專利名稱：一種微紫青霉菌的篩選方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌的篩選方法及其應(yīng)用，尤其涉及微紫青霉菌 (Penicilliumjanthinellum)的篩選方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
砷是一種在自然界廣泛存在的有毒并且致癌的類金屬元素，砷污染已成為全球危害十分嚴(yán)重的環(huán)境問題之一。據(jù)報(bào)道，全球至少5000多萬人口正面臨著地方性砷中毒的威脅，其中大多數(shù)為亞洲國家。中國是受砷中毒危害最為嚴(yán)重的國家之一，在1956-1984年二十多年間，全國曾發(fā)生過30余起砷中毒事件。我國又是砷礦大國，砷礦廣泛分布在中南和西南部的湖南、云南、廣西、廣東等省區(qū)，砷礦開采或冶煉，含砷農(nóng)藥、化肥等農(nóng)資產(chǎn)品的過量投入等，可成造土壤中砷的累積，進(jìn)而影響著植物、動(dòng)物的生長和發(fā)育，而且還可以通過食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人類的生存和健康構(gòu)成威脅。目前常用的砷污染土壤修復(fù)方法包括土壤改良劑法、溶土法、排土法、化學(xué)沖洗法以及生物修復(fù)技術(shù)。生物修復(fù)技術(shù)是利用生物(主要是植物和微生物)作用來消減、凈化土壤中的砷或改變砷的形態(tài)，被普遍認(rèn)為是砷污染治理中最具應(yīng)用前景的技術(shù)。其中利用超積累植物去除土壤砷的植物修復(fù)技術(shù)在最近的幾年取得了突破性的進(jìn)展，蜈蚣草(Brakefern， Pteris vitta)和大葉井口邊草(Pteris nervosa)等超積累砷的植物相繼被發(fā)現(xiàn)，并用于砷污染地區(qū)的土壤修復(fù)。在重金屬污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)中，除了應(yīng)用超積累植物吸收富集金屬外，利用植物、微生物將重金屬轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)的有機(jī)化合物，使其逸散到大氣中， 從而去除土壤中的重金屬，也逐漸引起了研究者的重視。如Terry等利用微生物和植物的作用，將環(huán)境中的硒(Se)轉(zhuǎn)化為生物毒性較低的氣態(tài)形式(二甲基硒和二甲基二硒)，直接或通過植物的組織使其揮發(fā)到大氣中。Meagher等將細(xì)菌體內(nèi)的汞(Hg)還原酶基因轉(zhuǎn)入芥子科植物Arabidopsis后，得到的轉(zhuǎn)基因植物能耐受、吸收土壤環(huán)境中的Hg，并將Hg2+還原成Hg°后揮發(fā)進(jìn)入大氣。土壤中的砷化合物也可以轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài)的甲基砷等物質(zhì)，在多個(gè)圈層中遷移和轉(zhuǎn)化。因此，利用某些微生物的對(duì)砷的富集、利用和轉(zhuǎn)化、揮發(fā)等功能，將As累積到生物體內(nèi)或?qū)⑵湫纬梢讚]發(fā)態(tài)砷化合物，已成為潛在的土壤砷污染修復(fù)技術(shù)之一。目前國內(nèi)報(bào)道的對(duì)砷具有揮發(fā)能力的真菌還沒有，國外報(bào)道也屈指可數(shù)，且大多還只是局限于理論上和實(shí)驗(yàn)室的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種微紫青霉菌的篩選方法，將微紫青霉菌應(yīng)用于治理砷污染的土壤中以及減少砷在作物及農(nóng)產(chǎn)品中的累積。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種微紫青霉菌的篩選方法，包括采集砷污染土壤樣品，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)從土壤樣品中分離出真菌，在固態(tài)PGP培養(yǎng)基上將分離出的真菌與浸有不同濃度砷的濾紙片作用，觀察真菌在不同濃度砷脅迫下的菌落生長狀況，由此篩選出微紫青霉菌。