一套適合評(píng)價(jià)土壤中農(nóng)藥殘留毒性變化的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一套評(píng)價(jià)土壤中農(nóng)藥殘留毒性變化的方法，是根據(jù)土壤中殘留農(nóng)藥的性質(zhì)不同而分別有機(jī)溶劑提取方法、去離子水提取方法和泥漿直接暴露染毒法，再利用蚯蚓彗星實(shí)驗(yàn)和蠶豆微核實(shí)驗(yàn)，雙重指標(biāo)檢測(cè)土壤生態(tài)毒性，建立了一套適合土壤中農(nóng)藥殘留毒性的提取方法，為農(nóng)藥殘留毒性對(duì)環(huán)境及人體健康的影響評(píng)價(jià)提供技術(shù)保障。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單易行，可重復(fù)操作性強(qiáng)，適用性廣，對(duì)不同極性性質(zhì)的農(nóng)藥都可應(yīng)用。便于后續(xù)的生態(tài)毒性測(cè)定，具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一套適合評(píng)價(jià)土壤中農(nóng)藥殘留毒性變化的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一套評(píng)價(jià)土壤中農(nóng)藥殘留毒性變化的方法。
技術(shù)背景
[0002]農(nóng)藥在保證和促進(jìn)農(nóng)林牧業(yè)發(fā)展，滿足人們對(duì)農(nóng)副產(chǎn)品的需要等方面所發(fā)揮的顯著作用是眾所周知的，但農(nóng)藥污染的嚴(yán)重現(xiàn)狀也越來越受到人們的重視。近年來，由于農(nóng)藥大量的、不合理的施用，造成了農(nóng)田土壤的污染。這不僅破壞了土壤中生物多樣性，對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重危害，還會(huì)通過飲用水或通過土壤植物系統(tǒng)經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體，危害人體健康。
[0003]農(nóng)藥殘留的污染物濃度低、范圍廣。目前，對(duì)于土壤中農(nóng)藥殘留毒性變化的分析測(cè)定，國內(nèi)外幾乎沒有學(xué)者研究?，F(xiàn)有的研究中，主要分為兩方面:一是最大限量的提取出土壤中的農(nóng)藥母體用于GC、HPLC分析其在土壤中存在的量；二是通過定性分析某種農(nóng)藥的降解產(chǎn)物，以降解產(chǎn)物的毒性大小理論上判斷該種農(nóng)藥在環(huán)境中的毒性變化。隨著人們對(duì)環(huán)境安全意識(shí)的提高，現(xiàn)有的這些研究內(nèi)容以不足已直觀確切的測(cè)定農(nóng)藥在土壤中的殘留毒性。這是因?yàn)?(I)農(nóng)藥在土壤中的狀態(tài)是一個(gè)降解轉(zhuǎn)化的動(dòng)態(tài)過程，伴隨著其降解中間產(chǎn)物的產(chǎn)生，必然會(huì)導(dǎo)致對(duì)環(huán)境造成不同的影響；(2) —種農(nóng)藥往往產(chǎn)生多種降解產(chǎn)物，而降解產(chǎn)物的極性性質(zhì)不一定與農(nóng)藥母體相同，比如，硫丹是脂溶性農(nóng)藥，但它其中一種降解產(chǎn)物硫丹硫酸鹽是水溶性有機(jī)物，若只從農(nóng)藥母體性質(zhì)出發(fā)，勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致測(cè)定其殘留毒性時(shí)不夠全面；(3)通過實(shí)驗(yàn)儀器測(cè)定某種農(nóng)藥的降解產(chǎn)物時(shí)，檢測(cè)到的是它的主要降解產(chǎn)物，一些極少量的降解產(chǎn)物不能被提取或檢測(cè)出來，以往的以幾種降解產(chǎn)物的毒性大小來判斷農(nóng)藥降解后的毒性變化是不準(zhǔn)確的。因此，需要對(duì)土壤進(jìn)行后效觀察，通過靈敏和有效的診斷方法對(duì)污染土壤的殘留毒性和修復(fù)效果進(jìn)行評(píng)定以給出直接和明確的答復(fù)。
[0004]隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn)，用于評(píng)價(jià)微生物修復(fù)污染土壤的生物檢測(cè)方法更為多樣化和精確化。人們?cè)诰C合考慮不同的目的、檢測(cè)物和實(shí)際條件后，通常采用不同的評(píng)價(jià)方法。目前，污染物的基因毒性和生態(tài)毒性檢測(cè)評(píng)價(jià)方法主要有=Ames試驗(yàn)，基因突變?cè)囼?yàn)，染色體試驗(yàn)(包括微核、染色體畸變及SCEs等)，DNA損傷試驗(yàn)；動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等。