專(zhuān)利名稱(chēng)：：海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種化合物，尤其是涉及一種源于帚狀海洋青霉菌(/>em'"7//MmSp.)產(chǎn)生的海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物及其制備方法與應(yīng)用。海洋青霉菌(尸em'"7""msp.)分離于西太平洋近赤道區(qū)深海沉積物中，當(dāng)采用馬鈴薯(PDA)培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)，其菌株生長(zhǎng)良好，菌絲較長(zhǎng)，呈深綠色，培養(yǎng)基內(nèi)可見(jiàn)黑色素，產(chǎn)綠色孢子。在40倍熒光顯微鏡可見(jiàn)菌絲有橫隔，分生孢子梗亦有橫隔，分生孢子梗經(jīng)過(guò)多次分枝，產(chǎn)生幾輪對(duì)稱(chēng)或不對(duì)稱(chēng)的小梗，形如青霉的帚狀體。采用rDNA基因間隔區(qū)(ITSregions)的測(cè)定方法，利用通用引物ITS4和ITS5對(duì)菌株ZhengRr-l的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序，得到553bp的DNA片段，測(cè)序結(jié)果與genebank中登記的基因序列進(jìn)行比較，找到與之具有最高相似度的是尸e"/c!7/!'謂sp.兩者的基因序列有13個(gè)堿基的差別，相似度為97%，因此菌株ZhengRr-l鑒定為尸em'"7/z'M加sp.。本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)構(gòu)新穎，尚未見(jiàn)報(bào)道的分離自海洋的青霉114ZhengRr-l(尸em'c朋uwsp.114ZhengRr-l)代謝產(chǎn)生的化合物(2E，4E)-1-(2,6墨二羥基一3，5—二甲基苯)一己一2，4一二烯一1一酮(簡(jiǎn)稱(chēng)為海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物)及其制備方法。本發(fā)明的另一目的在于將化合物(2E，4E)-1-(2，6-二羥基一3,5—二甲基苯)一己一2，4—二烯一1一酮用于制備抗腫瘤藥物，作為抗氧化等生物活性的先導(dǎo)化合物。本發(fā)明所述的青霉114ZhengRr-l(尸e"/c做wnsp.114ZhengRr-l)已于2007年9月10曰保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(中國(guó)武漢大學(xué)內(nèi))，保藏號(hào)為CCTCCNO:M207142。本發(fā)明所述的海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物為(2E，4E)-1-(2,6-二羥基—3，5—二甲基苯)—己一2，4—二烯一1—酮，其分子式為C14H1603，結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中，112，3a，5a為碳原子的編號(hào)，海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物為白色粉末狀固體，易溶于甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑中。本發(fā)明所述的海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物的制備方法包括以下步驟1)固體培養(yǎng)及發(fā)酵產(chǎn)物的處理取斜面菌種，接種到裝有PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行固體培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后的固體發(fā)酵產(chǎn)物用浸提液乙酸乙酯甲醇乙酸=80:15:5等體積浸提至少1次，將浸提液過(guò)濾，減壓濃縮至干，得到褐色浸膏；2)化合物分離將上述褐色浸膏以水溶解，等體積乙酸乙酯浸提，反相硅膠柱分離，以甲醇和水洗脫，收集70%甲醇洗脫的組分，濃縮后用SephadexLH-20柱分離，甲醇洗脫，將收集的組分濃縮后以反相硅膠柱分離，收集50%丙酮+50%水的洗脫組分，濃縮后用硅膠分離，用石油醚乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，當(dāng)石油醚乙酸乙酯=100:1時(shí)，得到海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物，即化合物(2E，4E)-1-(2，6-二羥基—3，5—二甲基苯)一己—2,4—二烯一1—酮。