本發(fā)明涉及基因工程
技術領域：
，具體涉及一種重組釀酒酵母菌株及其構建方法和應用。
背景技術：
：黃酮類藥物作為一種具有藥用價值的天然化合物，因為其具有抗菌、抗炎、抗癌、解痙和利膽作用等方面的作用被廣泛應用。8-二甲基異戊烯基柚皮素(8dn)作為生產(chǎn)黃酮類類藥物淫羊藿苷的重要中間體，在醫(yī)藥合成領域有重大應用。目前，8dn的制備大多采用植物提取和化學合成的方法實現(xiàn)，但植物提取過程步驟多、收率低、副產(chǎn)物分離復雜，而化學合成則容易對環(huán)境造成污染，極大的限制了8dn的生產(chǎn)和應用。相較而言微生物合成以低成本、高產(chǎn)量和產(chǎn)品安全性等被認為是有前途的生產(chǎn)方法。釀酒酵母作為公認的安全模式微生物，遺傳背景清楚、基因操作簡單、可進行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。8dn在酵母細胞中的合成，需要先進行生產(chǎn)柚皮素路徑的構建，同時引入外源基因n8dt進而獲得目標產(chǎn)物，在釀酒酵母中通過飼喂柚皮素的生物轉化方法得到的8dn。已有的相關文獻是sasaki等人在2007年發(fā)現(xiàn)了苦參體內存在將柚皮素轉化為8-二甲基丙烯基柚皮素的關鍵酶n8dt，2009年日本京都大學植物基因表達實驗室的yazaki課題組通過外源添加柚皮素，同時引入苦參來源的n8dt基因獲得8二甲基異戊烯基柚皮素，產(chǎn)量為20μg/g。但該生產(chǎn)方式受限于原料柚皮素的高成本和柚皮素難以進入酵母細胞的低利用率。目前，還未發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母中從初級氨基酸出發(fā)直接得到8dn的相關報道。技術實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種在釀酒酵母中從酪氨酸出發(fā)直接得到8-二甲基丙烯基柚皮素的重組釀酒酵母菌株及其構建方法與應用。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：一種重組釀酒酵母菌株，包含經(jīng)優(yōu)化的tal基因、4cl基因、chs基因、chi基因和n8dt基因，所述tal基因為圓紅冬孢酵母來源tal基因序列；所述4cl基因為歐芹來源tal基因序列；所述chs基因為擬南芥來源chs基因序列；所述chi基因為蜜柑來源chi基因序列；所述n8dt基因為苦參來源n8dt基因序列。優(yōu)選的，所述經(jīng)優(yōu)化為經(jīng)過釀酒酵母密碼子優(yōu)化并規(guī)避bsai限制性內切酶酶切位點，同時在基因兩端分別添加seqidno:15和seqidno:16所示。優(yōu)選的，所述tal基因的核苷酸序列如seqidno:1所示；所述4cl基因的核苷酸序列如seqidno:2所示；所述chs基因的核苷酸序列如seqidno:3所示；所述chi基因的核苷酸序列如seqidno:10所示；所述n8dt基因的核苷酸序列如seqidno:14所示。本發(fā)明還提供了所述重組釀酒酵母菌株的構建方法，將經(jīng)優(yōu)化的tal基因、4cl基因、chs基因、chi基因和n8dt基因整合到釀酒酵母底盤菌株基因組中。其中，優(yōu)選的，所述釀酒酵母底盤菌株為釀酒酵母cenpk2-1d。進一步優(yōu)選的，具體包含如下步驟：步驟1、用酶切連接的方法將經(jīng)優(yōu)化的外源tal、4cl、chs和chi基因分別構建到prs415k-gpm1t-pgk1p-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-pgk1t和prs414-pgk1t-hxt7p-cyc1t質粒中，采用醋酸鋰法將上述質粒轉化釀酒酵母底盤菌中，sc-leu,ura,his,trp固體培養(yǎng)基篩選轉化子；步驟2、將經(jīng)釀酒酵母密碼子優(yōu)化的外源n8dt基因與prs425k-eno2t-pdc2p-gpm2t質粒連接，采用醋酸鋰法轉化到步驟2篩選得到的轉化子菌株中采用sc-leu固體平板培養(yǎng)基篩選轉化子。本發(fā)明還提供了所述的重組釀酒酵母菌株在生產(chǎn)8-二甲基異戊烯基柚皮素中的應用。進一步，本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)8-二甲基異戊烯基柚皮素的方法，將所述的重組釀酒酵母菌株接入種子培養(yǎng)基活化；將活化后的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)后收集菌體細胞提取8-二甲基異戊烯基柚皮素。優(yōu)選的，所述生產(chǎn)8-二甲基異戊烯基柚皮素的方法具體為將所述的重組釀酒酵母菌株接入種子培養(yǎng)基在30℃、250rpm活化24h，轉接至新鮮的種子培養(yǎng)基，在30℃、250rpm活化18h，轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基30℃、250rpm發(fā)酵96h，收集菌體提取8-二甲基異戊烯基柚皮素。