本發(fā)明利用彗星實(shí)驗(yàn)和微核實(shí)驗(yàn)這兩個(gè)公認(rèn)地生態(tài)毒性檢測(cè)方法來作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)價(jià)提取出的土壤中有機(jī)污染物的殘留毒性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明選取不同極性性質(zhì)的農(nóng)藥硫丹、啶蟲脒、莠去津、吡蟲啉及其降解產(chǎn)物為代表，對(duì)比他們?cè)谕寥乐袣埩舳拘缘奶崛》椒ǎ则球惧缧菍?shí)驗(yàn)和蠶豆微核實(shí)驗(yàn)為指標(biāo)，建立了一套評(píng)價(jià)土壤中農(nóng)藥殘留毒性的評(píng)價(jià)方法，為農(nóng)藥殘留毒性對(duì)環(huán)境及人體健康的影響評(píng)價(jià)提供技術(shù)保障。
[0006]一套評(píng)價(jià)土壤中農(nóng)藥殘留毒性變化的方法，是根據(jù)土壤中殘留農(nóng)藥的性質(zhì)不同而采取不同的提取步驟:
[0007]1.當(dāng)土壤中殘留農(nóng)藥及其降解產(chǎn)物以脂溶性農(nóng)藥占主導(dǎo)時(shí)，采取有機(jī)溶劑提取方法，具體步驟如下:
[0008](I)提取農(nóng)藥殘留物:取20g試驗(yàn)土樣用石油醚:丙酮體積比為1:1的石油醚丙酮混合液120mL，在索氏提取器中先浸泡12h后75°C抽提6h，提取液濃縮至ImL得到土壤提取液。
[0009](2)驗(yàn)證農(nóng)藥殘留物的基因毒性:將土壤提取液均勻滴加到中性濾紙上，待石油醚丙酮混合液揮發(fā)后，吸取2ml的去離子水滴至中性濾紙，將3條蚯蚓放到中性濾紙上染毒12h，后將蚯蚓使用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試驗(yàn)土樣中農(nóng)藥殘留物。
[0010](3)驗(yàn)證農(nóng)藥殘留物的生態(tài)毒性:選取初始根生長良好、根長度一致的蠶豆種子，放入土壤提取液中，讓土壤提取液液體浸泡住蠶豆種子根尖染毒5h ;待土壤提取液揮發(fā)后，將染毒5h后的蠶豆種子使用微核實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試驗(yàn)土樣中農(nóng)藥殘留物的生態(tài)毒性。
[0011]2.當(dāng)土壤中殘留農(nóng)藥及其降解產(chǎn)物的性質(zhì)以水溶性農(nóng)藥占主導(dǎo)時(shí)，采取去離子水提取方法，具體步驟如下:
[0012](I)提取農(nóng)藥殘留物:取20g試驗(yàn)土樣，按照水:土壤體積比為1:2.5加入50mL去離子水，振蕩6h,然后在5000rpm/min條件下離心5min,取上清液,既得土壤提取液。
[0013](2)驗(yàn)證農(nóng)藥殘留物的基因毒性:取2mL 土壤提取液，均勻滴加到中性濾紙上；將3條蚯蚓放到中性濾紙上染毒12h ;將染毒12h后的蚯蚓使用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試驗(yàn)土樣中農(nóng)藥殘留物。
[0014](3)驗(yàn)證農(nóng)藥殘留物的生態(tài)毒性:選取初始根生長良好、根長度較一致的蠶豆種子，放入土壤提取液中，讓土壤提取液浸泡住根尖染毒5h ;將染毒5h后的蠶豆種子使用微核實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試驗(yàn)土樣中農(nóng)藥殘留物。
[0015]3.當(dāng)土壤中殘留的脂溶性農(nóng)藥與水溶性農(nóng)藥比例接近或不清楚土壤中哪類性質(zhì)的農(nóng)藥占主導(dǎo)時(shí)，采取泥漿直接暴露染毒法，具體步驟如下:
[0016]取10g試驗(yàn)土樣，加入30mL去離子水，混合均勻后放入三只蚯蚓，在光照透氣的條件下(23±2°C)，蚯蚓暴露染毒48h，并注意補(bǔ)充水分，保持濕度。暴露結(jié)束將蚯蚓取出，放在用4°C生理鹽水浸濕的濾紙上饑餓清腸12h，使其吐去腸內(nèi)雜物；將該蚯蚓使用彗星試驗(yàn)檢測(cè)試驗(yàn)土樣中農(nóng)藥殘留物的基因毒性。
[0017]本發(fā)明的有益效果在于根據(jù)不同性質(zhì)的農(nóng)藥及其降解代謝產(chǎn)物設(shè)計(jì)了三種不同的殘留毒性評(píng)價(jià)方法，可以高效提取出土壤中的農(nóng)藥殘留物，為全面綜合評(píng)價(jià)農(nóng)藥在土壤中的生態(tài)毒性提供了技術(shù)支持。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單易行，可重復(fù)操作性強(qiáng)，適用性廣，對(duì)不同極性性質(zhì)的農(nóng)藥都可適用，便于后續(xù)的基因毒性和生態(tài)毒性測(cè)定，具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
(四)

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1不同提取方法中硫丹對(duì)蚯蚓體腔細(xì)胞DNA損傷(Olive尾矩)的影響