檢測(cè)時(shí)，熒光顯暗紅色，碘顯色，硫酸顯黃色，碘化鉍鉀顯墨綠色，用石油醚:乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)2:1展開(kāi)時(shí)Rf值為0.58。在步驟l)中，取斜面菌種，接種到裝有PDA的培養(yǎng)基中進(jìn)行固體培養(yǎng)，固體培養(yǎng)的溫度最好為2528°C,培養(yǎng)時(shí)間最好為1014d。所述的浸提液可為乙酸乙酯甲醇:乙酸=80:15:5，每次浸提的時(shí)間可為1224h，合并浸提液，減壓濃縮可采用真空濃縮，真空濃縮的溫度最好為4045°C。在步驟2)中，等體積乙酸乙酯浸提，反相硅膠柱分離可采用RP-18反相硅膠柱分離，以甲醇與水洗脫，按體積百分比，甲醇占甲醇與水總體積的30%100%，洗脫的每個(gè)梯度為2000mL。將收集的組分濃縮后以RP-18反相硅膠柱分離，以50%丙酮+50%水和70%丙酮+30%水，各400ml洗脫。本發(fā)明所述的海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物是一種新穎的化合物，可在制備抗腫瘤藥物，抗氧化或其它生物活性的先導(dǎo)化合物中應(yīng)用。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例1A.培養(yǎng)基配方斜面培養(yǎng)基配方每升馬鈴薯汁(馬鈴薯去皮切成小塊，取200g放入1L50X海水中，煮30min，過(guò)濾，濾液用100%海水中添加葡萄糖20g，瓊脂2.0g。種子培養(yǎng)基配方每升馬鈴薯汁(制法同上)中添加葡萄糖20g。發(fā)酵培養(yǎng)基配方同種子培養(yǎng)基。B.發(fā)酵工藝斜面培養(yǎng)按上述斜面培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝試管，121'C滅菌30min后制斜面。將保存的青霉114ZhengRr-l(iV"/aW鵬sp.ZhengRr-l)菌種轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上，28i:下培養(yǎng)4d。待菌體長(zhǎng)出后，再挑取菌絲塊接種于全海水PDA培養(yǎng)基斜面，28'C下培養(yǎng)4d。將約0.2cm3活化的真菌瓊脂塊接種到裝有20ml固體培養(yǎng)基的平板上，在28'C培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)14d。C.(2E,4E)-1-(2，6-二羥基—3,5—二甲基苯)—己—2,4—二烯—1—酮的提取發(fā)酵結(jié)束后，將瓊脂塊切成O.lcm3的小塊，用乙酸乙酯甲醇乙酸=80:15:5的溶液體系浸提三次，每次24h，將浸提液用棉花過(guò)濾，真空濃縮得到浸膏。D.(2E,4E)-1-(2,6-二羥基—3,5—二甲基苯)—己一2,4—二烯—1—酮的精制上述褐色浸膏以水溶解，等體積乙酸乙酯浸提,RP-18反相硅膠柱分離，以甲醇和水洗脫，收集70%甲醇洗脫的組分，濃縮后用SephadexLH-20柱分離，甲醇洗脫，收集的組分，濃縮后以RP-18反相柱分離，收集50%丙酮+50%水的洗脫組分，濃縮后用硅膠柱分離，石油醚乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，當(dāng)石油醚乙酸乙酯=100:1時(shí)，得到化合物(2E,4E)-1-(2，6-二羥基—3，5—二苯甲基)—己—2,4—二烯一1—酮。實(shí)施例2采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定(2E,4E)-1-(2，6-二羥基—3，5—二苯甲基)一己—2，4—二烯—1—酮對(duì)過(guò)氧化氫的抑制活性在96孔發(fā)光板中依次加入pH7.4的PBS緩沖液90uL，濃度為0.025、0.25和2.5ug/ml的(2E,4E)-1-(2，6-二羥基_3,5_二苯甲基)_己—2,4_二烯_1_酮樣品各50^L(陽(yáng)性對(duì)照用相應(yīng)濃度的Vc，陰性對(duì)照用相應(yīng)稀釋度的甲醇)，30mmol/L的^022(^1，混勻，25'C放置5min，冰浴3min，加入25pmol/LLuminol40pL，啟動(dòng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，記錄30min內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度的值(CL)，每個(gè)樣品三個(gè)平行。發(fā)光抑制率按下式計(jì)算，并通過(guò)ICso計(jì)算軟件，得出抑制率達(dá)到50%時(shí)對(duì)應(yīng)的(2E，4E)-1-(2，6-二羥基—3,5—二苯甲基)一己—2,4—二烯—1—酮的濃度即ICso為3.4ug/ml，相同條件下Vc的IC5。為0.6ug/ml。