專利名稱：一種新的馬爾尼菲青霉菌40s核糖體蛋白s28、其編碼序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子免疫學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)和基因工程等領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)40S核糖體蛋白S28及其編碼序列。本發(fā)明還提供了該蛋白及其核酸序列的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
真菌基因組研究始于二十世紀(jì)九十年代，第一個(gè)完成全基因組測(cè)序的真菌是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，Goffeau et al.1996)。在過(guò)去的幾年里，F(xiàn)GI(Fungal Genome Initiative)委員會(huì)從150多萬(wàn)種真菌中，選取了15個(gè)在醫(yī)藥和工農(nóng)業(yè)中具有重要價(jià)值的物種進(jìn)行了基因組學(xué)的研究。2003年6月，F(xiàn)GI委員會(huì)新增了44個(gè)物種，其中包括了馬爾尼菲青霉菌。
馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei，PM)是Capponi等首先于1956年在越南從一只中華竹鼠的肝臟分離出來(lái)的一種青霉，以其研究所主任Marneffei的名字命名。但此后并沒(méi)有引起人們的注意。1973年Disalvo在美國(guó)南卡首次發(fā)現(xiàn)人自然感染的病例，患者是一位曾在東南亞旅行過(guò)的傳教士。
1964年鄧卓霖在廣西一土生農(nóng)民身上發(fā)現(xiàn)此菌，但當(dāng)時(shí)全世界都還沒(méi)有此病報(bào)導(dǎo)，故將其認(rèn)定為莢膜組織胞漿菌。1984年鄧卓霖在國(guó)內(nèi)首例報(bào)導(dǎo)了一例馬爾尼菲青霉病。
從1984年到1987年，廣西醫(yī)科大學(xué)病理科收集的19全身播散型病例中，有4例發(fā)現(xiàn)有導(dǎo)致免疫缺陷的疾病，如淋巴瘤，白血病，先天性胸腺發(fā)育不良，SLE(系統(tǒng)性紅斑斕創(chuàng))，TB(結(jié)核)等。1999年，鄧卓霖首先發(fā)現(xiàn)了國(guó)內(nèi)第一例合并AIDS的患者。近幾年國(guó)內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的病例中，合并AIDS的患者越來(lái)越多。泰國(guó)至1998年已有1300例合并AIDS的患者。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)70-80％的AIDS的患者后期感染上馬爾尼菲青霉菌。
馬爾尼菲青霉菌多呈條件致病菌，25℃呈絲狀真菌，為非致病菌；37℃呈酵母形態(tài)，為致病菌。它是一種深部致病真菌。它侵犯人體的單核巨噬系統(tǒng)，破壞人的免疫系統(tǒng)，使人體的免疫力下降。由于它在局部的機(jī)械破壞作用，以及代謝產(chǎn)物，毒素等作用，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致濃腫，肉芽腫等改變。并容易破壞血管進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致敗血癥。進(jìn)入人體的途徑一般是呼吸道或皮膚。
核糖體是合成蛋白質(zhì)的部位，它是一個(gè)巨大的核糖體蛋白體。在真核細(xì)胞中的核糖體即可游離存在，也可以與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相結(jié)合，形成粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。每個(gè)真核細(xì)胞所含核糖體的數(shù)目為106-107。線粒體、葉綠體及胞核內(nèi)也有自己的核糖體。真核細(xì)胞核糖體為80S，由40S和60S兩個(gè)亞基組成，主要由rRNA和核糖體蛋白組成。核糖體蛋白既具有結(jié)構(gòu)上的功能，又是翻譯過(guò)程中必不可少的因子。核糖體蛋白大多數(shù)蛋白呈纖維狀，只有極少數(shù)是呈球狀的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28、其編碼序列及該蛋白的應(yīng)用。
本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種來(lái)自馬爾尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)的分離的多核苷酸，其含有編碼馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28的多核苷酸序列，所述多核苷酸選自a)與編碼含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％同源性的多核苷酸，b)編碼含有與SEQ ID NO.2的氨基酸序列至少70％同源性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，以及d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基的多核苷酸。
較佳的，所述的多核苷酸編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
或者較佳的，所述的多核苷酸含有(i)如SEQ ID NO.1中核苷酸52-258位的核苷酸序列，或(ii)在遺傳密碼簡(jiǎn)并范圍內(nèi)相應(yīng)于(i)序列的至少一個(gè)序列，或(iii)與互補(bǔ)于(i)或(ii)序列的序列雜交的至少一個(gè)序列，和任選地(iv)(i)中中性功能的有義突變。
更佳的，所述的多核苷酸含有SEQ ID NO.1中核苷酸52-258位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的多肽，所述多肽具有與SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列或其片段。較佳的，所述多肽是含有SEQID NO.2所示氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的再一方面，提供了一種載體，所述載體含上述分離出的多核苷酸。