[0019]該圖比較了本發(fā)明設(shè)計(jì)的三種不同評(píng)價(jià)方案在評(píng)價(jià)土壤中農(nóng)藥殘留物為硫丹，SP脂溶性農(nóng)藥占主導(dǎo)時(shí)，證明有機(jī)溶劑提取方法更適合提取土壤農(nóng)藥殘留物為脂溶性有機(jī)污染物。
[0020]圖2不同提取方法中啶蟲脒對(duì)蚯蚓體腔細(xì)胞DNA損傷(Olive尾矩)的影響
[0021]該圖比較了本發(fā)明設(shè)計(jì)的三種不同評(píng)價(jià)方案在評(píng)價(jià)土壤中農(nóng)藥殘留物為啶蟲脒，即水溶性農(nóng)藥占主導(dǎo)時(shí)，證明去離子水提取方法更適合提取土壤農(nóng)藥殘留物為水溶性有機(jī)污染物。
[0022]圖3不同提取方法中莠去津?qū)︱球倔w腔細(xì)胞DNA損傷(Olive尾矩)的影響
[0023]為進(jìn)一步驗(yàn)證脂溶性農(nóng)藥如莠去津，有機(jī)溶劑提取方法是否依然最為適用，該圖比較了三種不同評(píng)價(jià)方案在評(píng)價(jià)土壤中農(nóng)藥殘留物為莠去津時(shí)，證明了有機(jī)溶劑提取方法更適合提取土壤農(nóng)藥殘留物為脂溶性有機(jī)污染物。此外，還說明了泥漿直接暴露染毒法也可用于評(píng)價(jià)脂溶性農(nóng)藥占主導(dǎo)的土壤殘留基因毒性。
[0024]圖4不同提取方法中吡蟲啉對(duì)蚯蚓體腔細(xì)胞DNA損傷(Olive尾矩)的影響
[0025]為進(jìn)一步驗(yàn)證水溶性農(nóng)藥如吡蟲啉，去離子水提取方法是否依然最為適用，該圖比較了三種不同評(píng)價(jià)方案在評(píng)價(jià)土壤中農(nóng)藥殘留物為吡蟲啉時(shí)，證明了去離子水方法更適合提取土壤農(nóng)藥殘留物為水溶性有機(jī)污染物。此外，還說明了泥漿直接暴露染毒法也可用于評(píng)價(jià)水溶性農(nóng)藥占主導(dǎo)的土壤殘留基因毒性。
[0026]圖5硫丹降解動(dòng)態(tài)過程中對(duì)蚯蚓體腔細(xì)胞DNA損傷程度(Olive尾距)的影響
[0027]該圖為本發(fā)明的具體實(shí)施運(yùn)用，模擬硫丹在土壤中降解，產(chǎn)生各種不同性質(zhì)污染物后，對(duì)土壤基因毒性的綜合評(píng)價(jià)。
(五)

【具體實(shí)施方式】
[0028]以下實(shí)例中未詳盡描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。應(yīng)理解以下實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何形式限制本發(fā)明的范圍。
[0029]實(shí)施例1確定殘留毒性提取方法過程
[0030]有機(jī)溶劑提取方法
[0031]初步實(shí)驗(yàn)方案:取20g試驗(yàn)土樣用石油醚:丙酮(體積比為1:1)的混合液120mL，在索氏提取器中先浸泡12h后抽提6h。提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至約ImL得到土壤提取液；然后將土壤提取液轉(zhuǎn)移到比色管中(或容量瓶中)，用高純氮?dú)鈱⑼寥捞崛∫捍抵?yL后(吹的過程中注意:量少時(shí)加入2-3次DMS0，每次lml，繼續(xù)吹。)，用DMSO(二甲基亞砜)溶劑定容至5mL，用來準(zhǔn)備試驗(yàn)。
[0032]按照本實(shí)驗(yàn)方案，若用于試驗(yàn)的蚯蚓均死亡，應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行修改。修改中主要解決以下三個(gè)方面的疑問:(I) 二甲基亞砜(DMSO)對(duì)蚯蚓是否有毒性，能否用DMSO定容；
(2)石油醚和丙酮混合液(體積比1:1)揮發(fā)后濾紙上是否需要滴加去離子水；(3)蚯蚓的體腔細(xì)胞能否體外染毒。
[0033]為解決上述三個(gè)問題，設(shè)計(jì)對(duì)比實(shí)驗(yàn)方案如下:
[0034](I) 二甲基亞砜對(duì)蚯蚓的毒性
[0035]為驗(yàn)證二甲基亞砜對(duì)蚯蚓的毒性，將二甲基亞砜直接滴加至濾紙上給蚯蚓染毒，看蚯蚓在濾紙上的存活狀況。
[0036](2)石油醚和丙酮混合液(體積比1:1)揮發(fā)后濾紙上是否需要滴加去離子水設(shè)計(jì)四個(gè)對(duì)比實(shí)驗(yàn)組:
[0037]①石油醚和丙酮混合液揮發(fā)后不滴加去離子水，濾紙直接與蚯蚓接觸；
[0038]②石油醚和丙酮混合液揮發(fā)后滴加ImL的去離子水至濾紙上，再放入蚯蚓；
[0039]③石油醚和丙酮混合液揮發(fā)后滴加2mL的去離子水至濾紙上，再放入蚯蚓；
[0040]④將去離子水直接滴加至空白濾紙上:滴加ImL去離子水和滴加2mL去離子水各設(shè)一組，再分別放入蚯蚓。
[0041](3)蚯蚓的體腔細(xì)胞能否體外染毒
[0042]提取蚯蚓的體腔細(xì)胞:
