技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于真菌多糖類(lèi)抗性誘導(dǎo)劑領(lǐng)域，涉及一種真菌多糖類(lèi)抗性誘導(dǎo)劑及其應(yīng)用，特別涉及一種馬勃多糖的獲得，以及其對(duì)煙草幼苗生長(zhǎng)的影響及對(duì)煙草花葉病毒的抑制作用。

背景技術(shù)：
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真菌多糖是一類(lèi)天然高分子化合物，它由醛糖或酮糖通過(guò)糖苷鍵連接在一起的多聚物構(gòu)成，是生命的四大基本物質(zhì)之一，廣泛存在于真菌特別是大型真菌的細(xì)胞壁中，因其具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用而被醫(yī)藥界廣泛關(guān)注。真菌多糖有螺旋狀的三維立體結(jié)構(gòu)，其構(gòu)型近似于dna，是一種β型的多糖。常見(jiàn)的有幾丁聚糖、氨基寡糖素、菇類(lèi)蛋白多糖等，

煙草病毒病是煙葉生產(chǎn)中最重要的病害之一，被稱(chēng)為植物“癌癥”，由于迄今為止尚無(wú)有效的防治措施，其造成的經(jīng)濟(jì)損失已大大超過(guò)了煙草真菌病害和細(xì)菌病害，成為威脅煙草生產(chǎn)的最大的一類(lèi)災(zāi)害。

植物抗病誘導(dǎo)劑因其環(huán)境友好性、系統(tǒng)性、廣譜性等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)被廣泛研究和應(yīng)用，潛力巨大。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道有大量的抗病誘導(dǎo)劑研制并成功應(yīng)用。許多研究表明，許多大型真菌多糖不僅具有抑殺真菌和病毒的作用，而且能夠調(diào)節(jié)作物生長(zhǎng)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性。作為天然化合物，真菌多糖還具有無(wú)毒、易被降解、對(duì)環(huán)境無(wú)污染等特性，使其有可能作為一種新型植物抗病誘導(dǎo)劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮作用。

而馬勃是常用的藥用真菌，其藥用成分包括馬勃多糖、甾體類(lèi)化合物等，在抗腫瘤、抗炎、止血和抑菌等方面有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，但在誘導(dǎo)植物抗病性和促生等方面尚未見(jiàn)相關(guān)研究和報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的諸多不足之處，本發(fā)明首先提供了一種大型真菌，命名為馬勃(calvatiasp.)dbm，并于2016年5月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmccno.12505；利用該真菌獲得的馬勃(calvatiasp.)dbm多糖處理煙草幼苗后，煙草幼苗的鮮重、最大葉面積、葉綠素含量及凈光合速率等與對(duì)照相比均明顯提高。dbm多糖處理煙草葉片后，對(duì)煙草花葉病毒有較好的抑制效果。

本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明首先提供了一種大型真菌馬勃，馬勃樣品由發(fā)明人于2015年8月采自山東泰山，并分離獲得菌種，菌種現(xiàn)保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。

獲得上述真菌后，發(fā)明人對(duì)其進(jìn)行了生物保藏，其保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmccno.12505；

在上述真菌的基礎(chǔ)上，發(fā)明人進(jìn)一步給出了利用其制備馬勃多糖的方法如下：

用5mm打孔器從dbm菌落邊緣打取直徑5mm的菌落圓片，挑取一片接種于pda培養(yǎng)基中央，放置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)7d后，采用相同的方法在菌落邊緣打取直徑5mm的菌落圓片4-5片轉(zhuǎn)接于裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，28℃，220rpm培養(yǎng)7d，5000rpm離心10min收集菌絲體，無(wú)菌水充分洗滌；

其中所述的dbm菌落為保藏編號(hào)為cgmccno.12505的馬勃真菌菌落；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成按重量百分比計(jì)為：

冷榨豆餅粉，1％；酵母粉，0.2％；蔗糖，3％；硫酸鎂，0.05％；磷酸二氫鉀，0.1％；維生素b1，0.01％，余量為無(wú)菌去離子水；

菌絲體于65℃烘箱烘至恒重，干菌絲在研缽中研細(xì)，過(guò)80目篩子制成干粉；菌絲體干粉加40倍體積水80℃水浴浸提2h，重復(fù)兩次，合并兩次提取液，濃縮至原體積的1/15，向濃縮液中緩慢加入3倍體積的95％乙醇，4℃靜置過(guò)夜后8000rpm離心10min留取沉淀，沉淀分別以95％乙醇洗滌一次、丙酮洗滌兩次，真空干燥得到多糖粗提物。