陰性對(duì)照組CL-實(shí)驗(yàn)組CL發(fā)光抑制率(％)=-X100%陰性對(duì)照組CL海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物進(jìn)行NMR(核磁)、MS(質(zhì)譜)及生物活性等測(cè)試。根據(jù)NMR數(shù)據(jù)(見(jiàn)表1)和ESI-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)鑒定，確定化合物的結(jié)構(gòu)為(2E，4E)-1-(2,6-二羥基—3,5—二甲基苯)—己—2,4—二烯—1—酮。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>ESI-MS顯示分子離子峰在231.4[M-lT]-由此可以推斷化合物的分子量為232，與NMR解析的結(jié)果一致?？鼓[瘤活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)(1)腫瘤細(xì)胞株人腸癌細(xì)胞、人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞、人宮頸癌Hela細(xì)胞。(2)材料aMTT(噻唑藍(lán))用O.Olmol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解MTT(Thiazoylblue)到終濃度5mg/ml，0.22pm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后于4'C避光保存。bSDS裂解液100g十二烷基磺酸鈉(SDS),lNHC110ml，加熱溶解，蒸餾水定容至lOOOml。c細(xì)胞培養(yǎng)基(全培)一袋10g干粉RMPI1640(GibcoCo.Ltd.)細(xì)胞培養(yǎng)基溶于1L雙蒸水中；加入2gNaHC03攪勻溶解后封口，置于4。C過(guò)夜，以自然沉淀除去雜質(zhì)；次日加入10-15%已滅活(56°C，30min)的小牛血清及1%多抗母液；混勻后用0.22nm孔徑的濾膜過(guò)濾除菌。(3)上述化合物的配置取一定量的上述化合物，用甲醇溶解并調(diào)整濃度為5mg/ml,0.22nm孔徑的濾膜過(guò)濾除菌，4。C保存?zhèn)溆谩?4)腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)a細(xì)胞活化取一干凈燒杯，裝入干凈溫水，水溫調(diào)至3740。C;將凍存管從液氮中取出迅速投入溫水解凍，并將凍存細(xì)胞接入預(yù)裝有細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在37。C、5%C02、100%濕度的條件下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，及時(shí)更換培養(yǎng)液、分瓶。b細(xì)胞計(jì)數(shù)選對(duì)數(shù)生成期細(xì)胞，胰酶消化，移入離心管中，加全培至10ml，取一滴滴入計(jì)數(shù)板一側(cè)凹槽中，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞數(shù)至lxl05/ml。c活性檢測(cè)①96孔板在超凈工作臺(tái)內(nèi)紫外光下照射lh;②在各孔中加入細(xì)胞懸液8(HU,37°C、5%C02、100%濕度的條件下培養(yǎng)24h;③加入20nl用全培梯度稀釋成一系列濃度的A、B、C和D溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48h;④每孔加入MTT溶液10nl，輕輕震搖使顆粒溶解，37。C放置3h;⑤取出培養(yǎng)板，每孔加入10%SDS溶液100L，37°C溶解過(guò)夜；⑥用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處各孔吸光值(參比波長(zhǎng)為655nm)，按下列公式計(jì)算抑制率抑制率=(對(duì)照組OD值_實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值x100。/。⑦以抑制率為縱坐標(biāo)，受試樣品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，求出抑制率為50%時(shí)的濃度即為ICso。d試驗(yàn)結(jié)果化合物對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的IC5o分別是2.6化g/ml。濃度為10ug/ml時(shí)對(duì)人腸癌細(xì)胞的抑制率接近90%.化合物清除過(guò)氧化氫的ICso是3.4pg/ml。權(quán)利要求1.