[0043]將濾紙放入培養(yǎng)皿中，滴加2mL的生理鹽水至濾紙上，潤濕濾紙。取出待試蚯蚓，將蚯蚓先放入盛用少量生理鹽水的培養(yǎng)皿中以洗凈身體表面的泥土，再轉(zhuǎn)移至滴加2mL生理鹽水的培養(yǎng)皿中過夜，吐泥。第二天，取出在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜，吐泥后空腹的蚯蚓，將其放入裝有2ml生理鹽水的5ml離心管中，2-3分鐘后，取出。如果必要可以輕輕按摩蚯蚓的尾部，促使其排出體內(nèi)多余的物質(zhì)。將蚯蚓放入裝有1.5ml 4°C的體腔細(xì)胞浸提液【體腔細(xì)胞浸濕液組分:5%乙醇，95%生理鹽水，2.5mg/mLEDTA, 10mg/mL愈瘡木酚甘油醚(pH = 7.3)】的5ml或1ml離心管中，蚯蚓受到刺激后，會(huì)將體腔細(xì)胞排出到體腔細(xì)胞浸提液中，2_3分鐘后，將蚯蚓取出。將含有蚯蚓體腔細(xì)胞的體腔細(xì)胞浸提液轉(zhuǎn)移至2ml離心管中。將裝有蚯蚓體腔細(xì)胞的2ml離心管4°C下離心(3000g，1min)。離心后，移去上清液；吸取Iml 4°C的PBS磷酸緩沖液【IL PBS磷酸緩沖液組分:0.24g磷酸二氫鉀，1.44g磷酸氫二鈉，8g氯化鈉,0.2g氯化鉀,加去離子水約800mL充分?jǐn)嚢枞芙?然后加入濃鹽酸調(diào)pH至7.4,最后定容到1L】至裝有蚯蚓體腔細(xì)胞的離心管中，將蚯蚓體腔細(xì)胞在PBS溶液中混勻，再次3000g離心lOmin。移走離心后的PBS上清液，即得蚯蚓的體腔細(xì)胞。
[0044]體腔細(xì)胞染毒:
[0045]將提取出的約Iml石油醚:丙酮體積比為1:1的石油醚和丙酮混合液加入到裝有蚯蚓體腔細(xì)胞的離心管中，4°C下，染毒2h。用濃度為0.02mol/L硼酸鹽緩沖溶液(pH9.0)清洗體腔細(xì)胞2次，4°C、3000g、離心20min。吸取lml4°C的PBS磷酸緩沖液至裝有蚯蚓體腔細(xì)胞離心20min后的離心管中，將體腔細(xì)胞在PBS磷酸緩沖液中混勻，制備成細(xì)胞懸浮液，待用。
[0046]后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟采用彗星實(shí)驗(yàn)操作步驟。
[0047]上述三個(gè)對(duì)比實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為:
[0048](I) 二甲基亞砜直接滴加至濾紙上給蚯蚓染毒時(shí)，蚯蚓迅速掙扎，吐出體腔細(xì)胞，5min后死亡，證明二甲基亞砜對(duì)蚯蚓有毒性，不能用于此實(shí)驗(yàn)中。
[0049](2)石油醚和丙酮混合液(體積比1:1)揮發(fā)后不滴加去離子水給蚯蚓染毒時(shí)，蚯蚓放入時(shí)未有明顯的不適反應(yīng)，但12h后，有三分之一的蚯蚓死亡。石油醚和丙酮混合液揮發(fā)后滴加去離子水ImL或2mL，蚯蚓均未出現(xiàn)不適反應(yīng)，12h后，滴加ImL去離子水的組中，蚯蚓出現(xiàn)輕微不適反應(yīng)。只有滴加2mL去離子水的實(shí)驗(yàn)組中，蚯蚓未出現(xiàn)任何不適反應(yīng)，蚯蚓活性良好。
[0050](3)體腔細(xì)胞體外染毒實(shí)驗(yàn)失敗，實(shí)驗(yàn)中，染毒后的體腔細(xì)胞與石油醚和丙酮混合液(體積比1:1)不能完全分開，會(huì)損失一部分的細(xì)胞。剩余細(xì)胞用于彗星實(shí)驗(yàn)中，空白組與實(shí)驗(yàn)組并無差別，彗星脫尾現(xiàn)象均不明顯。
[0051]根據(jù)以上三個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可得下述結(jié)論:
[0052](I) 二甲基亞砜對(duì)蚯蚓有毒性，會(huì)造成蚯蚓的死亡。故不能用于定容有機(jī)溶劑給蚯蚓染毒。
[0053](2)根據(jù)蚯蚓生活的濕度應(yīng)為60% -70%這個(gè)條件，及實(shí)驗(yàn)中蚯蚓在添加2mL的去離子水狀態(tài)優(yōu)于ImL的去離子水，故有機(jī)溶劑在濾紙上揮發(fā)完后應(yīng)滴加2mL的去離子水。
[0054](3)蚯蚓體腔細(xì)胞不適于體外染毒。
[0055]由上述三個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)論，確定有機(jī)溶劑提取方法如下:
[0056]取20g試驗(yàn)土樣用石油醚:丙酮(體積比為1:1)的混合液120mL，在索氏提取器中先浸泡12h后75°C抽提6h。提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至約lmL，然后將土壤提取液均勻加入鋪襯了 9cm中性濾紙的培養(yǎng)皿中。待有機(jī)溶劑揮發(fā)后，吸取2ml的去離子水滴至濾紙上，培養(yǎng)皿中放入3條蚯蚓，染毒12h。
[0057]1.去離子水提取方法
[0058]設(shè)計(jì)初步實(shí)驗(yàn)方案如下:取20g試驗(yàn)土樣，加入一定量的去離子水，在振蕩器上振蕩一定時(shí)間后，取上清液準(zhǔn)備蚯蚓彗星試驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)方法在探索中主要面臨以下三個(gè)問題:
