本發(fā)明涉及一株具有強抗氧化性的草酸青霉菌及其應(yīng)用，主要應(yīng)用于抗氧化劑的研究。

背景技術(shù)：

抗氧化(anti-oxidant)是對抗氧化自由基的簡稱，而且自由基學(xué)說也很好地解釋了抗氧化作用，自由基學(xué)說指出自由基是具有高度的化學(xué)的活性，如果生物體內(nèi)自由基過多，就會導(dǎo)致組織器官和細胞的損傷，從而誘發(fā)各種疾病、加速機體衰老，最終會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

抗氧化劑可以阻止人體自由基從細胞或者其他組織奪取氧原子，可以防止自由基對正常的細胞組織的破壞，它具有抑制炎癥的發(fā)生、促進生長、抗衰老、減少癌癥和心血管疾病等風(fēng)險的作用。有研究證明，人體的抗氧化系統(tǒng)是一個可以與免疫系統(tǒng)相比的、具有完善和復(fù)雜功能的系統(tǒng)，機體的抗氧化的能力越強，就會越健康，生命也就會越長。而且抗氧化劑還可以應(yīng)用于很多領(lǐng)域，比如食品保鮮，化妝品行業(yè)等，特別是生物抗氧化劑副作用少，污染小。

多酚類物質(zhì)的生物學(xué)活性具有廣譜性。近年來的研究表明，多酚類物質(zhì)具有很明顯的調(diào)節(jié)糖脂代謝、抗菌、抗氧化、抗癌、抗病毒、治療口腔潰瘍與牙周疾病、抑制心血管疾病等活性，這一切的根源可能是因為它是一類良好的天然的抗氧化劑。多酚類化合物中含有的酚性羥基是良好的中子或氫的給與體，這對生物組織膜由于發(fā)生氧化作用而生成的會引起結(jié)構(gòu)、功能損傷的羥自由基(·oh)、過氧自由基(·ooh)等自由基具有良好的清除作用，因此能夠阻止人體自由基從細胞或者其他組織中奪取氧原子，同時也防止自由基對正常細胞、組織造成傷害，從而抑制了炎癥的發(fā)生、促進生長發(fā)育、延緩衰老、減少心血管疾病的發(fā)生和降低癌癥的風(fēng)險。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15菌株，該草酸青霉菌具有很強的抗氧化作用，而且其發(fā)酵液酚酸含量也比較高，可用于制備抗氧化劑，為開發(fā)新的抗氧化劑提供了新選擇。

所述草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15是從疏花水柏枝(myricarialaxiflora)的葉中獲得的內(nèi)生真菌，于2017年1月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為，cctccm：2017025。保藏地址為中國，武漢，武漢大學(xué)。

本發(fā)明草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上具有以下微生物學(xué)特性：剛開始有白色菌絲，逐漸的白色菌絲產(chǎn)綠色孢子，最后基本都是綠色的孢子，看不到菌絲，孢子表面較干燥。

本發(fā)明目的是提供一種用于抗氧化劑的研究，其活性成分為草酸青霉菌sy-15?？寡趸囼灡砻鳎琩pph自由基清除率為86.48％，總抗氧化為11.64單位/ml，發(fā)酵液中多酚類物質(zhì)的含量為10.75mg/ml。因而，本發(fā)明還包括含有所述菌株或者其發(fā)酵液的生物農(nóng)藥，以及含有所述菌株的微生物菌劑。

本發(fā)明以草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15菌株為模板，使用通用上游引物its1：5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′和通用下游引物its4：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′進行pcr擴增獲得750bp的18srdna部分序列。通過blast與genbank收錄的序列進行比對，發(fā)現(xiàn)sy-15與草酸青霉菌的同源性為99％。用mega4.1進化樹(圖4)，鑒定菌株(sy-15)與一株草酸青霉菌(penicilliumoxalicumkf768466)的同源性達99％。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15的菌落形態(tài)，左圖為正面、右圖為背面。