優(yōu)選的，所述種子培養(yǎng)基為22g/l葡萄糖、6.7g/lynb、2g/l缺異亮氨酸的混合氨基酸粉末，余量為水；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為20g/l葡萄糖、6.7g/lynb、2g/l缺異亮氨酸的混合氨基酸粉末、0.5g/l酪氨酸，余量為水。本發(fā)明所述重組釀酒酵母實現(xiàn)了以酪氨酸為底物生產(chǎn)8-二甲基異戊烯基柚皮素，在重組釀酒酵母菌株中，圓紅冬孢酵母來源tal基因、歐芹來源tal基因、擬南芥來源chs基因、蜜柑來源chi基因和苦參來源n8dt基因組合具有高產(chǎn)8-二甲基異戊烯基柚皮素的效果，實驗表明8-二甲基異戊烯基柚皮素產(chǎn)量可達36.7μg/l。利用本發(fā)明所述重組釀酒酵母菌株生產(chǎn)8-二甲基異戊烯基柚皮素相對于植物提取和化學合成成本低、副產(chǎn)物少且污染小，為8二甲基異戊烯基柚皮素及其相關產(chǎn)物的生產(chǎn)提供了一種切實可行的方法。而與已報道的飼喂柚皮素得到的8dn的生產(chǎn)方式相比，本發(fā)明實現(xiàn)了在釀酒酵母體內從氨基酸合成黃酮類藥物8dn的全合成途徑，利用了更經(jīng)濟的初級氨基酸原料，同時也克服了原料難以進入細胞的低利用率問題，在類藥物的合成方面具有更大的生產(chǎn)潛力和更好的經(jīng)濟效益。并為淫羊藿素、淫羊藿苷的生物合成打下基礎，同時對其他種微生物合成8-二甲基異戊烯基柚皮素具有指導意義。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1示重組釀酒酵母合成8-二甲基異戊烯基柚皮素的路徑圖；圖2示釀酒酵母游離多拷貝質粒構建過程圖；圖3示實施例1柚皮素標準曲線；圖4示重組釀酒酵母菌株5種來源chs基因和6種來源chi基因兩兩組合后的柚皮素搖瓶產(chǎn)量比較圖；圖5示高產(chǎn)柚皮素菌株sybe_sc02050003中的模塊酵母組裝過程圖；圖6示將帶有n8dt基因的多拷貝質粒導入重組酵母后的8-二甲基異戊烯基柚皮素搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量統(tǒng)計圖。具體實施方式本發(fā)明公開了一種重組釀酒酵母及其構建方法與應用。本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及產(chǎn)品已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內容、精神和范圍內對本文所述的方法進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。本發(fā)明以釀酒酵母cen.pk2-1d為底盤菌株，分別選取5種和6種不同來源的且經(jīng)優(yōu)化的合成柚皮素的功能基因chs和chi，以及經(jīng)優(yōu)化的tal，4cl基因，經(jīng)模塊化設計整合至釀酒酵母底盤菌基因組上，通過搖瓶發(fā)酵篩選釀酒酵母合成柚皮素最優(yōu)的外源功能基因組合。再以篩選過后的菌株作為底盤，導入帶有n8dt基因的prs425k質粒，經(jīng)過搖瓶發(fā)酵和hplc檢測，確定合成8-二甲基異戊烯基柚皮素最優(yōu)的菌株。其中，5種不同來源的chs的基因來源包括擬南芥(arabidopsisthaliana)、葡萄(vitisvinifera)、虎杖(polygonumcuspidatum)、海洋細菌(rhodopirellulabaltica)、大豆(glycinemax)，依次簡寫為sc_chs1、sc_chs2、sc_chs3、sc_chs4、sc_chs7。6種不同來源的chi基因包括大豆1(glycinemax)、大豆2(glycinemax)、蜜柑(citrusunshiu)、擬南芥(arabidopsisthaliana)、玉米(zeamays)、花生(arachishypogaea)等，依次簡寫為sc_chi1、sc_chi2、sc_chi4、sc_chi5、sc_chi6、sc_chi7。所述tal基因為圓紅冬孢酵母來源tal基因序列。所述4cl基因為歐芹來源tal基因序列。本發(fā)明所述重組釀酒酵母菌株中所述優(yōu)化具體包含釀酒酵母密碼子優(yōu)化、規(guī)避bsai限制性內切酶酶切位點和在基因兩端額外添加核苷酸序列。其中，在一些實施方案中，所述基因5’端額外添加的核苷酸序列如seqidno:15所示(gcggccgcggtctcca)；3’端額外添加的核苷酸序列如seqidno:16所示(taaaggagaccgcggccgc)。本發(fā)明篩選獲得一種重組釀酒酵母菌株，包含經(jīng)優(yōu)化的tal基因、4cl基因、chs基因、chi基因和n8dt基因，所述tal基因為圓紅冬孢酵母來源tal基因序列；所述4cl基因為歐芹來源tal基因序列；所述chs基因為擬南芥來源chs基因序列；所述chi基因為蜜柑來源chi基因序列；所述n8dt基因為苦參來源n8dt基因序列。