(I)在土壤中需添加多少量的去離子水？(2)振蕩時(shí)間需多久？(3)用什么方法把水從土壤中分離出來？
[0059]為解決上述問題，故設(shè)計(jì)以下三個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)比組:
[0060](I)水土比
[0061]設(shè)計(jì)三個(gè)對(duì)比組:水土體積比分別為1:1、1:2.5、1:5。
[0062](2)振蕩時(shí)間
[0063]設(shè)計(jì)四個(gè)對(duì)比組:振蕩時(shí)間分別為2、4、6、8h。
[0064](3)水土分離方法
[0065]設(shè)計(jì)三個(gè)對(duì)比組:過濾、抽濾、離心。
[0066]由上述三組對(duì)比實(shí)驗(yàn)，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
[0067](I)最優(yōu)水土體積比為1:2.5。水土體積比1:1時(shí)，得到的為泥漿，不利于后來的水土分離，而當(dāng)水土體積比為1:5時(shí)，水又過于多，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0068](2)最適振蕩時(shí)間為6h。振蕩時(shí)間為2h、4h時(shí)，提取出的上清液用于染毒時(shí)，效果不如6h及8h的好，而當(dāng)振蕩時(shí)間為8h時(shí)，染毒效果與6h接近。
[0069](3)水土分離方法選用離心。采用濾紙過濾時(shí)，速度過慢，要6h以上才能過濾完，且到過濾后期，濾紙易破，造成一部分的土壤到濾液中。采用抽濾時(shí)，速度也不快，要Ih才能抽濾完一個(gè)樣，效率過低。而采用離心時(shí)，水土分離效果好，且節(jié)約時(shí)間，效率大大提高。
[0070]2.由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定去離子水提取方法如下:
[0071]取20g試驗(yàn)土樣，加入50mL去離子水(水與土壤的比例為1:2.5)，在振蕩器上振蕩6h后,然后在5000rpm/min條件下離心5min,取上清液準(zhǔn)備Φ丘蝴彗星試驗(yàn)。用移液管吸ImL受試物溶液，均勻加入鋪襯了中性濾紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中加入3條蚯蚓，染毒12h。
[0072]3.泥漿直接暴露染毒法
[0073]設(shè)計(jì)初步實(shí)驗(yàn)方案如下:取10g試驗(yàn)土樣，加入一定量的去離子水，混合均勻后將3只蚯蚓放入，在光照透氣的條件下(23±2°C )，蚯蚓暴露染毒一定時(shí)間，并注意補(bǔ)充水分，保持濕度。該實(shí)驗(yàn)方法在探索中主要面臨以下兩個(gè)問題:(I)在土壤中需添加多少量的去離子水？(2)蚯蚓暴露染毒時(shí)間需多久？
[0074]為解決上述問題，故設(shè)計(jì)以下三個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)比組:
[0075](I)去離子水體積
[0076]設(shè)計(jì)四個(gè)對(duì)比組:分別添加去離子水20mL、30mL、40mL、50mL。
[0077](2)蚯蚓暴露染毒時(shí)間
[0078]設(shè)計(jì)五個(gè)對(duì)比組:染毒時(shí)間分別為24、36、48、60h。
[0079]由上述兩組對(duì)比實(shí)驗(yàn)，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
[0080](I)最優(yōu)添加去離子體積為30mL。添加去離子水20mL時(shí)，有部分土壤沒有被水稀釋變成泥漿，但添加去離子水40、50mL時(shí)，土壤變成泥漿后，還會(huì)有多余部分的水沉積在土壤上層，易造成蚯蚓被淹死，不利于后續(xù)蚯蚓暴露染毒實(shí)驗(yàn)。
[0081](2)最適染毒時(shí)間為48h。染毒時(shí)間為24、36h時(shí)，蚯蚓體腔細(xì)胞損傷效果不如48h的好，但當(dāng)染毒時(shí)間為60h時(shí)，試驗(yàn)土壤若含有較高濃度的殘留農(nóng)藥時(shí)，易引發(fā)部分蚯蚓死亡。
[0082]4.由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定泥漿直接暴露染毒法如下:
[0083]取10g試驗(yàn)土樣，加入30mL去離子水，混合均勻后將3只蚯蚓放入，在光照透氣的條件下(23±2°C)，蚯蚓暴露染毒48h，并注意補(bǔ)充水分，保持濕度。暴露結(jié)束將蚯蚓取出，放在用4°C生理鹽水浸濕的濾紙上使其吐去腸內(nèi)雜物，饑餓清腸12h后，該蚯蚓即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0084]實(shí)施例2 土壤中不同性質(zhì)農(nóng)藥殘留毒性測(cè)定方法比較
[0085]1.試驗(yàn)土壤
[0086]土壤研磨后過2mm篩，選取四種不同性質(zhì)的農(nóng)藥為代表按一定濃度添加至土壤中。這四種農(nóng)藥分別為硫丹、啶蟲脒、吡蟲啉和莠去津，分別設(shè)定各農(nóng)藥在土壤中的染毒濃度如下:土壤中添加硫丹濃度設(shè)定為:對(duì)照組(0)、0.1,1.0,10.0mg/kg四個(gè)處理；土壤中添加唳蟲脒設(shè)定濃度為:對(duì)照組(O)、0.05、0.1、0.5mg/kg四個(gè)處理；土壤中添加卩比蟲啉設(shè)定濃度為:對(duì)照組(0)、0.1,0.5、lmg/kg四個(gè)處理；土壤中添加莠去津設(shè)定濃度為:對(duì)照組
(O)>0.1、0.5、2.5mg/kg四個(gè)處理。污染物添加至土壤中后,混勻,平衡l_2h后方可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0087]2.提取土壤中有機(jī)物殘留毒性
[0088]利用實(shí)施例1中所述的最終確定的三種提取方法，分別提取實(shí)施例2中I)所述試驗(yàn)土壤中所涉及的不同性質(zhì)的農(nóng)藥及其降解產(chǎn)物的殘留毒性濾液，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)。
[0089]3.彗星實(shí)驗(yàn)
[0090](I)用實(shí)施例2中2)所提取出的含有土壤殘留毒性的濾液給蚯蚓染毒，染毒12h后,將蚯蚓放置于5ml離心管中，再在每個(gè)5ml離心管中添加2ml的生理鹽水，2_3min后，取出蚯蚓。
[0091](2)將蚯蚓放至5ml或1ml離心管中，向離心管中加入1.5ml的體腔細(xì)胞浸提液，2-3min后，當(dāng)液體變?yōu)榈S色時(shí)，將蚯蚓取出，將含有蚯蚓體腔細(xì)胞的體腔細(xì)胞浸提液轉(zhuǎn)移至2ml離心管中。
[0092](3)將裝有蚯蚓體腔細(xì)胞的2ml離心管4°C下離心(3000g，1min)。
[0093](4)離心后，移去上清液，吸取lml PBS溶液(4°C )至離心管中，使體腔細(xì)胞在PBS溶液中混勻，4°C再次離心(3000g，1min)。
[0094](5)移走離心后的PBS上清液，吸取100 μ I的PBS緩沖液(4°C )至離心管中，將體腔細(xì)胞在PBS溶液中混勻，制備成細(xì)胞懸浮液，待用。
[0095](6)在60°C下，在載玻片上滴上100 μ I濃度為0.8% ΝΜΑ，蓋上蓋玻片，置室溫下20min,使瓊脂固化。
[0096](7)輕輕移開蓋玻片，在37°C下，將懸于20μ I PBS中的受檢細(xì)胞與500μ I 1.0%LMA相混，將細(xì)胞懸液滴到第一層膠上，盡量鋪薄。蓋上蓋玻片，置4°C 15min，使瓊脂固化。
[0097](8)在37°C下，移開第二層蓋玻片，將50 μ I 0.5% LMA作為第三層，滴加在含有細(xì)胞的瓊脂上。置4°C 15min，使瓊脂固化。以上鋪膠過程一定要防止氣泡產(chǎn)生。
[0098](9)移開蓋玻片，將載玻片浸入新配制的4°C裂解液中，于4°C下放置lh，但時(shí)間不能過長，長時(shí)間的裂解可能導(dǎo)致裂解液沉淀。
[0099](10)將載玻片取出，用去離子水洗去載玻片上多余的裂解液，吸水紙吸干。
[0100](11)將載玻片置于水平凝膠電泳槽中的陽極端，電泳槽中盛有新配制的高pH電泳緩沖液，在緩沖液中放置30min，以便使DNA在電泳前解螺旋。
[0101](12)調(diào)整電泳槽中緩沖液面高度，使電泳儀的電壓為25V(恒壓)，電流為300mA。電泳15min。
[0102](13)電泳后，取出載玻片用蒸餾水沖洗3次，并用吸水紙吸取多余的水分，將載玻片浸入ρΗ7.5的Tris-HCl緩沖溶液中和15min。
[0103](14)中和后，用無水乙醇脫水lh，放于冰箱中，保持載玻片處于濕潤狀態(tài)。于一周內(nèi)熒光分析。
[0104](15)載玻片EB染色20min后，用熒光顯微鏡觀察，在自動(dòng)曝光條件下拍照以獲取彗星圖像后，用CASP軟件分析測(cè)定衡量DNA損傷的各種參數(shù)。
[0105]4.微核實(shí)驗(yàn)
[0106](I)浸種催芽:將蠶豆放入盛有蒸餾水的的燒杯中，置25°C的溫箱內(nèi)浸泡24_36h。為保持濕度，種子吸脹后，用紗布松松包裹置解剖盤中，在25°C的溫箱中催芽12h-24h。待種子初生根露出2-3_時(shí)，選取發(fā)芽良好的種子，放入鋪有薄層濕脫脂棉的解剖盤內(nèi)，仍置于25°C的溫箱中繼續(xù)催芽，保持濕度。再經(jīng)36-48h，種子大部分的初生根長至1.5-2cm，根毛發(fā)育良好，這時(shí)就可作為試驗(yàn)之用。
[0107](2)藥劑處理根尖:每一處理選取6-8粒初始根生長良好、根長較一致的種子，放入盛有染毒液的培養(yǎng)皿中，讓液體浸泡住根尖即可。染毒液為實(shí)施案例I中有機(jī)溶劑和去離子水提取出的濾液。同時(shí)設(shè)去離子水對(duì)照組。置25°C的溫箱內(nèi)培養(yǎng)，染毒時(shí)間為5h。