圖2為本發(fā)明的草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15的顯微形態(tài)。

圖3為本發(fā)明中不同濃度h2o2下大腸桿菌細胞的存活率。

圖4為四種提取物對大腸桿菌的氧化損傷保護作用。

圖5為沒食子酸標準曲線。

圖6為本發(fā)明的草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15菌株的18srdna系統(tǒng)發(fā)育樹。

具體實施方式

實施例一：草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15的分離和保存

2012年在三峽流域湖北宜昌境內(nèi)胭脂壩采集疏花水柏枝葉片，消毒后直接進行分離純化即可獲得；

分離純化：將處理好的樣品接種到pda(新鮮土豆200g/l，蔗糖20g/l，瓊脂20g/l，其余為水，ph7.2-7.5，121℃滅菌20min)固體培養(yǎng)基(加濃度為25μg/ml的青霉素抑制細菌和放線菌生長)上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)樣品周圍明顯長出菌絲時，采用尖端菌絲挑取法，挑取形態(tài)不同的菌株，轉(zhuǎn)入到pda固體培養(yǎng)基中，連續(xù)接代3-5次，得到純化菌株。

培養(yǎng)：取純化好的菌株，接種到pda固體平板培養(yǎng)基上，恒溫箱內(nèi)28℃培養(yǎng)，7天即可長滿平板。

采用石蠟保藏法，在滅菌的試管中倒入pda固體培養(yǎng)基制成斜面，接種菌落單一的sy-15，恒溫箱內(nèi)28℃培養(yǎng)，待斜面長滿后，加入滅菌的石蠟使之淹沒斜面的高度即可，于4℃冰箱保存。

將該菌株草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)進行保藏，保藏名稱為sy-15；保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址為中國，武漢，武漢大學(xué)；保藏日期：2017.1.11；保藏編號為，cctccm：2017025。

實施例二：草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15鑒定

18srdna序列分析：采用通用引物進行pcr擴增18srdna序列。上游引物its1：5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′和通用下游引物its4：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′。反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，55-58℃退火30s，72℃延伸1.5min，33個循環(huán)，最后72℃延伸10min。pcr產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑取750bp左右的條帶進行凝膠回收，送上海生工測序。

將測得的序列提交至genbank，并獲得登錄號kx822145。將此序列在genbank中進行blast比對，并選取同源性較高的菌株的序列用mega4.1軟件構(gòu)建18srdna系統(tǒng)發(fā)育樹。

實施例三：草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15菌株的制備

菌種活化：取保存4℃冰箱的草酸青霉菌sy-15，挑起少許菌株接種于pda固體平板培養(yǎng)基中，28℃下，培養(yǎng)約7天。

實施例四：草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15菌株的抗氧化作用研究

1、體外抗氧化活性分析

sy-15菌株于150mlpda培養(yǎng)基中，37℃，100r/min的搖床培養(yǎng)1周后，通過真空抽濾裝置過濾菌懸液，棄去菌體，把發(fā)酵液上清液用等體積的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，將萃取液于40℃條件下減壓濃縮獲得濃縮液，之后將濃縮液冷凍干燥獲得粗提取物。將該菌的發(fā)酵液粗提取物配成10mg/ml的溶液，分別用dpph(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除法、t-aoc試劑盒和鐵氰化鉀(potassiumferricyanide，pf)還原力測定法測定其抗氧化能力，重復(fù)3次，以相同濃度的維生素c作為正對照。

2、大腸桿菌抗氧化保護分析(體內(nèi)抗氧化活性分析)

將處于對數(shù)生長期的大腸桿菌接種于lb液體培養(yǎng)基，37℃、100r/min的搖床中培養(yǎng)12h后，加入不同濃度(200、400、600、800、1000μmol)的h2o2溶液，同時設(shè)空白對照組(只加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，不加入h2o2溶液)，再繼續(xù)培養(yǎng)12h，用平板稀釋計數(shù)法測大腸桿菌的活菌數(shù)。平板稀釋計數(shù)法：取1ml大腸桿菌菌液稀釋到10^-6，之后取0.5ml進行平板涂布，培養(yǎng)12h之后進行計數(shù)。選取導(dǎo)致50％-60％大腸桿菌細胞死亡的h2o2濃度來建立氧化應(yīng)激損傷模型。