對(duì)粗提物的理化性質(zhì)進(jìn)行初步鑒定發(fā)現(xiàn)，該粗提物為白色粉末，溶于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚和正丁醇。粗提物溶于水后為透明溶液，在較高濃度時(shí)呈粘稠狀。molish反應(yīng)中，在粗提物溶液和濃硫酸的液面交界處形成紫環(huán)，表明粗提物中含有多糖成分。粗提物溶液與fehling試劑反應(yīng)均顯陰性，沒(méi)有磚紅色沉淀產(chǎn)生，表明不含有還原性糖。

通過(guò)用苯酚-硫酸法測(cè)定得知上述獲得的dbm多糖粗提物中的總糖含量為84.9％。

發(fā)明人進(jìn)一步對(duì)上述獲得的多糖粗提物進(jìn)行了功能研究，結(jié)果如下：

將上述多糖粗提物溶解后可獲得不同濃度的多糖溶液，選擇1000mg/l和2000mg/l兩個(gè)濃度的多糖溶液噴霧處理煙苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

處理后的煙苗地上部鮮重、地下部鮮重和最大葉面積與對(duì)照相比均有顯著提高，分別比對(duì)照增加53.6％、233.3％和36.6％，總?cè)~綠素含量和光合速率分別比對(duì)照增加37.5％和97.1％，表明多糖處理明顯促進(jìn)煙苗的生長(zhǎng)。

同時(shí)發(fā)明人利用半葉枯法測(cè)定了上述多糖粗提物對(duì)tmv的鈍化、治療和預(yù)防作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)多糖處理后，煙苗對(duì)tmv預(yù)防效果最好，經(jīng)1000mg/l和2000mg/l兩種濃度處理后枯斑數(shù)分別比對(duì)照減少8.2個(gè)和12.8個(gè)，預(yù)防效果分別為60％和74％；多糖對(duì)tmv的鈍化效果次之，兩種濃度處理后的鈍化效果分別為18.2％和17.7％；煙苗對(duì)tmv的治療效果：兩種濃度處理后其治療效果均低于40％，與其他兩種處理方式相比，相對(duì)較差但依然有一定的效果。差異顯著性分析表明，兩種多糖濃度處理后，對(duì)tmv的抑制效果差異不顯著。

綜上所述，本發(fā)明提供了一種新的馬勃真菌，并對(duì)其進(jìn)行了生物保藏，而利用該真菌獲得的馬勃(calvatiasp.)dbm多糖處理煙草幼苗后，煙草幼苗的鮮重、最大葉面積、葉綠素含量及凈光合速率等與對(duì)照相比均明顯提高。dbm多糖處理煙草葉片后，對(duì)煙草花葉病毒有較好的抑制效果。

發(fā)明人對(duì)本發(fā)明所公開(kāi)的大型真菌，命名為馬勃calvatiasp.，并對(duì)其進(jìn)行了生物保藏，具體保藏信息如下：

保藏信息

保藏時(shí)間：2016年5月27日

保藏單位名稱(chēng)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心cgmcc

保藏編號(hào)：cgmccno.12505

保藏單位地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院中科院微生物研究所

分類(lèi)命名:馬勃calvatiasp.

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中三種不同培養(yǎng)基對(duì)dbm菌絲生長(zhǎng)的影響示意圖；

從圖中可以看出3種液體培養(yǎng)基中以c配比效果最好；

圖2為實(shí)施例3中葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；

從圖中可以看出該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性良好，可以用于計(jì)算粗提物的總糖含量；

圖3為dbm多糖對(duì)煙草幼苗生長(zhǎng)的影響結(jié)果灰度示意圖；

從圖中可以看出經(jīng)兩種濃度的多糖處理后，煙苗葉色濃綠，根系較發(fā)達(dá)，說(shuō)明多糖溶液對(duì)煙草幼苗的生長(zhǎng)具有較好的促進(jìn)效果；

圖4為dbm多糖處理對(duì)tmv的鈍化效果灰度示意圖；

圖5為dbm多糖處理對(duì)tmv的預(yù)防效果灰度示意圖；

圖6為dbm多糖處理對(duì)tmv的治療效果灰度示意圖；

由圖4、圖5及圖6可見(jiàn)，經(jīng)兩種濃度的多糖溶液處理后，枯斑數(shù)明顯比對(duì)照減少，表明多糖處理增強(qiáng)了煙草對(duì)tmv的抗性。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1培養(yǎng)基的篩選

dbm母種接種于pda固體培養(yǎng)基上，放置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)6～7d后挑取一環(huán)于液體培養(yǎng)基中，28℃，220rpm培養(yǎng)，7d后將培養(yǎng)液5000rpm離心10min，回收菌絲體并洗滌。菌絲體于65℃烘箱烘至恒重，稱(chēng)重后比較差異。

三種不同液體培養(yǎng)基配方:

