技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種解磷青霉菌及其應(yīng)用，屬于生物科技領(lǐng)域，具體涉及具有解磷作用的菌株，特別涉及解磷能力較高的兩株青霉菌菌株qm-6、qm-10。

背景技術(shù)：
：

磷是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素之一，是植物體內(nèi)核酸及多種酶、輔酶、atp等的重要組成成分，在植物生長發(fā)育中的作用僅次于氮。同時磷元素參與植物新陳代謝的途徑是多種多樣的，它不但可以提高作物的產(chǎn)量，還能增加植物的抗逆性，減輕植物病蟲害。植物所利用的磷主要是土壤中的有效磷，但是土壤中的磷95％以上為植物難以利用的無效磷，并且，我國75％左右的耕地土壤有效磷含量低。為了提高作物的產(chǎn)量，增加其抗逆性，每年都需要向土壤中施加大量的磷肥。但磷肥的當(dāng)季使用率一般只有5％-10％，施入土壤中的大部分磷與ca²⁺、fe³⁺、fe²⁺、al³⁺結(jié)合，形成難溶性磷酸鹽，導(dǎo)致土壤磷素快速積累。久而久之，施用的磷肥導(dǎo)致大多數(shù)農(nóng)田土壤潛在的磷庫含量很大，而提供作物生長發(fā)育的磷流卻很少，土壤缺磷是“遺傳學(xué)缺磷”而非“土壤學(xué)缺磷”。

現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有研究采用微生物方法解決上述土壤缺磷的狀況，但是其效果難以令人滿意。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的空白之處，本發(fā)明采用以ca3(po4)2作為唯一磷源的固體培養(yǎng)基，初步篩選到具有解磷作用的菌株，然后又利用無機(jī)磷液體培養(yǎng)基搖瓶試驗進(jìn)一步測定待測解磷菌株的解磷能力，確定青霉菌菌株qm-6、qm-10的解磷能力較高，這兩個菌株對應(yīng)的最大可溶性磷含量分別為1239.21mg/l，1386.93mg/l。利用its序列測定的方法，確定qm-6和qm-10為草酸青霉(penicilliumoxalicum)。通過溫室盆栽解磷試驗測定和促生作用分析，發(fā)現(xiàn)解磷菌株qm-6和qm-10能夠?qū)⑼寥乐兄参镫y以吸收利用的無效磷轉(zhuǎn)化為具有可溶性、可以被直接吸收利用的有效磷，能較好的促進(jìn)植物的生長，對減少磷肥的施用量具有重要的理論和實踐意義。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明首先從土壤中分離得到了兩株高效解磷青霉菌，分別來源于山東棲霞、蓬萊地區(qū)的果樹根際土壤，經(jīng)人工分離、篩選得到；該菌株鑒定為草酸青霉(penicilliumoxalicum)，命名為草酸青霉qm-6和qm-10，菌落為墨綠或者青綠色，背面淡黃或黃色。在顯微鏡下觀察，分生孢子梗經(jīng)過多次分枝，產(chǎn)生幾輪對稱或者不對稱的小梗，形如掃帚。

獲得上述青霉菌后，對其進(jìn)行了生物保藏，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號分別為cgmccno.12475和cgmccno.12476；

發(fā)明人進(jìn)一步對上述獲得的青霉菌進(jìn)行了功能研究，結(jié)果如下：

qm-6、qm-10的解磷能力較高，這兩個菌株對應(yīng)的最大可溶性磷含量分別為1239.21mg/l，1386.93mg/l；

經(jīng)草酸青霉qm-6和qm-10處理后，小麥幼苗生長指標(biāo)的變化，說明草酸青霉qm-6和qm-10可以有效的促進(jìn)小麥幼苗的生長。

綜上所述，本發(fā)明獲得了兩株青霉菌菌株qm-6和qm-10，其解磷能力較高，這兩個菌株對應(yīng)的最大可溶性磷含量分別為1239.21mg/l，1386.93mg/l，通過溫室盆栽解磷試驗測定和促生作用分析，發(fā)現(xiàn)解磷菌株qm-6和qm-10能夠?qū)⑼寥乐兄参镫y以吸收利用的無效磷轉(zhuǎn)化為具有可溶性、可以被直接吸收利用的有效磷，能較好的促進(jìn)植物的生長，對減少磷肥的施用量具有重要的理論和實踐意義。