在一些實施方案中，所述重組釀酒酵母菌株中，所述tal基因的核苷酸序列如seqidno:1所示；所述4cl基因的核苷酸序列如seqidno:2所示；所述chs基因的核苷酸序列如seqidno:3所示；所述chi基因的核苷酸序列如seqidno:10所示；所述n8dt基因的核苷酸序列如seqidno:14所示，該菌株命名為sybe_sc02050032。本發(fā)明還提供了所述重組釀酒酵母菌株的構建方法，將經(jīng)優(yōu)化的tal基因、4cl基因、chs基因、chi基因和n8dt基因整合到釀酒酵母底盤菌株基因組中。在一些實施方案中，所述構建方法中所述釀酒酵母底盤菌優(yōu)選為釀酒酵母cenpk2-1d。在一些實施方案中，所述構建方法具體包含如下步驟：步驟1、用酶切連接的方法將經(jīng)優(yōu)化的外源tal、4cl、chs和chi基因分別構建到prs415k-gpm1t-pgk1p-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-pgk1t和prs414-pgk1t-hxt7p-cyc1t質粒中，采用醋酸鋰法將上述質粒轉化釀酒酵母底盤菌中，sc-leu,ura,his,trp固體培養(yǎng)基篩選轉化子；步驟2、將經(jīng)釀酒酵母密碼子優(yōu)化的外源n8dt基因與prs425k-eno2t-pdc2p-gpm2t質粒連接，采用醋酸鋰法轉化到步驟2篩選得到的轉化子菌株中采用sc-leu固體平板培養(yǎng)基篩選轉化子。利用本發(fā)明所述重組釀酒酵母菌株生產(chǎn)8-二甲基異戊烯基柚皮素，相對于植物提取和化學合成成本低、副產(chǎn)物少且污染小，為8二甲基異戊烯基柚皮素及其相關產(chǎn)物的生產(chǎn)提供了一種切實可行的方法，并為淫羊藿素，淫羊藿苷的生物合成打下基礎。因此本發(fā)明提供了所述重組釀酒酵母菌株在生產(chǎn)8-二甲基異戊烯基柚皮素中的應用。進一步本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)8-二甲基異戊烯基柚皮素的方法，將所述的重組釀酒酵母菌株接入種子培養(yǎng)基活化；將活化后的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)后收集菌體細胞提取8-二甲基異戊烯基柚皮素。在一些實施方案中，所述方法具體為將所述的重組釀酒酵母菌株接入種子培養(yǎng)基在30℃、250rpm活化24h，轉接至新鮮的種子培養(yǎng)基，在30℃、250rpm活化18h，轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基30℃、250rpm發(fā)酵96h，收集菌體提取8-二甲基異戊烯基柚皮素。其中，所述種子培養(yǎng)基為22g/l葡萄糖、6.7g/lynb、2g/l缺異亮氨酸的混合氨基酸粉末，余量為水；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為20g/l葡萄糖、6.7g/lynb、2g/l缺異亮氨酸的混合氨基酸粉末、0.5g/l酪氨酸，余量為水。為了進一步理解本發(fā)明，下面將結合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。如無特殊說明，本發(fā)明實施例中所涉及的試劑均為市售產(chǎn)品，均可以通過商業(yè)渠道購買獲得。在本發(fā)明中所涉及的一些質粒載體、菌株均可由市場購得，prs415k-gpm1t-pgk1p-gpd1t、prs423-gpd1t-pgi1p-fba1t、prs416-fba1t-tpi1p-pgk1t、prs414-pgk1t-hxt7p-cyc1t和prs425k-eno2t-pdc2p-gpm2t質粒保存于天津大學元英進實驗室，可在http://synbioml.org/免費獲取。cenpk2-1d底盤菌株保存于天津大學合成生物學元英進課題組(孫明雪.代謝工程改造釀酒酵母生產(chǎn)(s)-芳樟醇[d].江南大學,2013)。實施例1、生產(chǎn)柚皮素的重組釀酒酵母菌株的構建1、外源功能基因元件的獲得外源基因為用于合成柚皮素的關鍵酶tal，4cl，chs和chi基因：tal基因來源為圓紅冬孢酵母(r.toruloides)，簡稱為sc_tal。4cl基因來源為歐芹(petroselinumcrispum)，簡稱為sc_4cl。chs的基因來源包括擬南芥(arabidopsisthaliana)、葡萄(vitisvinifera)、虎杖(polygonumcuspidatum)、海洋細菌(rhodopirellulabaltica)、大豆(glycinemax)等，依次簡寫為sc_chs1、sc_chs2、sc_chs3、sc_chs4、sc_chs7，chi的基因來源包括大豆1(glycinemax)、大豆2(glycinemax)、蜜柑(citrusunshiu)、擬南芥(arabidopsisthaliana)、玉米(zeamays)、花生(arachishypogaea)等，依次簡寫為sc_chi1、sc_chi2、sc_chi4、sc_chi5、sc_chi6、sc_chi7。具體基因序列見表1。上述基因均為經(jīng)過釀酒酵母密碼子優(yōu)化并適當規(guī)避bsai限制性內切酶酶切位點，在基因兩端額外添加5’端gcggccgcggtctcca；3’taaaggagaccgcggccgc通過人工合成得到。