通過硅膠管(內(nèi)徑為0.5mm～1.5mm,本實施例為1mm)和管接頭(外徑為0.5mm～1.5mm,本實施例為1mm)將微器件的培養(yǎng)液進樣孔與恒流注射泵上面的注射器連接在一起，培養(yǎng)液出液口通過管接頭和硅膠管通入廢液缸。微器件裝置置于倒置熒光顯微鏡下，注射器內(nèi)吸入混合均勻的微球懸浮液(濃度為0.005～0.05g/ml，本實施例為0.01g/ml)，設(shè)定好恒流注射泵的流量(1μl/min～15μl/min,本實施例為5μl/min)；開啟恒流注射泵，調(diào)整顯微鏡的亮度與焦距，使圖像聚焦在仿生培養(yǎng)層上的培養(yǎng)池的半高位置處，待觀察到的微球運動穩(wěn)定后，通過ccd相機記錄一定時間間隔內(nèi)(20ms～500ms，本實施例為50ms)的圖片；采用圖像處理軟件中的粒子追蹤模塊處理多張連續(xù)圖片，得到微球在培養(yǎng)池內(nèi)運動軌跡(如圖10所示)和平均運動速度(如圖11所示)。在一定范圍內(nèi)改變恒流注射泵的流量(本實施例為2μl/min,3μl/min,5μl/min,7μl/min)，以注射泵流量的變化代表微器件受到的外部擾動，測量不同注射泵流量下培養(yǎng)池內(nèi)流場的變化(如圖12所示)。

實施例中細胞培養(yǎng)微器件、硅膠管和管接頭在用于細胞培養(yǎng)之前高溫高壓滅菌1小時，滅好菌后包被鼠尾膠原蛋白(濃度為0.01mg/ml～0.02mg/ml，本實施例0.012mg/ml)或纖連蛋白(濃度為1μg/ml～10μg/ml，本實施例5μg/ml)，包被好膠原后置于孵育箱過夜，利于后續(xù)細胞貼壁。

實施例中細胞培養(yǎng)微器件在包被膠原過夜后通入pbs沖洗掉多余的蛋白，然后吸出pbs，隨后在微器件內(nèi)注滿細胞培養(yǎng)液，待細胞培養(yǎng)液注滿之后，通過細胞進樣孔將預(yù)先制好的hela細胞懸浮液(濃度為5×10⁵～5×10⁶個/ml，本實施例為2×10⁶個/ml)以5μl/min的注射泵流量注入培養(yǎng)池內(nèi)，待細胞出樣孔有液體冒出時停止注入。靜置片刻，將微器件置于顯微鏡下觀察細胞植入情況，然后將微器件放入co2孵育箱靜態(tài)孵育至大多數(shù)細胞貼壁。

實施例中細胞培養(yǎng)微器件在hela細胞貼壁后開始進行動態(tài)培養(yǎng)，具體為通過硅膠管和管接頭將微器件與注射泵連接在一起，預(yù)先在注射器和硅膠管內(nèi)充滿培養(yǎng)液，設(shè)定注射泵流量(2～20μl/min，本實施例為5μl/min)，開啟注射泵，推動注射器向微器件內(nèi)源源不斷的輸入新鮮的培養(yǎng)液并將細胞代謝廢液排出。細胞培養(yǎng)微器件在動態(tài)培養(yǎng)過程中每隔24小時對培養(yǎng)池內(nèi)的hela細胞進行一次觀察拍照(如圖13所示)，hela細胞鋪滿整個培養(yǎng)池后用dapi染色(如圖14所示)。統(tǒng)計每個時間段內(nèi)細胞的數(shù)量，繪制細胞生長曲線(如圖15所示)。