在本發(fā)明的再一方面，提供了一種遺傳工程宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)具有馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28蛋白活性的多肽的方法，該方法包括如下步驟(1)將編碼具有S28蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成抗原表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸52-258位的核苷酸序列有至少70％同源性；(II)將步驟(I)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成馬爾尼菲青霉菌S28重組細(xì)胞；(III)在適合表達(dá)馬爾尼菲青霉菌S28多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(II)中的重組細(xì)胞；(IV)分離出具有S28蛋白活性的多肽。
較佳的，上述生產(chǎn)具有馬爾尼菲青霉菌S28蛋白活性的多肽的方法中，所述核苷酸序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸52-258位的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了一種抗體，所述抗體是能與上述馬爾尼菲青霉菌S28特異性結(jié)合的抗體。
本發(fā)明還包括一種探針?lè)肿樱撎结樂(lè)肿油ǔ：旭R爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28的核苷酸序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針?lè)肿涌捎糜跈z測(cè)樣品中是否存在編碼馬爾尼菲青霉菌S28的核酸分子。
本發(fā)明還提供了含所述的多肽或其連續(xù)片段的藥物組合物。
本發(fā)明還提供了所述的多核苷酸、多肽及抗體在制備診斷和治療針對(duì)馬爾尼菲青霉菌引起的疾病的藥物及試劑盒中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了包含所述的多核苷酸、多肽或抗體或它們的連續(xù)片斷的試劑盒及生物芯片。
本發(fā)明還包括檢測(cè)馬爾尼菲青霉菌S28的核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于馬爾尼菲青霉菌S28的編碼序列，可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為20-50個(gè)核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28及其基因，可為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)針對(duì)該病菌引起的疾病的藥物提供重要的參考價(jià)值，同時(shí)，它們也可以作為這類疾病診治的潛在藥物靶點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA，或人工化學(xué)合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。單鏈的DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
在本發(fā)明中，“分離的”多核苷酸是指，該多核苷酸或片斷已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該多核苷酸或片斷已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。
本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28的編碼序列”是指編碼具有馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28活性的多肽的核苷酸序列，如SEQID NO.1中52-258位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ IDNO.1序列的編碼框52-258位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO.1中52-258位核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID NO.1中從核苷酸52-258位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸52-258位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1中開(kāi)放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28”是指具有馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與馬爾尼菲青霉菌S28相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28的活性片斷和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與馬爾尼菲青霉菌S28的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗馬爾尼菲青霉菌S28的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含馬爾尼菲青霉菌S28或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還提供了馬爾尼菲青霉菌S28的可溶性片段。通常，該片段具有馬爾尼菲青霉菌S28多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28的類似物。這些類似物與天然多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還可以包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28具有特異性的抗體，尤其是單克隆抗體。這里“特異性”是指抗體能結(jié)合于馬爾尼菲青霉菌S28或片段。