優(yōu)選地，該方法具體包括將土壤樣品經(jīng)梯度稀釋后涂布于砷含量為400 600mg/L的馬丁培養(yǎng)基上分離出真菌；將分離出的真菌經(jīng)反復(fù)純化、培養(yǎng)后，取直徑為8 IOmm的圓形真菌菌塊或邊長為8 IOmm的方形真菌菌塊放于所述PGP培養(yǎng)基上，在距該菌塊為1 3cm處分別放置浸有不同濃度砷溶液的直徑為2 4mm的圓形濾紙片，砷濃度的范圍設(shè)置為1000 IOOOOmg/ L ；將所述PGP培養(yǎng)基于M ^TC下培養(yǎng)5天后，通過觀察菌株的生長情況篩選出微紫青霉菌。優(yōu)選地，馬丁培養(yǎng)基的成分包括葡萄糖、蛋白胨、KH2P04、MgSO4 · 7H20、瓊脂以及水，各成分的重量比為24 8 2 1 60 4000 ；PGP培養(yǎng)基的成分包括馬鈴薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比為 60 8 1 400。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種微紫青霉菌對(duì)砷的抗性的鑒定方法， 包括在室內(nèi)培養(yǎng)條件下測定微紫青霉菌對(duì)砷的生物累積與揮發(fā)能力，以及在含有不同濃度砷的溶液的培養(yǎng)條件下微紫青霉菌生物量的變化，由此鑒定微紫青霉菌對(duì)砷的抗性。優(yōu)選地，在室內(nèi)培養(yǎng)條件下測定微紫青霉菌對(duì)砷的生物累積與揮發(fā)能力，具體包括配制總砷含量為50mg/L的PGP培養(yǎng)基，在120 125°C下滅菌14 17分鐘后，接入0. Iml微紫青霉菌生物量為104Cfu/ml的菌懸液，培養(yǎng)溫度為M 27°C，轉(zhuǎn)速為138 142rpm,培養(yǎng)5天后，以3800 4200rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心處理8 12分鐘，用超純水反復(fù)清洗菌質(zhì)4次，洗掉殘留的培養(yǎng)基，將該菌質(zhì)于48 52°C下烘干至恒重，然后對(duì)所述菌質(zhì)稱重，用11 13ml體積比為4 6 1的HN03、HClO4混合液在158 162°C條件下將該菌質(zhì)消煮10小時(shí)，采用原子熒光測定該菌質(zhì)中的總砷含量；將離心出的培養(yǎng)液及清洗該菌質(zhì)的超純水混合后作為上清液采用原子熒光測定總砷含量；菌質(zhì)中的總砷含量作為微紫青霉菌對(duì)砷的生物累積量，微紫青霉菌對(duì)砷的揮發(fā)量 =配置的總砷含量-菌質(zhì)中的總砷含量-上清液中的總砷含量。優(yōu)選地，參照在總砷含量為50mg/L的PGP培養(yǎng)基中接入微紫青霉菌的處理，分別以在所述總砷含量為50mg/L的PGP培養(yǎng)基中不接入微紫青霉菌處理以及在PGP培養(yǎng)基中接入微紫青霉菌而不配置砷含量的處理作為對(duì)照，對(duì)每項(xiàng)處理均重復(fù)多次。優(yōu)選地，在室內(nèi)條件下測定在含有不同濃度砷的溶液的培養(yǎng)條件下微紫青霉菌生物量的變化，具體包括配制總砷含量范圍為0 200mg/L的PGP培養(yǎng)基，在120 122°C溫度下滅菌14 16分鐘后，將生長速率相同的8 IOmm微紫青霉菌菌塊分別加入以上處理中，于搖床上溫度為23 27°C，轉(zhuǎn)速為138 142rpm振蕩培養(yǎng)；培養(yǎng)5天后，培養(yǎng)液以3800 4200rpm離心8 12分鐘，并采用稀釋梯度法計(jì)數(shù)菌懸液中的孢子數(shù)目，即表達(dá)微紫青霉菌生物量；用超純水反復(fù)清洗菌質(zhì)4次，洗掉殘留的培養(yǎng)基后，將該菌質(zhì)于48 52°C下烘干至恒重，然后稱量該菌質(zhì)重量，即微紫青霉菌生物量重量。優(yōu)選地，不同的總砷含量的相應(yīng)的處理均重復(fù)多次。優(yōu)選地，該方法還包括觀察隨著培養(yǎng)溶液中總砷含量的增加微紫青霉菌的生物量的變化趨勢(shì)，并觀察微紫青霉菌的生物量最高的總砷含量，由此確定所述微紫青霉菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的對(duì)砷生物累積與揮發(fā)的總砷含量范圍。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種微紫青霉菌在砷污染土壤治理以及降低砷在作物及農(nóng)產(chǎn)品中累積方面的應(yīng)用。通過本發(fā)明對(duì)微紫青霉菌的篩選，可以制成相應(yīng)的微生物修復(fù)制劑，將制得的微生物修復(fù)制劑應(yīng)用在污染土壤或環(huán)境中后，通過該微紫青霉菌對(duì)砷的富集和揮發(fā)作用，在一定程度上降低土壤中砷的含量，特別是降低土壤中有效砷的含量，從而保證作物正常生長，并使作物及農(nóng)產(chǎn)品中砷的含量達(dá)到無公害農(nóng)產(chǎn)品要求。