表1基因序列基因名稱和來源編碼序列圓紅冬孢酵母(r.toruloides)來源tal基因序列(sc_tal)seqidno:1歐芹(petroselinumcrispum)來源4cl基因序列(sc_4cl)seqidno:2擬南芥(arabidopsisthaliana)來源chs基因序列(sc_chs1)seqidno:3葡萄(vitisvinifera)來源chs基因序列(sc_chs2)seqidno:4虎杖(polygonumcuspidatum)來源chs基因序列(sc_chs3)seqidno:5海洋細菌(rhodopirellulabaltica)來源chs基因序列(sc_chs4)seqidno:6大豆(glycinemax)來源chs基因序列(sc_chs7)seqidno:7大豆1(glycinemax)來源chi基因序列(sc_chi1)seqidno:8大豆2(glycinemax)來源chi基因序列(sc_chi2)seqidno:9蜜柑(citrusunshiu)來源chi基因序列(sc_chi4)seqidno:10擬南芥(arabidopsisthaliana)來源chi基因序列(sc_chi5)seqidno:11玉米(zeamays)來源chi基因序列(sc_chi6)seqidno:12花生(arachishypogaea)來源chi基因序列(sc_chi7)seqidno:132、構建生產(chǎn)柚皮素的重組釀酒酵母菌株首先，將實驗室模塊庫中prs415k-gpm1t-pgk1p-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-pgk1t和prs414-pgk1t-hxt7p-cyc1t質粒(可在http://synbioml.org/免費獲取)及獲得的外源tal、4cl、chs和chi基因用酶切連接的方法進行構建，獲得了圓紅冬孢酵母(r.toruloides)來源tal的prs415k-gpm1t-pgk1p-gpd1t質粒，歐芹(petroselinumcrispum)來源4cl的prs423-gpd1t-pgi1p-fba1t，5種來源chs的prs416-fba1t-tpi1p-pgk1t和6種來源的prs414-pgk1t-hxt7p-cyc1t釀酒酵母重組游離型多拷貝質粒，采用醋酸鋰法將這四種質粒同時轉化到cenpk2-1d底盤菌株中(其中后兩種質粒交叉組合，共30種)，用sc-leu,ura,his,trp的固體平板(合成酵母氮源ynb6.7g/l，葡萄糖22g/l，2g/l缺異亮氨酸、組氨酸、色氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末，2％的瓊脂粉)進行篩選，得到的轉化子進行劃線分純培養(yǎng)后進行菌落pcr驗證，對驗證正確的重組菌株保存甘油菌并分別命名為sybe_sc02050001-sybe_sc02050030。其中，各菌株所含質粒如下：sybe_sc02050001：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs1-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi1-cyc1t；sybe_sc02050002：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs1-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi2-cyc1t；sybe_sc02050003：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs1-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi4-cyc1t；sybe_sc02050004：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs1-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi5-cyc1t；sybe_sc02050005：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs1-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi6-cyc1t；sybe_sc00080006：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs1-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi7-cyc1tsybe_sc02050007：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs2-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi1-cyc1t；sybe_sc02050008：