海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物，其特征在于所述的海洋青霉菌為青霉114ZhengRr-1(Penicilliumsp.ZhengRr-1)，已于2007年9月10日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNOM207142；所述的海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物為(2E，4E)-1-(2，6-二羥基-3，5-二甲基苯)-己-2，4-二烯-1-酮，其分子式為C14H16O3。2.如權(quán)利要求1所述的海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物，其特征在于其結(jié)構(gòu)式為其中，112，3a，5a為碳原子的編號(hào)，海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物為白色粉末狀固體，易溶于甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑中。3.如權(quán)利要求1所述的海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)固體培養(yǎng)及發(fā)酵產(chǎn)物的處理取斜面菌種，接種到裝有PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行固體培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后的固體發(fā)酵產(chǎn)物用浸提液浸提至少1次，將浸提液過(guò)濾，減壓濃縮至干，得到褐色浸膏；2)化合物分離將褐色浸膏以水溶解，依次浸提，分離，洗脫，收集70%甲醇洗脫的組分，濃縮后分離，洗脫，將收集的組分濃縮后以反相硅膠柱分離，收集50%丙酮+50%水的洗脫組分，濃縮后用硅膠分離，梯度洗脫，當(dāng)石油醚乙酸乙酯=100:1時(shí)，得到海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物，即化合物(2E，4E)小(2，6-二羥基—3，5—二甲基苯)一己—2，4—二烯—卜酮。4.如權(quán)利要求3所述的海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物的制備方法，其特征在于在步驟1)中，固體培養(yǎng)的溫度為2528"C，培養(yǎng)時(shí)間為1014d。5.如權(quán)利要求3所述的海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物的制備方法，其特征在于在步驟1)中，浸提液為乙酸乙酯甲醇乙酸=80:15:5，每次浸提的時(shí)間為1224h;減壓濃縮采用真空濃縮，真空濃縮的溫度為4045'C。6.如權(quán)利要求3所述的海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物的制備方法，其特征在于在步驟2)中，等體積乙酸乙酯浸提，反相硅膠柱分離采用RP-18反相硅膠柱分離，洗脫以甲醇與水洗脫，按體積百分比，甲醇占甲醇與水總體積的30%100%，洗脫的每個(gè)梯度為2000mL。7.如權(quán)利要求3所述的海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物的制備方法，其特征在于在步驟2)中，將收集的組分濃縮后以RP-18反相硅膠柱分離，以50%丙酮+50%水和70%丙酮+30%水，各400ml洗脫。全文摘要海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物及其制備方法與應(yīng)用，涉及一種化合物。提供一種分離自海洋的海洋青霉菌代謝產(chǎn)生的海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物及其制備方法和用于制備抗腫瘤藥物，作為抗氧化等生物活性的先導(dǎo)化合物。海洋青霉菌抗腫瘤活性化合物的分子式為C₁₄H₁₆O₃。取斜面菌種接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)，固體發(fā)酵產(chǎn)物浸提，過(guò)濾，減壓濃縮至干得褐色浸膏；褐色浸膏以水溶解，浸提，反相硅膠柱分離，洗脫，收集70％甲醇洗脫的組分，濃縮后分離，洗脫，將收集的組分濃縮后以反相硅膠柱分離，收集50％丙酮+50％水的洗脫組分，濃縮后分離，梯度洗脫，當(dāng)石油醚∶乙酸乙酯＝100∶1時(shí)，即得。文檔編號(hào)C12P7/24GK101255103SQ20081007067公開(kāi)日2008年9月3日申請(qǐng)日期2008年2月27日優(yōu)先權(quán)日2008年2月27日發(fā)明者宋思揚(yáng),張連茹,沈月毛,鄭忠輝,閻雪芬,魯春華,黃耀堅(jiān)申請(qǐng)人:廈門(mén)大學(xué)