培養(yǎng)基a：冷榨豆餅粉，1％；蛋白胨，0.2％；葡萄糖，3％；硫酸鎂，0.05％；磷酸二氫鉀，0.1％；維生素b1，0.01％；

培養(yǎng)基b：葡萄糖，2％；磷酸二氫鉀，0.3％；硫酸鎂，0.15％；維生素b1，0.1％，馬鈴薯汁，20％；

培養(yǎng)基c：冷榨豆餅粉，1％；酵母粉，0.2％；蔗糖，3％；硫酸鎂，0.05％；磷酸二氫鉀，0.1％；維生素b1，0.01％。

按重量百分比分別稱(chēng)取上述試劑，加入對(duì)應(yīng)量的去離子水?dāng)嚢杈鶆?，?50ml三角瓶分裝100ml后于121℃滅菌25min，制成液體培養(yǎng)基。

上述各原材料均從市場(chǎng)上直接購(gòu)得；

結(jié)果如圖1所示，可見(jiàn)3種液體培養(yǎng)基中以c配比效果最好，培養(yǎng)7d，dbm菌絲體干重為4.0g，比a培養(yǎng)基中的菌絲體干重增加108％，比b培養(yǎng)基中的菌絲體干重增加85.7％。

實(shí)施例2：dbm多糖的提取

用5mm打孔器從dbm菌落邊緣打取直徑5mm的菌落圓片，挑取一片接種于pda培養(yǎng)基中央，放置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)7d后，采用相同的方法在菌落邊緣打取直徑5mm的菌落圓片4-5片轉(zhuǎn)接于裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，28℃，220rpm培養(yǎng)7d，5000rpm離心10min收集菌絲體，無(wú)菌水充分洗滌；

菌絲體于65℃烘箱烘至恒重，干菌絲在研缽中研細(xì)，過(guò)80目篩子制成干粉；菌絲體干粉加40倍體積水80℃水浴浸提2h，重復(fù)兩次，合并兩次提取液，濃縮至原體積的1/15，向濃縮液中緩慢加入3倍體積的95％乙醇，4℃靜置過(guò)夜后8000rpm離心10min留取沉淀，沉淀分別以95％乙醇洗滌一次、丙酮洗滌兩次，真空干燥得到多糖粗提物粉末。

實(shí)施例3：多糖含量測(cè)定

(一)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

準(zhǔn)確稱(chēng)取葡萄糖100mg，用無(wú)菌水制成1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，備用。分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液采用倍比稀釋法配置成0.02，0.04，0.06，0.08，0.1，0.12，0.14mg/ml的葡萄糖溶液。取上述溶液各0.4ml，加入5％重蒸苯酚0.8ml，混勻，迅速加入4ml濃硫酸，沸水浴加熱15min后，冷卻至室溫，于490nm處測(cè)定吸光度。以水代替葡萄糖液為空白對(duì)照。根據(jù)糖濃度及吸光度值繪制回歸方程。

dbm多糖含量的測(cè)定

精密稱(chēng)取實(shí)施例2中獲得的多糖粉末50mg，置于100ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。按照上述方法，測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3次，得到3個(gè)樣品的多糖含量，計(jì)算平均值。

以糖濃度為橫坐標(biāo)(x)，吸光度為縱坐標(biāo)(y)，做出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖2)，可見(jiàn)該曲線(xiàn)基本為一條直線(xiàn)，經(jīng)計(jì)算得回歸方程為y＝3.7821x+0.0116，其中r²＝0.9904，由此可知，葡萄糖在0.02-0.14mg范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性良好，利用該方程計(jì)算出實(shí)施例2中獲得的dbm多糖粗品中的多糖含量為84.9％。

實(shí)施例4：多糖處理多糖對(duì)煙苗生長(zhǎng)及光合作用的影響

(一)多糖對(duì)煙苗生長(zhǎng)及光合作用的影響

將dbm多糖粗品分別配制成濃度為1000mg/l和2000mg/l的多糖溶液(對(duì)應(yīng)圖中dbm1000和dbm2000)，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的4-5葉期的煙草幼苗將上述多糖溶液均勻噴施于煙葉表面，連續(xù)處理3次，每次間隔7d，于最后一次處理7天后，檢測(cè)葉片總?cè)~綠素含量、葉片光合效率、最大葉面積、鮮重等，每處理10株煙苗。以清水同樣處理為對(duì)照。