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs2-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi2-cyc1t；sybe_sc02050009：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs2-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi4-cyc1t；sybe_sc02050010：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs2-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi5-cyc1t；sybe_sc02050011：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs2-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi6-cyc1t；sybe_sc02050012：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs2-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi7-cyc1t；sybe_sc02050013：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs3-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi1-cyc1t；sybe_sc02050014：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs3-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi2-cyc1t；sybe_sc02050015：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs3-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi4-cyc1t；sybe_sc02050016：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs3-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi5-cyc1t；sybe_sc02050017：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs3-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi6-cyc1t；sybe_sc02050018：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs3-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi7-cyc1t；sybe_sc02050019：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs4-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi1-cyc1t；sybe_sc02050020：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs4-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi2-cyc1t；sybe_sc02050021：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs4-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi4-cyc1t；sybe_sc02050022：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs4-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi5-cyc1t；sybe_sc02050023：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs4-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi6-cyc1t；sybe_sc02050024：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs4-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi7-cyc1t；sybe_sc02050025：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs7-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi1-cyc1t；sybe_sc02050026：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs7-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi2-cyc1t；sybe_sc02050027：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs7-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi4-cyc1t；sybe_sc02050028：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs7-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi5-cyc1t；sybe_sc02050029：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs7-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi6-cyc1t；sybe_sc02050030：prs415k-gpm1t-pgk1p-sc_tal-gpd1t，prs423-gpd1t-pgi1p-sc_4cl-fba1t，prs416-fba1t-tpi1p-sc_chs7-pgk1t，prs414-pgk1t-hxt7p-sc_chi7-cyc1t。3、比較菌株sybe_sc02050001-sybe_sc02050030的柚皮素搖瓶產(chǎn)量試驗材料：菌株sybe_sc02050001-sybe_sc02050030試驗方法：一級、二級種子培養(yǎng)基：20g/l葡萄糖、6.7g/lynb(yeastnitrogenbase)、2g/l缺異亮氨酸、組氨酸、色氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末。發(fā)酵培養(yǎng)基：20g/l葡萄糖、6.7g/lynb(yeastnitrogenbase)、2g/l缺異亮氨酸、組氨酸、色氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末、0.5g/l酪氨酸。將上述菌株sybe_sc02050001-sybe_sc02050030接種于2ml一級種子培養(yǎng)基中，在30℃、250rpm培養(yǎng)24h，以初始菌體濃度od600＝0.2分別接種于二級種子培養(yǎng)基中，在30℃、250rpm培養(yǎng)12h，再以初始菌體濃度od600＝0.2分別接種于50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、250rpm條件下培養(yǎng)，監(jiān)測發(fā)酵過程中的菌體密度(od600)，發(fā)酵96小時結束，取600μl菌液提取柚皮素。柚皮素提取方法：取600μl發(fā)酵液，加入等體積的乙酸乙酯和石英砂，置于渦旋振蕩器上5000rpm震蕩30min后，以10000rpm的速度離心10min，用槍頭吸出上清液放置在干凈的ep管中，重復3次。將收集好的上清液進行氮吹蒸發(fā)，大約20min后確認無液體殘留停止，獲得淺黃色固體。加入600μl色譜甲醇溶解，用2μm有機濾膜過濾后使用高效液相色譜(hplc)檢測柚皮素含量，流動相為甲醇和0.1％甲酸，比例隨時間梯度變化，流速為0.2ml/min，檢測波長290/310nm，柱溫30℃，進樣量10μl，結果見表2和圖3。表2高效液相色譜(hplc)檢測柚皮素搖瓶產(chǎn)量結果由表2及圖3菌株sybe_sc02050001-sybe_sc02050030的柚皮素產(chǎn)量來看，發(fā)酵96小時，sybe_sc02050003的產(chǎn)量最高，達到24.66mg/l。由此可知，擬南芥(arabidopsisthaliana)來源chs基因sc_chs1和蜜柑(citrusunshiu)來源chi基因序列sc_chi4對于重組釀酒酵母生產(chǎn)柚皮素有積極意義。4、將高產(chǎn)柚皮素菌株sybe_sc02050003中的模塊進行酵母組裝通過比較柚皮素產(chǎn)量，選擇最高產(chǎn)的釀酒酵母菌株sybe_sc02050003的基因組合tal，4cl，chs1，chi4，分別將連接4個基因的模塊質粒提取出來，用noti內切酶進行酶切后得到的4個片段進行酵母組裝，用ypd的固體平板(蛋白胨20g/l，葡萄糖22g/l，10g/l酵母粉，2％的瓊脂粉)進行篩選，得到的轉化子進行劃線分純培養(yǎng)后進行菌落pcr驗證，對驗證正確的重組菌株保存甘油菌并分別命名為sybe_sc02050031。實施例2、外源基因n8dt在重組釀酒酵母中表達合成8-二甲基異戊烯基柚皮素1、外源功能基因元件n8dt的獲得外源基因為用于8-二甲基異戊烯基柚皮素的關鍵酶n8dt：選取的是來自苦參(sophoraflavescens)體內的柚皮素異戊烯基轉移酶(n8dt)，具體基因序列如seqidno:14所示。