發(fā)明人對本發(fā)明所公開的青霉菌菌株qm-6和qm-10進(jìn)行了生物保藏，具體保藏信息如下：

保藏信息

保藏時間：2016年5月27日

保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心cgmcc

保藏編號：cgmccno.12475

保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所

分類命名:草酸青霉penicilliumoxalicum

保藏時間：2016年5月27日

保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心cgmcc

保藏編號：cgmccno.12476

保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所

分類命名:草酸青霉penicilliumoxalicum

附圖說明

圖1為青霉菌菌株qm-6和qm-10解磷能力示意圖，

將菌株接種到含有難溶性磷酸鹽的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，溶磷圈的大小是表征菌株溶磷能力的一個重要指標(biāo)，由圖可以定性的說明該微生物具有解磷能力；

圖2為qm-6和qm-10最大可溶性磷含量檢測曲線圖，

圖中可以看到無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中qm-6和qm-10可溶性磷含量動態(tài)變化，其中qm-6最大可溶性磷含量分別為1239.21mg/l，qm-10最大可溶性磷含量分別為1386.93mg/l；

圖3為青霉菌菌株qm-6、qm-10菌絲體及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)微觀圖；

圖中a、c為qm-6的菌絲體及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)；b、d為qm-10的菌絲體及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)；

圖4為青霉菌菌株qm-6、qm-10的its序列擴(kuò)增結(jié)果示意圖，

圖中1為qm-6、2為qm-10，m為2000bpdnamarker，從圖中可以看出，兩者的片段長度約為550bp左右，符合常規(guī)的itsrdna序列長度；

圖5為青霉菌菌株qm-6、qm-10的與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹；

從圖中可以看出qm-6、qm-10與草酸青霉的遺傳進(jìn)化距離最近，可以確定兩者均為草酸青霉菌；

圖6為本發(fā)明中的磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，

圖中根據(jù)不同濃度的可溶性磷磷對應(yīng)的不同od值，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝0.528x+0.0007(r²＝0.9999)，其相關(guān)系數(shù)r²為0.9999，相關(guān)性非常高。根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線方程以及供試真菌在無機(jī)磷液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵產(chǎn)物的od值，可以計算出培養(yǎng)基中的可溶性磷含量；

圖7為qm-6和qm-10對小麥幼苗生長的影響示意圖；

圖8為qm-6和qm-10對煙草幼苗生長的影響示意圖；

從圖7、圖8可以看出經(jīng)兩種解磷真菌的孢子懸浮液處理后，小麥幼苗和煙草幼苗的生長情況明顯優(yōu)于對照。

具體實施方式

本發(fā)明實施例中所采用的培養(yǎng)基如下：

及組分如下：

1.pda培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖16g，瓊脂14g，蒸餾水1000ml，121℃高壓滅菌25min。

2.無機(jī)磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖10g，(nh4)2so40.5g，nacl0.3g，kcl0.3g，mgso4·7h2o0.3g，feso4·7h2o0.03g，mnso4·h2o0.03g，ca3(po4)25.0g，瓊脂20g，定容至1000ml，ph7.0-7.5。

3.無機(jī)磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖10g，(nh4)2so40.5g，nacl0.3g，kcl0.3g，mgso4·7h2o0.3g，feso4·7h2o0.03g，mnso4·h2o0.03g，ca3(po4)210.0g，定容至1000ml，ph7.0-7.5。

4.lb固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g,，nacl10g，瓊脂15g。

5.lb液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g。

實施例1供試菌株的純化培養(yǎng)

挑取保存于4℃的供試菌株于pda平板中央培養(yǎng)，抑菌劑為乳酸(25％)，28℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)3-4d后挑取菌落邊緣菌塊于pda平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)。

實施例2：高效解磷菌株的篩選

(一)高效解磷菌株的初篩

將菌株接種到含有難溶性無機(jī)磷酸鹽的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，根據(jù)菌落的生長情況及菌落周圍產(chǎn)生透明圈的大小來定性地檢測微生物是否具有解磷能力，具體步驟如下：

刮取菌落到盛有100ml無菌水的300ml三角瓶中，于28℃、160r/min的條件下，振蕩30min使孢子團(tuán)充分散開；用移液槍吸取孢子懸浮液置于血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，最終得到濃度為10⁸cfu/ml的孢子懸浮液；吸取孢子懸浮液50μl到pda培養(yǎng)基上，然后用無菌涂布器進(jìn)行涂布，28℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)3d；用直徑為0.7cm的打孔器打取菌餅并接種到無機(jī)磷固體培養(yǎng)基中，3次重復(fù)，28℃恒溫倒置培養(yǎng)7d，以無解磷能力的菌株作為對照；將有透明圈的菌落轉(zhuǎn)接到凍存管中，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(二)高效解磷菌株的復(fù)篩