在氧化損傷保護實驗中，將培養(yǎng)12h的大腸桿菌加入濃度為10mg/ml的sy-15發(fā)酵液粗提物3ml，培養(yǎng)24小時之后，加入濃度為200μmol的h2o2溶液，繼續(xù)培養(yǎng)12h后，平板菌落計數(shù)法測大腸桿菌的活菌數(shù)并計算存活率，重復(fù)3次。

3、多酚類物質(zhì)的測定

采用folin-ciocalteu法測定樣品中總多酚的含量，以沒食子酸為標準溶液制作標準曲線。其原理在于：folin-ciocalteu試劑中含有鎢鉬酸，該物質(zhì)能使多酚類化合物被氧化，而自身分子中的w6+被還原為w5+，生成藍顏色的化合物，顏色的深淺與樣品中的多酚含量呈正相關(guān)關(guān)系。

(1)沒食子酸標準曲線制作

精密稱取10mg的沒食子酸標準品，用80％乙醇溶解并定容至100ml，配成終濃度為100μg/ml的沒食子酸標準溶液。準確的吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml沒食子酸標準溶液，分別定容于10ml容量瓶內(nèi)，配成不同濃度的標準溶液。然后從不同濃度沒食子酸溶液中吸取1ml到25ml比色管中，加入1.5mlfolin-ciocalteu試劑，8min后加入4.5ml10％na2co3溶液，用蒸餾水定容至25ml，在25℃下反應(yīng)2h，蒸餾水作為空白對照，在765nm波長下測定吸光值。

(2)粗提物多酚含量測定

取1ml的發(fā)酵液粗提物稀釋液，加入1.5mlfolin-ciocalteu試劑，8min后加入4.5ml10％na2co3溶液，用水定容至25ml，25℃水浴2h，765nm處測定吸光度值。利用沒食子酸標準曲線計算得到粗提物中總多酚的含量。

結(jié)果

1、體外抗氧化活性分析

2、大腸桿菌抗氧化保護分析

(1)h2o2致大腸桿菌細胞損傷的保護模型的建立

向大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同濃度的h2o2，培養(yǎng)12h之后分別用平板稀釋法來統(tǒng)計大腸桿菌數(shù)并計算存活率。結(jié)果表明，平板菌落計數(shù)法結(jié)果在200μmol的h2o2存在時，細胞致死率分別達到63.77％(如圖3)。所以選擇200μmol的h2o2建立大腸桿菌細胞氧化損傷的保護模型。

(2)粗提物對大腸桿菌氧化損傷保護作用

為進一步明確sy-15菌株在體內(nèi)的抗氧化活性，將sy-15菌株的發(fā)酵液經(jīng)過萃取、減壓濃縮、冷凍干燥后，配制成10mg/ml的溶液，在200μmol的h2o2存在下分別驗證其對大腸桿菌的氧化損傷保護作用。結(jié)果表明sy-15菌株對大腸桿菌的抗氧化損傷保護效果是vc的59.39％，其粗提物處理過的大腸桿菌存活率不僅高于處理組，還高于空白對照組(不加h2o2時的細胞存活數(shù))，表現(xiàn)出一定的促進細胞增殖的作用(vc也有同樣的效果)。

3、多酚類物質(zhì)的測定

根據(jù)實驗數(shù)據(jù)繪制標準曲線，縱坐標為吸光度值，橫坐標為標準溶液的濃度。標準曲線如圖所示，其線性關(guān)系為：y＝0.0158x+0.0131，相關(guān)系數(shù)達0.9961，呈顯著正相關(guān)。利用沒食子酸標準曲線計算得到sy-15菌株粗提物中總多酚的含量為：10.75mg/ml。

sequencelisting

<110>申請人三峽大學(xué)

<120>一株具有強抗氧化性的草酸青霉菌sy-15及其應(yīng)用

<210>sy-15

<211>544

<212>dna

seqidno：1

aggagggtccacctcccacccgtgtttatcgtaccttgttgcttcggcgg

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