專利名稱：一種海洋青霉菌菌株及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海洋青霉菌菌株及其應用。
背景技術(shù)：
海洋青霉是一類廣泛存在于海洋的好氧性真菌，長期以來青霉一直用作檸檬酸、 延胡索酸、葡萄糖酸、抗生素的工業(yè)生產(chǎn)菌。海洋微生物所處的特殊環(huán)境，使其很大程度上演變成新的種群或具有新的特殊生理功能的亞種，形成了陸生微生物所不具有的特性。微生物是開發(fā)研制抗生素及其他生理活性物質(zhì)的重要資源。近幾年來，深部真菌病發(fā)生率有明顯的上升趨勢。隨著從海洋真菌發(fā)現(xiàn)新化合物速率不斷增加，人們希望通過對海洋真菌的研究開發(fā)，獲得更多的新型生物活性物質(zhì)。在對海洋真菌的分離鑒定中目前沿用了傳統(tǒng)的分離鑒定方法，即通過表型特征和細胞形態(tài)學的觀察，對真菌生理生化反應和細胞組成成分結(jié)構(gòu)進行比較分析來實現(xiàn)分類鑒定。隨著生物化學、遺傳學以及分子生物學、生物信息學等相關(guān)學科的發(fā)展，同時，也是海洋真菌分類學自身發(fā)展的客觀要求，分子生物學鑒定方法被引入海洋真菌的菌種鑒定中，使菌種的鑒定在以形態(tài)特征和生理生化特征為基礎(chǔ)的鑒定上更加準確、可靠。真菌的核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS (internal transcribed spacer)位于18S和 5. 8S rDNA (ITSl)以及5. 8S和^S rDNA(ITS2)之間，是中度保守區(qū)域，長度大約在550 750bp。由于ITS區(qū)不加入成熟核糖體，因此在進化過程中承受的自然選擇壓力非常小，能容忍更多的變異，表現(xiàn)為種內(nèi)菌株間相對保守，但在種間的差異非常明顯，這種特點使其非常適用于對真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，即使是親緣關(guān)系非常接近的兩個種都能在ITS序列上表現(xiàn)出差異，顯示其最近的進化特征。研究表明，ITS片段的進化速率是18s rDNA的10倍，這就是ITS序列在微生物種類鑒定和群落分析的理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種海洋青霉菌菌株，具有很好的抑制真菌的作用，尤其對金黃色葡萄球菌具有強烈的抑菌作用，對黑曲霉，白色假絲酵母，大腸桿菌等也具有很好的抑制效果，對于真菌病的治療具有重要意義。一種海洋青霉菌菌株，命名為灰黃青霉(Penicillium griseofulvum) ζ ju87，保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所的中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期為2011年5月19日，保藏號為CGMCC No. 4888。所述的灰黃青霉zju87的ITS的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的灰黃青霉zju87分離自浙江東海海泥，在常溫和篩選培養(yǎng)基上生長良好， 菌落表面呈灰綠色，反面呈淺黃色，菌落在培養(yǎng)第二天開始產(chǎn)孢子，并在第三天完全成熟。本發(fā)明還提供了上述灰黃青霉zju87在抑制金黃色葡萄球菌生長中的應用。
通過對灰黃青霉zju87進行抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)該菌株對金黃色葡萄球菌 (Staphycococcus aureus)具有強烈的抑菌作用，同時還對黑曲霉(Aspergillus niger), 白色假絲酵母(Candida albicans)，大腸桿菌(Escherichia coli)等也具有很好的抑制效果；通過對灰黃青霉zju87的形態(tài)觀察、培養(yǎng)特征及ITS序列分析，灰黃青霉zju87具備典型的青霉屬形態(tài)特征，ITS堿基序列與灰黃青霉(Penicillium griseofulvum strain 091402)的同源性為99%。


圖1是本發(fā)明海洋青霉菌菌株的形態(tài)學結(jié)構(gòu)特征圖；圖2是本發(fā)明海洋青霉菌菌株的ITS序列PCR產(chǎn)物的電泳檢測圖。(其中M:DL3000 Marker ；1 海洋青霉菌菌株的ITS序列)