將初篩獲得菌株制備成濃度為10⁸cfu/ml的孢子懸浮液，并按3vt％的接種量接種于裝有100ml無機(jī)磷液體培養(yǎng)基的300ml三角瓶中，28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)。分別在24、48、72、96、120、144、168h時取出用高速冷凍離心機(jī)進(jìn)行離心，取上清液備用；

采用鉬銻抗比色法測定上清液中的可溶性磷含量，具體方法如下：

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：(如圖6所示)

分別準(zhǔn)確吸取5mg/l的磷標(biāo)準(zhǔn)液0ml、2ml、4ml、6ml、8ml、10ml于50ml容量瓶中，加水定容至30ml，每個容量瓶中滴加兩滴2,4-二硝基苯酚指示劑，用稀h2so4和10％的naoh溶液調(diào)節(jié)ph值至溶液呈微黃色，然后加入鉬銻抗試劑5.0ml，最后加水定容至50ml，搖勻。放置30分鐘待反應(yīng)充分，在700nm下進(jìn)行比色測定其吸光值，以吸光度為縱坐標(biāo)，磷濃度(ug/ml)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線生成方程為：y＝0.528x+0.0007(r²＝0.9999)，其相關(guān)系數(shù)r²為0.9999，由此可知，該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，可以使用；

將10ml0.5mol/l的碳酸氫鈉加入三角瓶中，加入兩滴2,4-二硝基苯酚作為指示劑(用稀h2so4和10％的naoh溶液調(diào)節(jié)ph值至溶液呈微黃色)，再用滴定管準(zhǔn)確加入蒸餾水35.0ml，然后加入鉬銻抗試劑5.0ml，加入上清液，并定容至50ml，搖勻，放置30分鐘待反應(yīng)充分，在700nm下進(jìn)行比色，以空白液的吸收值為0，讀取待測液的吸收值，通過有效磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線計算溶液中有效磷含量，以確定菌株對ca3(po4)2的溶磷能力，進(jìn)而得到qm-6、qm-10的解磷能力較高的菌株，這兩個菌株對應(yīng)的最大可溶性磷含量分別為1239.21mg/l，1386.93mg/l(如圖2所示)，其解磷能力如圖1所示。

實施例3：供試真菌的菌株鑒定

將解磷真菌菌株qm-6、qm-10在pda平板上于生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一周左右，然后觀察其菌落形態(tài)、菌落的色素產(chǎn)生等情況。挑取少量菌絲以乳酚油為浮載劑制作玻片，于olympus顯微鏡下觀察小孢子的形態(tài)及著生方式，分生孢子梗的形態(tài)。參考中國真菌志(第三十五卷)-青霉屬及其相關(guān)有性屬、《真菌鑒定手冊》，對形態(tài)進(jìn)行觀察。

常規(guī)方法提取解磷真菌菌株qm-6、qm-10的基因組dna，以提取到的dna為模板，pcr擴(kuò)增菌株its序列。pcr的引物為：

its1序列為：5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’，其核苷酸序列如seqidno.1所示；

its4序列為：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’，其核苷酸序列如seqidno.2所示；

選用25μl反應(yīng)體系，各組分的成分如下:

擴(kuò)增反應(yīng)條件：

最終得到兩株高效解磷真菌菌株的its片段長度分布約為550bp(如圖4所示)，其中qm-6its序列如核苷酸序列如seqidno.3所示；qm-10its序列如核苷酸序列如seqidno.4所示；

itsrdna測序結(jié)果在genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blast比對，從結(jié)果中選取8株與測定菌株序列相似性高的菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，用mega5.05軟件采取neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖5)。

由圖可以看出篩選得到的兩株高效解磷真菌菌株與已知菌株草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)njdl-03的同源性達(dá)到100％。結(jié)合其菌體形態(tài)和菌落特征觀察結(jié)果，將其鑒定為草酸青霉(penicilliumoxalicum)，并對其進(jìn)行生物保藏。

實施例4：菌劑處理對小麥生長的影響

菌劑的制備：在無菌條件下分別刮取qm-6、qm-10菌株菌落于盛有100ml無菌水的300ml三角瓶中，于28℃、160r/min的條件下，振蕩30min使孢子團(tuán)充分散開。用移液槍吸取孢子懸浮液置于血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，使孢子懸浮液濃度達(dá)到10⁸cfu/ml，備用。