上述基因為經(jīng)過釀酒酵母密碼子優(yōu)化通過人工合成得到。2、構建生產(chǎn)8-異戊烯基柚皮素的重組釀酒酵母菌株將獲得的外源n8dt基因經(jīng)bsai酶切后利用t4連接酶連接到模塊庫prs425k-eno2t-pdc2p-gpm2t質粒(可在http://synbioml.org/免費獲取)上，采用醋酸鋰法將重組質粒轉化到sybe_sc02050031底盤菌株中，采用sc-leu固體平板(合成酵母氮源ynb6.7g/l，葡萄糖22g/l，缺異亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/l，2％的瓊脂粉)進行篩選，得到的轉化子進行劃線分純培養(yǎng)后提取質粒進行pcr驗證，對驗證正確的重組菌株保存甘油菌并分別命名為sybe_sc02050032。3、測定菌株sybe_sc02050032的8-二甲基異戊烯基柚皮素產(chǎn)量試驗材料：菌株sybe_sc02050032試驗方法：一級、二級種子培養(yǎng)基：22g/l葡萄糖、6.7g/lynb(yeastnitrogenbase)、2g/l缺異亮氨酸的混合氨基酸粉末；發(fā)酵培養(yǎng)基：20g/l葡萄糖、6.7g/lynb(yeastnitrogenbase)、2g/l缺異亮氨酸的混合氨基酸粉末、0.5g/l酪氨酸。將上述菌株sybe_sc02050032接種于5ml一級種子培養(yǎng)基中，在30℃、250rpm培養(yǎng)24h，以初始菌體濃度od600＝0.2分別接種于二級種子培養(yǎng)基中，在30℃、250rpm培養(yǎng)18h，再以初始菌體濃度od600＝0.2分別接種于50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、250rpm條件下培養(yǎng)，監(jiān)測發(fā)酵過程中的菌體密度(od600)，發(fā)酵96小時結束，取600μl菌液提取8二甲基異戊烯基柚皮素。8-二甲基異戊烯基柚皮素提取與測量方法和柚皮素相同，按照實施例1的提取并測量。試驗結果：由圖5的8dn產(chǎn)量來看，發(fā)酵96小時，在導入n8dt基因的菌株sybe_sc02050032能夠實現(xiàn)由酪氨酸合成8二甲基異戊烯基柚皮素，產(chǎn)量為36.7μg/l。sequencelisting<110>天津大學<120>一種重組釀酒酵母及其構建方法與應用<130>mp1702515<160>16<170>patentinversion3.3<210>1<211>2189<212>dna<213>圓紅冬孢酵母<400>1gcggccgcggtctccaaaaatggctccatcattggattctatttctcactctttcgcaaa60cggtgtcgcttctgctaagcaagctgtcaatggtgcatctactaacttggcagtcgctgg120atctcatttgccaacaactcaagttacacaagttgatattgttgagaagatgttagcagc180tccaactgattcaacattggaattagatggttactctttgaacttgggtgatgtcgtctc240tgcagctagaaagggtaggccagtcagagtcaaggattctgatgagataagatctaaaat300tgacaagtctgttgaatttttgagatcacaattatctatgtcagtctacggtgttactac360tggtttcggtggttctgcagacacaaggacagaagatgctatttctttacaaaaagcttt420gttggagcatcagttgtgtggtgtcttgccatcttcatttgactcattcaggttgggtag480aggtttggaaaactctttgccattggaggtcgtcaggggtgctatgacaattagggttaa540ctctttgactagaggtcactcagctgtcaggttggttgtcttggaggcattgactaattt600tttgaaccatggtattacacctattgtccctttaagaggtactatttctgcatctggtga660tttgtctccattgtcttacattgcagctgctatatcaggtcaccctgactctaaggtcca720cgtcgtccatgaaggtaaggaaaaaattttgtatgcaagagaagcaatggctttgttcaa780cttggagccagtcgtcttgggtcctaaggagggtttgggtttggtcaacggtacagctgt840ctctgcttcaatggctacattagcattgcacgatgctcatatgttatctttgttatctca900atctttgacagctatgacagtcgaagctatggtcggtcacgctggttcttttcatccttt960cttgcatgatgttacaagaccacatccaacacaaattgaagttgcaggtaatattagaaa1020attattagagggttctagattcgcagttcaccatgaggaagaagttaaagtcaaggatga1080tgagggtatattgaggcaggacaggtacccattaaggacatctccacagtggttgggtcc1140attggtttcagatttaattcatgctcatgctgttttaactatagaagctggtcaatctac1200aacagataacccattgattgatgttgagaacaaaacttctcaccatggtggtaacttcca1260ggcagcagcagttgctaatactatggaaaaaacaagattaggtttggctcaaataggtaa1320gttgaacttcactcaattgacagaaatgttgaacgctggtatgaatagaggattgccttc1380atgcttggctgctgaggacccatcattgtcttatcattgcaaaggtttagacattgctgc1440tgctgcatacacatctgagttgggacacttggcaaacccagtcactactcacgtccaacc1500agctgagatggctaaccaggctgtcaactctttggcattaatatctgctagaagaactac1560tgagtctaatgatgtcttatctttgttattagcaacacatttgtattgcgtcttacaagc1620tattgatttgagagcaattgaatttgaatttaagaaacagtttggtccagcaattgtttc1680attgattgaccaacattttggttcagctatgactggttctaacttgagagacgagttggt1740tgaaaaggttaacaaaacattagcaaagagattggaacaaactaactcttacgatttggt1800ccctaggtggcacgacgctttctcatttgctgcaggtacagtcgtcgaggttttgtcatc1860aacatctttgtctttggctgcagttaatgcttggaaggtcgcagctgctgagtctgctat1920ttcattgacaagacaagtcagggagactttctggtcagcagcttctacatcttctccagc1980tttgtcttatttgtctccaagaacacaaattttgtacgctttcgtcagggaagaattggg2040tgtcaaagctagaaggggtgacgtcttcttgggtaaacaagaggttactattggttctaa2100cgtttctaaaatttatgaagctattaaatctggtagaattaacaatgtcttgttaaaaat2160gttggcttaaaaatggagaccgcggccgc2189<210>2<211>1749<212>dna<213>歐芹<400>2gcggccgcggtctccaaagaaagcatagcaatctaatctaagttttaattacaaaatggg60tgactgtgtcgcaccaaaggaagacttgatttttagatctaagttaccagacatttatat120tccaaaacatttgccattacatacttattgttttgaaaatatttctaaagtcggagacaa180atcttgcttaattaatggagcaacaggtgagacttttacttattcacaagtcgaattgtt240atctagaaaagtcgcttcaggtttaaataaattaggtattcaacaaggtgatactattat300gttgttgttaccaaactctcctgagtacttcttcgctttcttgggtgcttcttacagggg360agctatttctactatggctaacccattttttacttctgctgaagttattaaacaattgaa420agcttctcaagctaagttgattattactcaggcttgctatgttgataaagttaaggacta480cgctgctgagaagaacattcagattatttgcattgatgatgctccacaagattgcttgca540tttttctaaattaatggaagctgacgaatctgagatgccagaagtcgttattaattctga600tgatgttgtcgctttgccatactcttcaggtacaacaggtttgccaaaaggtgttatgtt660gactcataagggattggtcacatcagttgctcaacaagttgatggtgataatccaaattt720atacatgcattctgaagacgttatgatttgtatattgccattgttccatatttattcttt780gaatgctgtcttgtgctgtggtttaagggctggtgtcacaattttaattatgcaaaaatt840tgatattgttccatttttagaattaattcaaaagtacaaggtcactattggtccatttgt900tccacctattgttttagcaattgcaaa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