較佳地，指那些能與馬爾尼菲青霉菌S28或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制馬爾尼菲青霉菌S28的分子，也包括那些并不影響S28蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的S28結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專利NO.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來(lái)自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的馬爾尼菲青霉菌S28或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)馬爾尼菲青霉菌S28或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來(lái)免疫動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備(見(jiàn)Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies andT Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷馬爾尼菲青霉菌S28的抗體以及不影響其功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用馬爾尼菲青霉菌S28的片段或功能區(qū)，通過(guò)免疫技術(shù)獲得，這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與馬爾尼菲青霉菌S28的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而獲得。
本發(fā)明的馬爾尼菲青霉菌S28核苷酸序列全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按已知方法制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列，這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。當(dāng)然，也可通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得序列很長(zhǎng)的片段。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1馬爾尼菲青霉菌S28基因的克隆1.總RNA分離(Totle RNA isolation)將馬爾尼菲青霉菌，在37℃或25℃培養(yǎng)后，離心棄上清取菌體，加入TRIzolReagents抽提其總RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。
2.mRNA的分離(mRNA isolation)用帶Oligo d(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA(Invitrogen，Carlsbad，CA)，定量。
3.cDNA文庫(kù)的構(gòu)建(Construction of cDNA library)以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成雙鏈cDNA。過(guò)柱篩選長(zhǎng)度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，無(wú)菌水溶解，連接至pDONRTM222(Invitrogen，Carlsbad，CA)載體，以CloneMinerTMcDNA Library Construction Kit(Invitrogen，Carlsbad，CA)進(jìn)行包裝，電擊轉(zhuǎn)化，宿主菌使用DH10B(Invitrogen，Carlsbad，CA)細(xì)菌。涂板并測(cè)定滴度。
4.測(cè)序及數(shù)據(jù)庫(kù)建立(Seqencing and Database Constructing)挑選文庫(kù)中有外源片段插入的克隆，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作為3’端和5’端的通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測(cè)序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行EST大規(guī)模測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用FACTURA軟件去除載體序列，傳輸?shù)絊UN Ultra 450Server上進(jìn)行下一步的處理。所有的序列信息再用GCG軟件包(Wisconsingroup，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(kù)(Genebank+EMBL)，將無(wú)同源性或同源性低于95％的序列視為新基因建立數(shù)據(jù)庫(kù)。
5.基因的全長(zhǎng)克隆(Cloning of Full-length cDNA)在得到的新基因片段序列信息基礎(chǔ)上，進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆，分兩階段進(jìn)行(1)“電子克隆”(Electronic Cloning)以新基因片段序列作為探針?biāo)褜bEST數(shù)據(jù)庫(kù)，將重疊序列＞50bp，同源性在98％以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tag，簡(jiǎn)稱“EST”)序列認(rèn)為同一序列(consensus sequence)，取出并用AUTOASSEMBLER軟件進(jìn)行拼接，部分EST可以延伸探針序列。再用STRIDER軟件分析被延伸的序列是否具有完整的開(kāi)放閱讀框架(Open Reading Frame，ORF)，用BLAST搜尋Genbank或SwissProt以確定該序列在核苷酸和氨基酸水平上是否與其他物種有同源性，以幫助判別所得到的基因全長(zhǎng)完整性如何。通過(guò)電子克隆的方法，通?？色@取馬爾尼菲青霉菌S28基因的全長(zhǎng)序列。