每個花盆裝500g按照1:1配比混合均勻的土與基質(zhì)，200mg難溶磷源，每盆播種10粒經(jīng)過催芽處理的小麥種子，每個處理5個重復(fù)。將備好的qm-6和qm-10孢子懸浮液澆灌于小麥根部土壤中，每盆10ml，以清水同樣處理為對照，每隔7d處理一次，共處理三次，45d后檢測植株的地上部鮮重、地下部鮮重及株高，結(jié)果如表2，用消煮釩鉬黃比色法測定植株及土壤中的全磷含量，結(jié)果如表3。

表2各處理對小麥生長的影響

由表2可見，經(jīng)qm-6和qm-10孢子懸浮液10ml處理后，小麥株高分別為36.50cm和36.25cm，分別比對照增加5.8％和5.1％，小麥地上部鮮重經(jīng)孢子懸浮液處理后都比對照明顯增加，分別增加16.0％和13.9％。與對照相比，根部鮮重也明顯增加，分別增加31.1％和14.2％?？梢娊?jīng)qm-6和qm-10孢子懸浮液處理后，小麥的生長情況優(yōu)于對照(如圖7所示)。經(jīng)差異顯著性檢驗，發(fā)現(xiàn)兩個處理間及處理與對照間，差異均達(dá)到顯著水平。

表3各處理對小麥和土壤有效磷含量的影響

qm-10孢子懸浮液10ml處理后，總有效磷含量明顯增加，分別比對照增加77.4％和94.1％。其中地上部植株全磷含量分別比對照增加45.1％和34.5％，土壤有效磷含量分別比對照增加109.4％和149.0％。可見經(jīng)qm-6和qm-10孢子懸浮液可以有效將土壤中的無效磷轉(zhuǎn)化為有效磷。經(jīng)差異顯著性分析，發(fā)現(xiàn)兩種處理與對照相比，均達(dá)到顯著差異水平。

實施例5：菌劑處理對煙草幼苗生長的影響

菌劑的制備同實施例4所示。每個花盆裝500g按照1:1配比混合均勻的土與基質(zhì)，200mg難溶磷源，選擇長勢一致的4-5葉期的煙草幼苗移栽至上述花盆中，每個處理5個重復(fù)。分別將實施例4中準(zhǔn)備好的qm-6和qm-10孢子懸浮液澆灌于煙草根部土壤中，每盆10ml，以清水同樣處理為對照，每隔7d處理一次，共處理三次，45d后檢測煙草幼苗的的地上部鮮重、地下部鮮重及株高，結(jié)果如表3，用消煮釩鉬黃比色法測定植株及土壤中的全磷含量，結(jié)果如表4。

表4各處理對煙草幼苗生長的影響

由表4可見，經(jīng)qm-6和qm-10孢子懸浮液10ml處理后，煙草幼苗株高分別為50cm和56.5cm，分別比對照增加23.5％和39.5％，煙草幼苗莖圍部鮮重經(jīng)孢子懸浮液處理后都比對照明顯增加，增加14.3％。與對照相比，處理組幼苗的最大葉長和葉寬也明顯增加?？梢娊?jīng)qm-6和qm-10孢子懸浮液處理后，煙草幼苗的生長情況優(yōu)于對照組(如圖8所示)。經(jīng)差異顯著性檢驗，發(fā)現(xiàn)兩種處理與對照相比，均達(dá)到顯著差異水平。

表5各處理對煙草幼苗和土壤有效磷含量的影響

由表5可見，經(jīng)qm-6和qm-10孢子懸浮液10ml處理后，煙草植株有效磷含量明顯增加，其中葉片全磷含量分別比對照增加12.5％和18.1％，莖有效磷含量分別比對照增加14.8％和19.5％。根部及土壤中的有效磷含量也明顯高于對照組，可見經(jīng)qm-6和qm-10孢子懸浮液可以有效將土壤中的無效磷轉(zhuǎn)化為有效磷。經(jīng)差異顯著性檢驗，發(fā)現(xiàn)兩種處理間及處理與對照相比，均達(dá)到顯著差異水平。

綜上所述，qm-6和qm-10孢子懸浮液對小麥幼苗及煙草幼苗的生長有明顯的促進(jìn)作用；qm-6和qm-10孢子懸浮液處理可明顯提高植株體內(nèi)及土壤中的有效磷含量；使其可以作為一種解磷促生菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要的作用。

上述雖然結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行了描述，但并非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。

<110>山東農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>解磷青霉菌及其應(yīng)用

<160>4

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tccgtaggtgaacctgcgg19

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tcctccgcttattgatatgc20

<210>3

<211>549

<212>dna

<213>草酸青霉菌penicilliumoxalicum

<400>3

gacctctgggtcacctcccacccgtgtttatcgtaccttgttgcttcggcgggcccgcct60

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<213>草酸青霉菌penicilliumoxalicum

<400>4

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