[0108](3)根尖細(xì)胞修復(fù)培養(yǎng):將處理后的種子，用蒸餾水浸洗3次，洗凈后的種子再放入新鋪好的濕脫脂棉的解剖盤內(nèi)，按前述培養(yǎng)條件使根尖細(xì)胞修復(fù)22-24h，亦可在培養(yǎng)皿中用蒸餾水浸住根尖修復(fù)培養(yǎng)。
[0109](4)固定根尖細(xì)胞:將修復(fù)培養(yǎng)后的種子，從根尖頂端切下Icm長的幼根放入空青霉素瓶中，加入卡諾氏固定液，固定24-48h。固定后的幼根如不及時(shí)制片,可放入濃度為70 %的乙醇中，置4°C的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?br> [0110](5)孚爾根染色:固定好的幼根，在青霉素瓶中用蒸餾水浸洗2次。吸凈蒸餾水，再加入5mol/LHCl將幼根泡住，連瓶放入28 °C水浴鍋中水解幼根25min左右，視幼根軟化的程度可適當(dāng)增減時(shí)間，當(dāng)幼根被軟化即可。用蒸餾水浸洗幼根2次。在暗室或遮光的條件下加席夫試劑，每瓶用量以淹住幼根液面2mm為好。在遮光條件下染色4-6h。除去染液，用SO2洗滌液浸洗幼根2次。
[0111](6)制片:將幼根放在載玻片上，用解剖針截下Imm的幼根。滴上少許的蒸餾水，用解剖針將根尖搗碎。加蓋玻片，并避免氣泡產(chǎn)生。
[0112](7)鏡檢:光學(xué)顯微鏡觀察壓片結(jié)果。微核識(shí)別的標(biāo)準(zhǔn):是主核大小的1/3以下，并于主核分離的小核；小核著色與主核相當(dāng)或稍淺；小核形態(tài)可為圓形、橢圓形、不規(guī)則形等。每一處理統(tǒng)計(jì)4個(gè)根尖，每個(gè)根尖統(tǒng)計(jì)1000個(gè)細(xì)胞。
[0113](8)結(jié)果與計(jì)算:
[0114]測(cè)試樣品微核千分率(％。)的計(jì)算為:
[0115]

MNmx剛0%
測(cè)定樣品觀察到的細(xì)胞數(shù)
[0116]5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0117]⑴硫丹
[0118]由附圖1中可以看出，0.1，1.0,10.0mg/kg三個(gè)劑量組硫丹對(duì)蚯蚓體腔細(xì)胞DNA均有損傷作用，而且隨著濃度的增加，彗星Olive尾矩的值隨之增加，這說明DNA損傷程度隨硫丹的劑量增加而增大。相同濃度處理下，水提和有機(jī)溶劑提取有明顯的差異性(P〈0.05)，而泥漿提取在低濃度下與水提取沒有明顯的差異性，高濃度時(shí)則與有機(jī)溶劑提取沒有明顯的差異性。從三個(gè)處理組各濃度間彗星Olive尾矩值增量比較，水提時(shí)，隨著濃度的增加變化不明顯，而有機(jī)溶劑和泥漿提取則隨著硫丹劑量增加變化明顯。因此，有機(jī)溶劑和泥漿提取土壤中的硫丹優(yōu)于用水提取。值得注意的是，當(dāng)硫丹濃度為10mg/kg時(shí)，泥漿提取方法中蚯蚓全部死亡。用有機(jī)溶劑提取時(shí)，由于有機(jī)溶劑本身會(huì)對(duì)蚯蚓造成一定的損傷，故空白組和低濃度硫丹組DNA損傷程度較大。綜上，對(duì)于判斷土壤中的硫丹對(duì)蚯蚓的生理毒性，低濃度時(shí)，適合于用泥漿提取，高濃度時(shí)可用有機(jī)溶劑提取。
[0119]采用蠶豆根尖微核試驗(yàn)測(cè)定的不同提取方法提取土壤中硫丹對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核率影響的試驗(yàn)結(jié)果見表1，由表I可見，硫丹能誘發(fā)一定頻率的微核，3個(gè)不同濃度的硫丹所誘發(fā)的微核率均明顯高于對(duì)照組。有機(jī)溶劑提取出的硫丹對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞的微核率各處理濃度均大于水提組。因此，對(duì)于判斷土壤中的硫丹對(duì)蠶豆的生理毒性，有機(jī)溶劑提取方法更適用。
[0120]綜合蚯蚓彗星實(shí)驗(yàn)與蠶豆微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用有機(jī)溶劑更適合于提取土壤中殘留硫丹。
[0121]表I不同提取方法中硫丹對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核率(％。)的影響
[0122]


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[0123](2)啶蟲脒
[0124]由附圖2可以看出，0.05,0.1,0.5mg/kg三個(gè)劑量組啶蟲脒對(duì)蚯蚓體腔細(xì)胞DNA的損傷程度隨著濃度的增加而增大。相同濃度處理下，水提和有機(jī)溶劑提取有明顯的差異性(p〈0.05)，而泥漿提取與水提取沒有明顯的差異性，與有機(jī)溶劑提取差異性顯著。從三個(gè)處理組各濃度間彗星Olive尾矩值增量比較，隨著濃度的增加各組的變化均顯著。因此，三種方法均可用于提取土壤中的啶蟲脒殘留毒性。然而，用有機(jī)溶劑提取時(shí)，有機(jī)溶劑本身對(duì)蚯蚓有損傷作用，對(duì)照組較其他兩種方法呈現(xiàn)較大的DNA損傷，從這點(diǎn)比較，水提優(yōu)于有機(jī)溶劑。另一方面，隨著啶蟲脒濃度增大時(shí)，泥漿提取造成的蚯蚓體腔細(xì)胞DNA損傷變化不如水提的顯著，因此，泥漿提取土壤中啶蟲脒殘留毒性的靈敏度不如有水提取。綜上，雖然三種方法均可用于提取土壤中啶蟲脒的殘留毒性，但水提方法較另外兩種方法更適合于提取土壤中的啶蟲脒殘留毒性。