(2)cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)如果通過(guò)“電子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全長(zhǎng)，則在已有序列的5’或3’端設(shè)計(jì)引物，在馬爾尼菲青霉菌cDNA文庫(kù)中進(jìn)行長(zhǎng)距離PCR反應(yīng)。然后對(duì)PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER軟件分析被延長(zhǎng)的序列有無(wú)完整的ORF，如無(wú)，重復(fù)上述過(guò)程直至獲得全長(zhǎng)。
(3)RT-PCR對(duì)于5’和3’端已知的序列，如果中間尚有一段間隙(gap)無(wú)法從已有的公共數(shù)據(jù)庫(kù)或自身數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，可考慮采用RT-PCR的方法。在序列5’端設(shè)計(jì)引物，3’端引物采用Oligo-dT，在馬爾尼菲青霉總RNA庫(kù)中進(jìn)行擴(kuò)增。然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序。最后拼接并獲得全長(zhǎng)。
通過(guò)組合使用上述3種方法，獲得了候選的馬爾尼菲青霉菌S28的全長(zhǎng)編碼序列，即獲得SEQ ID NO.1所示的序列。
根據(jù)得到的全長(zhǎng)cDNA序列推導(dǎo)出S28的氨基酸序列，共68個(gè)氨基酸，其氨基酸序列詳見(jiàn)SEQ ID NO.2。
實(shí)施例2馬爾尼菲青霉菌基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28基因的全長(zhǎng)cDNA為710bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.1，其中開(kāi)放讀框位于52-258位核苷酸。根據(jù)全長(zhǎng)cDNA推導(dǎo)出馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28的氨基酸序列，共68個(gè)氨基酸殘基。詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.2。
將馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在氨基酸水平上，它與裂殖酵母40S核糖體蛋白S28(40S核糖體蛋白S28 ribosomal protein S28，SwissProtAccession No.Q10421)的第1-54位氨基酸殘基有88％的相同性和93％的相似性。由上可見(jiàn)，馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28基因與裂殖酵母40S核糖體蛋白S28基因在蛋白水平上存在較高的同源性，屬于同一家族并且兩者在功能上也有很高相似性。
本發(fā)明的馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明的馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明的馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28蛋白的N端與裂殖酵母40S核糖體蛋白S28的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對(duì)本發(fā)明馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
實(shí)施例3馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28的結(jié)構(gòu)和功能研究將馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28的氨基酸序列在PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)(網(wǎng)址為http//expasy.hcuge.ch/sprot/scnpsitl.html)中檢索基序(motif)，得到以下結(jié)果在氨基酸序列中，存在以下功能基序(i)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(Protein kinase C phosphorylation site)3-5，60-62(ii)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)(Casein kinase II phosphorylationsite)60-63(iii)N-豆蔻酰化位點(diǎn)(N-myristoylation site)21-26(iv)核糖體蛋白S28信號(hào)(Ribosomal protein S28e signature)59-67
而蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)和N-豆蔻酰化位點(diǎn)均與翻譯后修飾(post-translational modifications)有關(guān)，并且這些位點(diǎn)在藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，可作為治療由馬爾尼菲青霉菌引起的疾病的藥物的作用靶點(diǎn)。
實(shí)施例4馬爾尼菲青霉菌S28基因的生長(zhǎng)發(fā)育表達(dá)譜電子Northern表達(dá)譜。按Ton C.等人的方法(Ton C et al.，Biochem BiophysRes Commun 1997 Dec 18；241(2)589-594；Hwang DM，et al.，Circulation1997 Dec 16；96(12)4146-4203)，將馬爾尼菲青霉菌S28 cDNA序列在GCG軟件包中的dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)中做BLAST檢索，在得到的EST中，概率值＜10e-10、相同性＞95％的EST，可視為該基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)本，由此得出表達(dá)該基因的生長(zhǎng)發(fā)育譜，揭示它在馬爾尼菲青霉菌不同發(fā)育階段中都發(fā)揮著重要作用。
實(shí)施例5馬爾尼菲青霉菌S28的制備和提純?cè)谠搶?shí)施例中，將全長(zhǎng)的馬爾尼菲青霉菌S28編碼序列或片斷構(gòu)建入商品化的蛋白質(zhì)融合表達(dá)載體之中，以表達(dá)和提純重組蛋白。