圖1為用本發(fā)明的方法篩選和培養(yǎng)出的微紫青霉菌在浸有不同濃度砷的濾紙片作用下的菌落生長情況；圖2為微紫青霉菌在不同砷濃度水平下的生長曲線圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供的微紫青霉菌的篩選和培養(yǎng)方法，包括從砷污染的土壤中分離真菌， 觀察分離出的真菌在不同濃度砷脅迫下菌落的生長狀況，由此篩選出微紫青霉菌；在室內(nèi)培養(yǎng)條件下觀察分離出的微紫青霉菌對(duì)砷的累積和揮發(fā)能力。對(duì)培養(yǎng)、篩選出的微紫青霉菌接種于不同濃度砷脅迫下的固態(tài)PGP平板中，觀察微紫青霉菌在不同濃度砷脅迫下的菌落生長狀況。與其它真菌相比，微紫青霉菌在砷含量為10000mg/L的條件下仍然具有很好的生長狀況，表明該真菌對(duì)砷具有良好的耐性。隨后進(jìn)行的微紫青霉菌對(duì)砷的揮發(fā)量測定實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)對(duì)該微紫青霉菌培養(yǎng)時(shí)間為5天，且在培養(yǎng)基中加入的砷濃度為50mg/L時(shí)，該微紫青霉菌對(duì)砷的生物揮發(fā)量達(dá)到142. 195 μ g。 實(shí)驗(yàn)說明該微紫青霉菌對(duì)砷具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化與揮發(fā)能力，即能將砷酸鹽轉(zhuǎn)化為氣態(tài)的砷化物，能夠應(yīng)用于砷污染土壤的生物修復(fù)過程中，從而減少砷在作物及農(nóng)產(chǎn)品中的累積。以下結(jié)合附圖和優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)地闡述。以下實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的限制。以下所有實(shí)施例中，砷均以Na3AsO4 · 12H20的形式加入培養(yǎng)基中。實(shí)施例1微紫青霉菌的分離、篩選和培養(yǎng)從砷污染區(qū)采集污染土壤樣品，用塑料袋裝好并運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，在含砷的固態(tài)PGP 培養(yǎng)基(土豆-葡萄糖-蛋白胨培養(yǎng)基)上從該土壤樣品中分離出真菌，由此篩選出微紫
青霉菌。具體包括步驟上述砷污染土壤樣品來自湖南石門地區(qū)雄黃礦附近的礦渣堆積處，將該土壤樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，經(jīng)梯度稀釋并涂布于砷含量為400 600mg/L的馬丁培養(yǎng)基上分離出真菌， 該馬丁培養(yǎng)基的成分包括葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4, MgSO4 · 7H20、瓊脂以及水，其重量比為 24 8 2 1 60 4000。實(shí)施例2不同濃度砷脅迫下微紫青霉的菌落生長狀況將分離出的真菌經(jīng)反復(fù)純化、培養(yǎng)后，取直徑為8 IOmm的圓形菌塊或邊長為 8 IOmm的方形菌塊置于PGP培養(yǎng)基上，在距該菌塊為1 3cm處分別放置浸有不同濃度砷溶液的直徑為2 4mm的圓形濾紙片，砷濃度分別設(shè)置為1000、3000、5000、10000mg/L。 將PGP培養(yǎng)基于M ^TC下培養(yǎng)5天后，觀察菌株的生長情況。PGP培養(yǎng)基成分包括馬鈴薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比為重量比為60 :8:1: 400。將微紫青霉菌與分離的其它真菌相比較，在砷含量為10000mg/L的條件下仍然具有很好的生長狀況。如圖1所示，在圖1中A為分離出的微紫青霉菌，其菌絲將浸有濃度為 10000mg/L砷的濾紙片完全覆蓋；B、C、D分別為編號(hào)為SM_5F7、SM_5F9、SM_5F1的對(duì)照真菌在浸有不同濃度砷的濾紙片作用下的菌落生長狀況。