具體實施例方式篩選/種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10、可溶性淀粉10、蛋白胨2、酵母膏1、FeSO4 0. 01、海水 / 蒸餾水(3/ 、pH7. 2 7. 5 ；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)可溶性淀粉20、黃豆餅粉2、酵母膏1、K2HPO4U FeSO4 0. 01、 MgSO4 0. 5、海水 / 蒸餾水(3/2)、ρΗ7· 2 7. 5 ；金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨10、牛肉膏3、瓊脂粉20、NaCl 5、pH 7.4 ；LB 培養(yǎng)基(g/L)酵母粉 5、蛋白胨 10、NaCl 5、調(diào) ρΗ7· 4 7. 6。供試菌株金黃色葡萄球菌 Gtaphycococcus aureus)ATCC29213 ；黑曲霉(Aspergillus niger) ATCC20611 ；大腸桿菌(Escherichia coli) ATCC8739 ；白色假絲酵母(Candida albicans) ATCC10231，上述菌株均為試驗菌株，無特異性要求。實施例1菌株分離純化海泥樣品在浙江東海劃定的區(qū)域內(nèi)進行五點交叉采樣，每點采取海泥樣10g，放入錐形瓶內(nèi)，混勻后取海泥樣品10g，加到一個裝有90mL無菌水的錐形瓶中，置于搖床上振蕩 30min，使海泥樣中的菌體充分分散于水中，即為10—1菌液。接種環(huán)火焰滅菌冷卻后蘸取一環(huán)稀釋度為KT1菌液，在篩選培養(yǎng)基平板上作四區(qū)劃線接種培養(yǎng)48h，然后挑取單菌落劃線，進一步純化。將培養(yǎng)后的單菌落連同周圍的小塊瓊脂用打孔器取出，移入無培養(yǎng)基平皿二8°C 培養(yǎng)4d后移入涂布金黃色葡萄球菌的平板，瓊脂塊中心間隔距離為km，培養(yǎng)過夜，根據(jù)抑制圈大小選擇單菌落進行復篩。取初篩得到50株菌株，接入到種子培養(yǎng)基中，250mL錐形瓶中裝25mL培養(yǎng)基，初始 PH 7. 2 7. 5J8°C下200r/min培養(yǎng)Mh。再將種子液以8% (ν/ν)的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，250mL三角瓶中裝40mL培養(yǎng)基，28°C> pH 7. 2 7. 5下200r/min培養(yǎng)4d，比較 50株菌種發(fā)酵液抑制金黃色葡萄球菌的程度，最終獲得1株最高效抑制金黃色葡萄球菌的菌株，編號為zju87。斜面保藏(篩選培養(yǎng)基)菌株于4°C冰箱中，長期保藏采用甘油管保藏法于-20°C凍存。實施例2菌種鑒定
(1)形態(tài)觀察在常溫和篩選培養(yǎng)基上生長良好，菌落表面呈綠色，反面呈淺黃色，菌落形態(tài)較圓整。在培養(yǎng)第二天開始產(chǎn)孢子，并在第三天完全成熟。在平板上培養(yǎng)三天后，挑取單菌落，在光學顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖1所示，根據(jù)形態(tài)觀察和光學顯微鏡下孢子及菌絲體的觀察， 可初步鑒定為青霉菌。(2) ITS序列分析取1環(huán)經(jīng)活化的海洋霉菌zju87菌種，接入到錐形瓶中，250mL錐形瓶中裝IOOmL 篩選培養(yǎng)基，初始pH值7. 2 7. 5，下200r/min培養(yǎng)3d后，用紗布過濾，60°C烘干后用液氮進行破壁，置于-20°C冰箱中。利用下述改良CTAB法進行菌種基因組DNA提取， 在-20°C下保存。改良CTAB 法(a)取1.5mL EP管，挑取覆蓋管底Imm破壁后的菌體，加入545 μ L TE緩沖液 (10mmol/L Tris. HCl，pH 8. 0 ； lmmol/L EDTA, pH 8. 0)，加入 20 μ L 溶菌酶(20mg/mL)，用槍頭反復吹打使之重懸，然后加入30 μ L 10%305和61^ 10mg/mL的蛋白酶K，37°C溫浴 3h ；(b)力口 5μ L 10mg/mL RNase A，37°C溫浴 Ih ；(c)加 100 μ L 5mol/L NaCl，充分混勻，再加 80 μ L CTAB/NaCl，混勻，65°C溫浴 IOmin ；(d)加入與上述總體積等體積的氯仿/異戊醇(ν/ν 24 1)，混勻后16000 X g，離心5min，重復三次后轉(zhuǎn)移上清液。