圖3是經(jīng)多糖處理后7d，煙苗的生長(zhǎng)狀況?？梢?jiàn)，經(jīng)兩種濃度的多糖處理后，煙苗葉色濃綠，根系較發(fā)達(dá)。對(duì)煙草葉片最大葉面積、鮮重、總?cè)~綠素含量等進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)，經(jīng)濃度1000mg/l多糖處理后，煙苗最大葉面積平均為112.9cm²，2000mg/l多糖處理后的葉面積為110.5cm²，分別比對(duì)照增加36.6％和33.7％；地上部和根部鮮重經(jīng)兩個(gè)濃度處理后都比對(duì)照明顯增加，分別增加53.6％、37.5％和233.3％、233.3％；與對(duì)照相比，煙草總?cè)~綠素含量經(jīng)多糖處理后也明顯高于對(duì)照，分別增加37.5％和21.6％(如表1)。差異顯著性分析表明，兩種濃度處理在最大葉面積、鮮重、總?cè)~綠素含量等方面與對(duì)照相比均達(dá)到極顯著水平，但兩個(gè)處理濃度間差異不顯著。

表1多糖處理對(duì)煙草幼苗的促生作用

于處理后7天，利用ciras-3便攜式植物光合作用測(cè)定儀對(duì)不同處理煙苗的光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度及胞間co2濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2。由表2可見(jiàn)，經(jīng)濃度1000mg/l多糖處理后，煙苗光合速率為6.7umol·m^-2·s^-1，2000mg/l多糖處理后的光合速率為5.1umol·m^-2·s^-1，分別比對(duì)照增加97.1％和50％；蒸騰速率及氣孔導(dǎo)度經(jīng)兩個(gè)濃度處理后都比對(duì)照明顯增加，分別增加108.3％、83.3％和189.7％、105.5％；與對(duì)照相比，細(xì)胞間co2濃度經(jīng)多糖處理后明顯低于對(duì)照，分別減少18.7％和19.6％，可見(jiàn)經(jīng)dbm多糖處理后，葉片光合速率和蒸騰速率大大提升。經(jīng)差異顯著性分析，發(fā)現(xiàn)兩種處理與對(duì)照相比，差異均達(dá)到極顯著水平。

表2多糖處理對(duì)煙草光合作用的影響

注：pn為光合速率；e為蒸騰速率；gs為氣孔導(dǎo)度；ci為胞間co2濃度。+表示增加；-表示減少。

實(shí)施例5：dbm多糖對(duì)tmv的抑制活性測(cè)定

三生煙煙苗溫室內(nèi)培養(yǎng)到5-6葉期，采用半葉法從3個(gè)方面分析多糖對(duì)煙草花葉病毒病的抗病效果。

多糖對(duì)tmv的預(yù)防作用：選取長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗，按實(shí)施例4中的濃度配置多糖溶液，分別噴施到待測(cè)葉片的右半葉，左半葉噴清水為對(duì)照，間隔7d再?lài)娨淮危诘诙螄婌F后2d，采用摩擦接種法將20μl病毒汁液均勻涂抹到整個(gè)葉片，每株處理3片葉，每處理重復(fù)3次。

多糖對(duì)tmv的治療作用：采用上述類(lèi)似方法進(jìn)行處理，所不同的是，在煙苗接種tmv后1d，再?lài)姸嗵侨芤?，以左半葉噴清水為對(duì)照。每株處理3片葉，每處理重復(fù)3次。

多糖對(duì)tmv的鈍化作用：首先取上述配制好的多糖溶液與病毒汁液按1:1的體積比例混勻，室溫下靜置30min，將鈍化處理的病毒汁液摩擦接種到三生煙右半葉，左半葉接種用清水處理的病毒汁液為對(duì)照。每株處理3片葉，每處理重復(fù)3次。

經(jīng)上述處理過(guò)的煙苗，于25℃光12h/暗12h培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3d，統(tǒng)計(jì)各處理的枯斑數(shù)，計(jì)算抑制效果。計(jì)算公式如下：

結(jié)果如表3，可見(jiàn)經(jīng)多糖處理后，煙苗對(duì)tmv預(yù)防效果最好(圖5)，1000mg/l和2000mg/l兩種濃度處理后枯斑數(shù)分別比對(duì)照減少8.2個(gè)和12.8個(gè)，預(yù)防效果分別為60％和74％。多糖對(duì)tmv的鈍化效果次之(圖4)，兩種濃度處理后的鈍化效果分別為18.2％和17.7％。3種處理中，煙苗對(duì)tmv的治療效果(圖6)較差，兩種濃度處理后其治療效果均低于40％。差異顯著性分析表明，兩種多糖濃度處理后，對(duì)tmv的抑制效果差異不顯著。

表3多糖處理對(duì)tmv的抑制效果

綜上所述，dbm多糖處理對(duì)煙草幼苗的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用；dbm多糖處理可明顯提高煙苗的光合作用，因此dbm多糖可以作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑使用；dbm多糖處理對(duì)煙草花葉病毒有較好的鈍化、預(yù)防和治療效果；因此這類(lèi)多糖不僅能夠調(diào)節(jié)作物生長(zhǎng)，而且可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性，使其可以作為一種新型植物抗病誘導(dǎo)劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要的作用。

上述雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以?xún)?nèi)。