實(shí)施例3微紫青霉菌對(duì)砷的揮發(fā)功能的測定實(shí)驗(yàn)配制總砷含量為50mg/L的PGP培養(yǎng)基，在120 125°C下滅菌14 17分鐘后， 接入0. Iml微紫青霉菌含量為104Cfu/ml的菌懸液，培養(yǎng)溫度為M 27°C、轉(zhuǎn)速為138 142rpm條件下培養(yǎng)5天后，以3800 4200rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心處理8 12分鐘，用超純水反復(fù)清洗菌質(zhì)4次，洗掉殘留的培養(yǎng)基，將該菌質(zhì)于48 52°C下烘干至恒重，然后對(duì)該菌質(zhì)稱重，用11 13ml體積比為4 6 1的HN03、HClO4混合液在158 162°C條件下將該菌質(zhì)消煮10小時(shí)，采用原子熒光測定該菌質(zhì)中的總砷含量；將離心出的培養(yǎng)液及清洗該菌質(zhì)的超純水混合后作為上清液也采用原子熒光測定其內(nèi)總砷含量。以菌質(zhì)中的總砷含量作為微紫青霉菌對(duì)砷的生物累積量，用下述公式計(jì)算微紫青霉菌對(duì)砷的揮發(fā)量微紫青霉菌對(duì)砷的揮發(fā)量=配置的總砷含量-菌質(zhì)中的總砷含量-上清液中總砷含量。本實(shí)驗(yàn)以加入50mg/L砷不加微紫青霉菌，加微紫青霉菌不加砷的處理，對(duì)照上述加入50mg/L砷且加微紫青霉菌的處理，各處理均重復(fù)3次。該微紫青霉菌表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗砷性能，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為5天時(shí)，其對(duì)砷的生物揮發(fā)量為142. 195 μ g，如表1所示。表1微紫青霉菌對(duì)砷的生物揮發(fā)量(平均值士S. D)
權(quán)利要求
1.一種微紫青霉菌的篩選方法，包括采集砷污染土壤樣品，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)從所述土壤樣品中分離出真菌，在固態(tài)PGP培養(yǎng)基上將分離出的真菌與浸有不同濃度砷的濾紙片作用，觀察真菌在不同濃度砷脅迫下的菌落生長狀況，由此篩選出微紫青霉菌。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，具體包括將所述土壤樣品經(jīng)梯度稀釋后涂布于砷含量為400 600mg/L的馬丁培養(yǎng)基上分離出真菌；將分離出的真菌經(jīng)反復(fù)純化、培養(yǎng)后，取直徑為8 IOmm的圓形真菌菌塊或邊長為 8 IOmm的方形真菌菌塊放于所述PGP培養(yǎng)基上，在距所述菌塊為1 3cm處分別放置浸有不同濃度砷溶液的直徑為2 4mm的圓形濾紙片，所述砷濃度的范圍設(shè)置為1000 10000mg/L ；將所述PGP培養(yǎng)基于M 下培養(yǎng)5天后，通過觀察菌株的生長情況篩選出所述微紫青霉菌。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述馬丁培養(yǎng)基的成分包括葡萄糖、蛋白胨、KH2P04、MgS04 · 7H20、瓊脂以及水，各成分的重量比為24 8 2 1 60 4000 ；所述PGP培養(yǎng)基的成分包括馬鈴薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比為 60 8 1 400。
4.一種微紫青霉菌對(duì)砷的抗性的鑒定方法，包括在室內(nèi)培養(yǎng)條件下測定微紫青霉菌對(duì)砷的生物累積與揮發(fā)能力，以及在含有不同濃度砷的溶液的培養(yǎng)條件下微紫青霉菌生物量的變化，由此鑒定所述微紫青霉菌對(duì)砷的抗性。
5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述在室內(nèi)培養(yǎng)條件下測定微紫青霉菌對(duì)砷的生物累積與揮發(fā)能力，具體包括配制總砷含量為50mg/L的PGP培養(yǎng)基，在120 125 °C下滅菌14 17分鐘后，接入0. Iml微紫青霉菌生物量為104Cfu/ml的菌懸液，培養(yǎng)溫度為M 27°C，轉(zhuǎn)速為138 142rpm,培養(yǎng)5天后，以3800 4200rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心處理8 