(1)原核表達(dá)載體的構(gòu)建，以及轉(zhuǎn)化大腸桿菌根據(jù)馬爾尼菲青霉菌S28的全長(zhǎng)編碼序列(SEQ ID NO.1)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物(分別對(duì)應(yīng)于編碼序列5’和3’端的約20個(gè)以上核苷酸)，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這根據(jù)選用的pDESTTM17載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。將馬爾尼菲青霉菌S28基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pDESTTM17載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鑒定好的表達(dá)載體利用電擊轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，篩選鑒定得到含有pDESTTM17-S28表達(dá)載體的工程菌BL21-pDESTTM17-S28。
(2)表達(dá)GST-S28重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的BL21-pDESTTM17-S28工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過(guò)夜，按1∶100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時(shí)，至OD600達(dá)0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續(xù)于37℃分別培養(yǎng)0，1，2，3小時(shí)。取培養(yǎng)時(shí)間不同的1ml菌液離心，在細(xì)菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水4μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細(xì)菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導(dǎo)時(shí)間增加而增加的菌株即為表達(dá)GST-S28融合蛋白的工程菌。
(3)GST-S28融合蛋白的提取純化按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)GST-S28融合表達(dá)蛋白的工程菌BL21-pDESTM17-S28。誘導(dǎo)后的細(xì)菌離心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重懸細(xì)菌，超聲破碎細(xì)菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振搖結(jié)合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉淀結(jié)合了GST-S28的谷胱苷肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗兩次，而后按每毫升超聲液所得沉淀加入10μl還原型谷胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000rpm離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重復(fù)洗脫兩次。洗脫的上清保存于-80℃，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)純化效果。在7.6kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為馬爾尼菲青霉菌S28蛋白。
實(shí)施例6馬爾尼菲青霉菌S28在酵母中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)
1.馬爾尼菲青霉菌S28酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化根據(jù)馬爾尼菲青霉菌S28的全長(zhǎng)編碼序列(SEQ ID NO.1)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。將馬爾尼菲青霉菌S28的cDNA在保證閱讀框架的前提下克隆至pYES2-DEST52載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鑒定好的表達(dá)載體利用電擊轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞DB3.1中，利用氨芐青霉素篩選鑒定得到含有pYES2-DEST52-S28表達(dá)載體的工程菌DB3.1-pYES2-DEST52-S28。
2.表達(dá)S28重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的DB3.1-pYES2-DEST52-S28工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過(guò)夜，按1∶100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的YPD培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)至OD600達(dá)0.5。取1ml菌液離心，在菌體沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸菌體沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量的菌株即為表達(dá)馬爾尼菲青霉菌S28融合蛋白的工程菌。
收集轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行Western鑒定。將菌體裂解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后的膠于Pharmacia的Multiphor II半干電轉(zhuǎn)移儀中將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，將硝酸纖維膜置于封閉液中封閉1小時(shí)，而后于抗馬爾尼菲青霉菌S28的抗體溶液中封閉1小時(shí)，TBS液振搖清洗5分鐘共2次，而后將膜置于生物素標(biāo)記的抗馬爾尼菲青霉菌S28一抗的第二抗體溶液中振搖1小時(shí)，TBS清洗，加入親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物反應(yīng)30分鐘，TBS清洗2次，加入新鮮配制的顯色液顯色觀察蛋白條帶。