(e)加入與上清液等體積的酚氯仿異戊醇(ν/ν/ν 25 24 1)混合溶液，混勻后，16000Xg離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清液。(f)加入上一步上清液0. 6倍體積的異丙醇，輕輕混合到DNA沉淀，16000 X g離心 lOmin，棄上清。(g)向沉淀中加70%乙醇進行清洗，6000 Xg離心lOmin，棄上清，待乙醇揮發(fā)干凈后，加入50 μ L雙蒸水進行溶解。在-20°c下保存。根據(jù)真菌ITS序列設計下列引物，并由上海生工生物工程公司合成上游引物5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，下游引物5，-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，利用上述引物對該菌株的ITS序列進行PCR擴增，PCR體系為
PCR擴增反應體系20 μ L
5ddw10.75 mL10 χ PCR Buffer2.0 μ LdNTP mixture2.0 μ LMg2+2.0 μ LTaq聚合酶0.25 μ L引物l(16f)LOML引物 2(16R2)LOMLDNA模板LOmLPCR反應條件為PCR循環(huán)條件95°C預變性5min，循環(huán)參數(shù)95°C變性lmin，52°C 復性45s，72°C延伸1.5min，重復沘個循環(huán)后，72°C再延伸lOmin，最后4°C保溫。用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。選用條帶清晰的產(chǎn)物進行純化。擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳回收，并將回收產(chǎn)物連接到PMD19-T載體上，連接體系 (10 μ L)為Buffer5. O μ L載體pMD19_T l.OyLPCR 產(chǎn)物4. O μ L連接體系于16°C反應30min，在4°C下連接過夜。將連接產(chǎn)物10 μ L加入到大腸桿菌感受態(tài)細胞中進行轉(zhuǎn)化，加LB培養(yǎng)基ImL于 37°C水平搖床中，180rpm搖動45min。取100 μ L菌液，涂布在含Amp的LB平板上，37°C培養(yǎng)16h，即可長出白色菌落。挑取陽性克隆子，在含Amp的LB平板上進行劃線轉(zhuǎn)接，37°C培養(yǎng)16h。取少量待測菌進行菌落PCR。菌落 PCR 體系 20 μ L
ddw10.75 μ L
10 χ PCR Buffer 2.0 μ L dNTP mixture2.0 μ L
Mg2+2.0 μ L
Taq聚合酶0.25 μ L
引物 l(16f)1.0 μ L
引物 2(16R2)1.0 μ L
DNA 模板1.0 μ L用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物；選用條帶清晰的菌適量在加Amp的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；取2mL在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的陽性克隆子菌液，12000 X g，離心lmin，棄上清，利用試劑盒進行質(zhì)粒DNA提取，并進行質(zhì)粒PCR。質(zhì)粒PCR 體系 20 μ L
權(quán)利要求
1.一種海洋青霉菌菌株，其特征在于命名為灰黃青霉(Penicillium griseofulvum) zju87，保藏號為 CGMCC No. 4888。
2.如權(quán)利要求1所述灰黃青霉zju87在抑制金黃色葡萄球菌生長中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海洋青霉菌菌株及其應用，該菌株命名為灰黃青霉(Penicillium griseofulvum)zju87，分離自浙江東海海泥，現(xiàn)保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期為2011年5月19日，保藏號為CGMCC No.4888。本發(fā)明的海洋青霉菌菌株具有很好的抑制真菌的作用，尤其對金黃色葡萄球菌具有強烈的抑菌作用，對黑曲霉，白色假絲酵母，大腸桿菌等也具有很好的抑制效果，對于真菌病的治療具有重要意義。
文檔編號A61P31/04GK102268395SQ20111020633
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者吳綿斌, 姚善涇, 王明璐 申請人:浙江大學