12分鐘，用超純水反復(fù)清洗菌質(zhì)4次，洗掉殘留的培養(yǎng)基，將所述菌質(zhì)于48 52°C下烘干至恒重，然后對(duì)所述菌質(zhì)稱重，用11 13ml體積比為4 6 1的HN03、HClO4混合液在158 162°C條件下將所述菌質(zhì)消煮10小時(shí)，采用原子熒光測定所述菌質(zhì)中的總砷含量；將離心出的培養(yǎng)液及清洗所述菌質(zhì)的超純水混合后作為上清液采用所述原子熒光測定總砷含量；以所述菌質(zhì)中的總砷含量作為微紫青霉菌對(duì)砷的生物累積量，用下述公式計(jì)算微紫青霉菌對(duì)砷的揮發(fā)量微紫青霉菌對(duì)砷的揮發(fā)量=配置的總砷含量-所述菌質(zhì)中的總砷含量-所述上清液中的總砷含量。
6.按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，參照在所述總砷含量為50mg/L的PGP培養(yǎng)基中接入微紫青霉菌的處理，分別以在所述總砷含量為50mg/L的PGP培養(yǎng)基中不接入微紫青霉菌處理以及在PGP培養(yǎng)基中接入微紫青霉菌而不配置砷含量的處理作為對(duì)照，對(duì)每項(xiàng)處理均重復(fù)多次。
7.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在室內(nèi)條件下測定在含有不同濃度砷的溶液的培養(yǎng)條件下微紫青霉菌生物量的變化，具體包括配制總砷含量范圍為0 200mg/L的PGP培養(yǎng)基，在120 122°C溫度下滅菌14 16 分鐘后，將生長速率相同的8 IOmm微紫青霉菌菌塊分別加入以上處理中，于搖床上溫度為23 27°C，轉(zhuǎn)速為138 142rpm振蕩培養(yǎng)；培養(yǎng)5天后，培養(yǎng)液以3800 4200rpm離心8 12分鐘，并采用稀釋梯度法計(jì)數(shù)菌懸液中的孢子數(shù)目，即表達(dá)所述微紫青霉菌生物量；用超純水反復(fù)清洗菌質(zhì)4次，洗掉殘留的培養(yǎng)基后，將所述菌質(zhì)于48 52°C下烘干至恒重，然后稱量所述菌質(zhì)重量，即所述微紫青霉菌生物量重量。
8.按照權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于， 不同的總砷含量的相應(yīng)的處理均重復(fù)多次。
9.按照權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，還包括觀察隨著培養(yǎng)溶液中總砷含量的增加所述微紫青霉菌的生物量的變化趨勢(shì)，并觀察所述微紫青霉菌的生物量最高時(shí)的總砷含量，由此確定所述微紫青霉菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的對(duì)砷生物累積與揮發(fā)的總砷含量范圍。
10.一種微紫青霉菌在砷污染土壤治理以及降低砷在作物及農(nóng)產(chǎn)品中累積方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明披露了一種微紫青霉菌的篩選方法及其應(yīng)用，其中方法包括采集砷污染土壤樣品，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)從土壤樣品中分離出真菌，在固態(tài)PGP培養(yǎng)基上將分離出的真菌與浸有不同濃度砷的濾紙片作用，觀察真菌在不同濃度砷脅迫下的菌落生長狀況，由此篩選出微紫青霉菌。利用本發(fā)明篩選出的微紫青霉菌，可以制成相應(yīng)的微生物制劑，將制得的微生物制劑應(yīng)用在污染土壤或環(huán)境中后，通過該微紫青霉菌富集和揮發(fā)作用，能夠在一定程度上降低土壤中砷的含量，特別是降低土壤有效砷的含量，從而保證作物正常生長，并使作物和農(nóng)產(chǎn)品中砷的含量達(dá)到無公害農(nóng)產(chǎn)品要求。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102191181SQ201010122178
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2010年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月11日
發(fā)明者曾希柏, 李蓮芳, 白玲玉, 蘇世鳴, 蔣細(xì)良 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所