挑取高表達(dá)馬爾尼菲青霉菌S28的克隆。
3.馬爾尼菲青霉菌S28的提取純化按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)S28的工程菌DB3.1-pYES2-DEST52-S28。收集菌體沉淀，菌體沉淀加入PBS重懸菌體，超聲破碎菌體，離心，清洗幾次，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)純化效果。在7.6kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為馬爾尼菲青霉菌S28。
實(shí)施例7抗馬爾尼菲青霉菌S28抗體的制備將實(shí)施例5和實(shí)施例6中獲得的馬爾尼菲青霉菌S28用層析法進(jìn)行分離后備用，也可以用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中割下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。取6-8周齡Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化過(guò)的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量再加強(qiáng)免疫一次，3-5天后用于融合。然后制備飼養(yǎng)細(xì)胞，再進(jìn)行細(xì)胞融合。
在細(xì)胞融合10-15天后，需逐孔進(jìn)行檢查，一旦發(fā)現(xiàn)旺盛的雜交細(xì)胞集落生長(zhǎng)，就應(yīng)用馬爾尼菲青霉菌S28做抗體活性的初步篩選，常用的方法有免疫熒光試驗(yàn)、發(fā)射免疫試驗(yàn)(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。檢查出抗體活性的孔后，立刻進(jìn)行克隆培養(yǎng)，并分離出抗體。
實(shí)施例8馬爾尼菲青霉菌S28基因用于制備生物芯片用獲取的馬爾尼菲青霉菌S28基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出全長(zhǎng)的馬爾尼菲青霉菌S28基因或該基因的部分片斷，用作生物芯片點(diǎn)樣的樣品。
用英國(guó)的BioRobotics自動(dòng)點(diǎn)膜儀將樣品點(diǎn)在8×12cm尼龍膜上，每一標(biāo)本點(diǎn)4個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)的DNA量約為10ng。陽(yáng)性對(duì)照是重復(fù)4次點(diǎn)樣的人β-actin基因，陰性對(duì)照是重復(fù)4次點(diǎn)樣的λ噬菌體DNA。
含有馬爾尼菲青霉菌S28基因的芯片可用于感染馬爾尼菲青霉菌疾病的診斷和藥物篩選。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>一種新的馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28、其編碼序列及其應(yīng)用<130>NP-1256<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>710<212>DNA<213>馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)<220>
<221>CDS<222>(52)..(258)<400>1ttccgtttta cttcgaacaa atcaattttc gaatacacat catcattcaa g atg gat57Met Asp1tcc gcc aag gtc cct gtt aag ctt gtc aag gtc acc cgc gtt ttg ggc105Ser Ala Lys Val Pro Val Lys Leu Val Lys Val Thr Arg Val Leu Gly5 10 15cga act ggt tct cgc ggt ggt gtc acc caa gtc cgc gtc gaa ttc atg153Arg Thr Gly Ser Arg Gly Gly Val Thr Gln Val Arg Val Glu Phe Met20 25 30gac gac cag acc cgt tcc atc atc cgt aac gtc aag gga ccc gtc cgc201Asp Asp Gln Thr Arg Ser Ile Ile Arg Asn Val Lys Gly Pro Val Arg35 40 45 50gaa gac gat atc ctc tgc ctc ctc gaa tcc gag cgt gag gcc cgt cgt249Glu Asp Asp Ile Leu Cys Leu Leu Glu Ser Glu Arg Glu Ala Arg Arg55 60 65ctc cga taa atgccttttt ttcccctgca aaattaaaaa acacttggag298Leu Argaaaaaaaaaa catggcaaaa aagtacgaaa tggatggagt tgtgggaaag aacgagggaa 358gaagaactgg acgtgtggat tattatacct tttttcagca ttgacgagcc attcatcatt 418
acttgatacg aaccgagttt gtgtatgagg ggataaatcg acaatactct tctattcttt478ctaccgattc tttctacttt ttgatatcca attcgacgaa catgggaggc gagatggggg538gaagatcagg tcataggtct tttaaccatt gattttaact ttttctgtgt gtttgtcata598taaatgaaac caaacatact tttttaacga cgataccgtt gatgggattg gaaaaaaatc658ggatggagtt tttatttctc ttctttctag gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa cc710<210>2<211>68<212>PRT<213>馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)<400>2Met Asp Ser Ala Lys Val Pro Val Lys Leu Val Lys Val Thr Arg Val1 5 10 15Leu Gly Arg Thr Gly Ser Arg Gly Gly Val Thr Gln Val Arg Val Glu20 25 30Phe Met Asp Asp Gln Thr Arg Ser Ile Ile Arg Asn Val Lys Gly Pro35 40 45Val Arg Glu Asp Asp Ile Leu Cys Leu Leu Glu Ser Glu Arg Glu Ala50 55 60Arg Arg Leu Arg6權(quán)利要求