[0125]采用微核試驗(yàn)測(cè)定的不同提取方法提取土壤中啶蟲脒對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核率影響的試驗(yàn)結(jié)果見表8，由表8可見，啶蟲脒能誘發(fā)一定頻率的微核，3個(gè)不同濃度的啶蟲脒所誘發(fā)的微核率均明顯高于對(duì)照組。有機(jī)溶劑提取出的啶蟲脒對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞的微核率各處理濃度均大于等于水提組，然而，由于有機(jī)溶劑本身會(huì)對(duì)蠶豆造成一定的損傷，故空白組和低濃度啶蟲脒組微核率較大，其各組間的差異性顯著不如水提組。因此，對(duì)于判斷土壤中的啶蟲脒對(duì)蠶豆的生理毒性，用水提取方法更適用。
[0126]綜合蚯蚓彗星實(shí)驗(yàn)與蠶豆微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用水提取方法更適合于提取土壤中啶蟲脒的殘留毒性。
[0127]表2不同提取方法中啶蟲脒對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核率(％。)的影響

【權(quán)利要求】
1.一套評(píng)價(jià)土壤中農(nóng)藥殘留毒性變化的方法，其特征在于是根據(jù)土壤中殘留農(nóng)藥的性質(zhì)不同而采取不同的提取步驟: 1)當(dāng)土壤中殘留農(nóng)藥及其降解產(chǎn)物以脂溶性農(nóng)藥占主導(dǎo)時(shí)，采取有機(jī)溶劑提取方法: a提取農(nóng)藥殘留物:取20g試驗(yàn)土樣用石油醚:丙酮體積比為1:1的石油醚丙酮混合液120mL，在索氏提取器中先浸泡12h后75°C抽提6h，提取液濃縮至ImL得到土壤提取液；b驗(yàn)證農(nóng)藥殘留物的基因毒性:將土壤提取液均勻滴加到中性濾紙上，待石油醚丙酮混合液揮發(fā)后，吸取2ml的去離子水滴至中性濾紙，將3條蚯蚓放到中性濾紙上染毒12h，后將蚯蚓使用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試驗(yàn)土樣中農(nóng)藥殘留物； c驗(yàn)證農(nóng)藥殘留物的生態(tài)毒性:選取初始根生長良好、根長度一致的蠶豆種子，放入土壤提取液中，讓土壤提取液液體浸泡住蠶豆種子根尖染毒5h ;待土壤提取液揮發(fā)后，將染毒5h后的蠶豆種子使用微核實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試驗(yàn)土樣中農(nóng)藥殘留物的生態(tài)毒性； 2)當(dāng)土壤中殘留農(nóng)藥及其降解產(chǎn)物的性質(zhì)以水溶性農(nóng)藥占主導(dǎo)時(shí)，采取去離子水提取方法: a提取農(nóng)藥殘留物:取20g試驗(yàn)土樣，按照水:土壤體積比為1:2.5加入50mL去離子水，振蕩6h,然后在5000rpm/min條件下離心5min,取上清液,得到土壤提取液； b驗(yàn)證農(nóng)藥殘留物的基因毒性:取2mL 土壤提取液，均勻滴加到中性濾紙上；將3條蚯蚓放到中性濾紙上染毒12h ;將染毒12h后的蚯蚓使用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試驗(yàn)土樣中農(nóng)藥殘留物； c驗(yàn)證農(nóng)藥殘留物的生態(tài)毒性:選取初始根生長良好、根長度較一致的蠶豆種子，放入土壤提取液中，讓土壤提取液浸泡住根尖染毒5h ;將染毒5h后的蠶豆種子使用微核實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試驗(yàn)土樣中農(nóng)藥殘留物； 3)當(dāng)土壤中殘留的脂溶性農(nóng)藥與水溶性農(nóng)藥比例接近或不清楚土壤中哪類性質(zhì)的農(nóng)藥占主導(dǎo)時(shí)，采取泥漿直接暴露染毒法: 取10g試驗(yàn)土樣,加入3OmL去離子水,混合均勻后放入三只艇蝴丘蝴暴露染毒48h ；染毒結(jié)束將蚯蚓取出，放在用4°C生理鹽水浸濕的濾紙上饑餓清腸12h，使其吐去腸內(nèi)雜物；將該蚯蚓使用彗星試驗(yàn)檢測(cè)試驗(yàn)土樣中農(nóng)藥殘留物的基因毒性。
【文檔編號(hào)】G01N33/24GK104198678SQ201410472487
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】朱魯生, 孔玲芬, 王軍, 王金花, 謝慧 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)