1.一種來(lái)自馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)的分離的多核苷酸，其含有編碼馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28的多核苷酸序列，所述多核苷酸選自a)與編碼含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％同源性的多核苷酸，b)編碼含有與SEQ ID NO.2的氨基酸序列至少70％同源性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，以及d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基的多核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸含有(i)如SEQ ID NO.1中核苷酸52-258位的核苷酸序列，或(ii)在遺傳密碼簡(jiǎn)并范圍內(nèi)相應(yīng)于(i)序列的至少一個(gè)序列，或(iii)與互補(bǔ)于(i)或(ii)序列的序列雜交的至少一個(gè)序列，和任選地(iv)(i)中中性功能的有義突變。
4.如權(quán)利要求3所述的一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸含有SEQ ID NO.1中核苷酸52-258位的核苷酸序列。
5.一種分離的多肽，其特征在于，所述多肽具有與SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列或其片段。
6.如權(quán)利要求5所述的一種分離的多肽，其特征在于，所述多肽是含有SEQID NO.2所示氨基酸序列的多肽。
7.一種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸。
8.一種遺傳工程宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是用權(quán)利要求7所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
9.一種生產(chǎn)具有馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(I)將編碼具有馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ IDNO.1中從核苷酸52-258位的核苷酸序列有至少70％同源性；(II)將步驟(I)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28重組細(xì)胞；(III)在適合表達(dá)馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(II)中的重組細(xì)胞；(IV)分離出具有馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28活性的多肽。
10.如權(quán)利要求9所述的一種生產(chǎn)具有馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28活性的多肽的方法，其特征在于，所述核苷酸序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸52-258位的核苷酸序列。
11.一種抗體，其特征在于，所述抗體是能與權(quán)利要求5或6所述的多肽特異性結(jié)合的抗體。
12.一種探針?lè)肿?，其特征在于，所述的探針?lè)肿雍袡?quán)利要求1所述的多核苷酸中8-100個(gè)連續(xù)的核苷酸。
13.權(quán)利要求5或6的多肽在制備治療針對(duì)馬爾尼菲青霉菌引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
14.含有權(quán)利要求5或6的多肽的藥物組合物。
15.一種用于診斷和治療針對(duì)馬爾尼菲青霉菌引起的疾病的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含權(quán)利要求1～4中任一種多核苷酸序列或其連續(xù)片段，或者所述試劑盒包含權(quán)利要求5或6的多肽或其連續(xù)片段，或者所述試劑盒包含權(quán)利要求11的抗體。
16.一種生物芯片，其特征在于所述生物芯片的載體上含有權(quán)利要求1～4中任一種多核苷酸序列或其連續(xù)片段，或者所述生物芯片的載體上含有權(quán)利要求5或6的多肽或其連續(xù)片段，或者所述生物芯片的載體上包含權(quán)利要求11的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)中表達(dá)的新的馬爾尼菲青霉菌40S核糖體蛋白S28及其編碼序列，本發(fā)明還提供了該S28蛋白及其核酸的制備方法及其應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的馬爾尼菲青霉菌S28蛋白及其基因，可為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)針對(duì)該病菌引起的疾病的藥物提供重要的參考價(jià)值，同時(shí)，它們也可以作為這類疾病診治的潛在藥物靶點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K38/16GK1680553SQ200410017459
公開(kāi)日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2004年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月5日
發(fā)明者任雙喜, 湯生榮, 卜云萍, 嚴(yán)中華, 盧凌峰, 殷世亮, 李運(yùn)千, 施煒亮, 武金煒 申請(qǐng)人:上海人類基因組研究中心