本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，更具體的說(shuō)，涉及一種高濃度丁酸梭菌的發(fā)酵方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腸道微生物群已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)、生產(chǎn)應(yīng)用關(guān)注的重點(diǎn)，作為調(diào)節(jié)腸道微生物群平衡、替代抗生素使用的微生態(tài)制劑在動(dòng)物腸道健康中應(yīng)用越來(lái)越受到全社會(huì)的關(guān)注。但受制于微生物研究方法和生產(chǎn)技術(shù)，行業(yè)內(nèi)主要以生產(chǎn)好氧菌和兼性厭氧菌為主流。動(dòng)物腸道微生物群99％以上是嚴(yán)格厭氧菌，而且通過(guò)腸道宏基因組研究發(fā)現(xiàn)其中厭氧菌中又以共生梭菌為主。所以未來(lái)動(dòng)物微生態(tài)制劑的研發(fā)方向和趨勢(shì)是厭氧菌的菌種篩選、產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵系統(tǒng)創(chuàng)建、穩(wěn)定型產(chǎn)品開發(fā)等。丁酸梭菌屬于產(chǎn)芽孢的、腸道嚴(yán)格厭氧的共生梭菌群的一員，是近年來(lái)厭氧型微生態(tài)制劑的研發(fā)重點(diǎn)，但受制于厭氧發(fā)酵技術(shù)和產(chǎn)品穩(wěn)定性，丁酸梭菌行業(yè)整體發(fā)酵生產(chǎn)水平不高，且芽孢率低，不能形成有競(jìng)爭(zhēng)力的商品化產(chǎn)品。
丁酸是一種重要的化工原料，在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、能源工業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。丁酸主要有兩種生產(chǎn)方式：化工合成法和生物發(fā)酵法?；ず铣煞ǔ杀緝?yōu)勢(shì)較大，但受制于石油工業(yè)原料，且環(huán)保問(wèn)題嚴(yán)重。生物發(fā)酵法存在產(chǎn)物濃度低，后處理量大等問(wèn)題，但其生產(chǎn)條件溫和，能耗低，污染小，而且原料來(lái)源廣泛，適于生產(chǎn)高級(jí)別丁酸產(chǎn)品(食品和醫(yī)藥級(jí)丁酸)的要求。丁酸梭菌作為發(fā)酵法生產(chǎn)丁酸的主要菌種之一，其核心代謝產(chǎn)物就是丁酸，從其發(fā)酵液中提取丁酸是獲取丁酸的一種可行有效的方式。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一在于：提供一種高濃度丁酸梭菌的發(fā)酵方法，解決現(xiàn)有工藝中菌體濃度不高、代謝產(chǎn)物丁酸的合成量低問(wèn)題。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之二在于：提供一種高濃度丁酸梭菌的發(fā)酵方法的應(yīng)用，解決現(xiàn)有工藝過(guò)程中，微生態(tài)制劑廠商只獲取丁酸梭菌菌體，化工能源生產(chǎn)只獲取發(fā)酵產(chǎn)物丁酸，不能充分發(fā)揮發(fā)酵產(chǎn)物的價(jià)值。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的方案在于：提供一種高濃度丁酸梭菌的發(fā)酵方法，包括如下步驟：
s100、接種發(fā)酵：將丁酸梭菌種子液按照體積分?jǐn)?shù)(v/v)5～10％接種至丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基，ph6.0～6.5、溫度35～38℃下培養(yǎng)10～20h，使得丁酸梭菌快速適應(yīng)期，進(jìn)入對(duì)數(shù)分裂期。
s200、補(bǔ)料發(fā)酵：流加混合碳源，補(bǔ)料發(fā)酵20～40小時(shí)；混合碳源包括60～100g/l糖、100～140g/l乙酸鈉；糖為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖中的至少一種，也可以使用淀粉水解液、糖蜜等替代；乙酸鈉的乙酸體作為丁酸發(fā)酵過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵物，參與丁酸發(fā)酵反應(yīng)的最后過(guò)程—丁酰coa形成丁酸，同時(shí)該過(guò)程中乙酸形成乙酰coa，補(bǔ)充丁酸發(fā)酵過(guò)程中高效碳源，可提高發(fā)酵產(chǎn)物積累效率。而且丁酸梭菌發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生少量乙酸，外源可控添加乙酸鈉，將反饋抑制乙酸產(chǎn)生，有利于提高發(fā)酵終產(chǎn)物丁酸純化和純度。補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)束時(shí)，丁酸梭菌含量高達(dá)10～20億cfu/ml，丁酸含量可到25～30g/l。
s300、孢子化發(fā)酵：補(bǔ)料發(fā)酵完成后，補(bǔ)加含鈣、鎂、錳的復(fù)合液，孢子化發(fā)酵10～30小時(shí)，使丁酸梭菌孢子化。鈣、鎂、錳鹽復(fù)合液的補(bǔ)加量和補(bǔ)加速度可根據(jù)發(fā)酵液體積作相應(yīng)調(diào)整，例如，1000l的發(fā)酵罐中，含鈣、鎂、錳的復(fù)合液濃度優(yōu)選為20～30g/l，流加速度5～15l/h，總量10～30l。丁酸梭菌在含鈣、鎂、錳的復(fù)合液作用下迅速孢子化，孢子化率高達(dá)90％，孢子化后的丁酸梭菌抗逆性大幅增強(qiáng)，不會(huì)因干燥、高溫等而失活，便于制備微生物制劑。
在本發(fā)明提供的高濃度丁酸梭菌的發(fā)酵方法中，步驟s100之前還包括：
s001、一級(jí)種子制備：配制種子培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至室溫，將丁酸桿 菌菌種管按照體積分?jǐn)?shù)0.1～1％接種至種子培養(yǎng)基中，35～38℃下培養(yǎng)20～30h，制得一級(jí)種子液；
s002、二級(jí)種子制備：配制種子培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至室溫，將一級(jí)種子液按照體積分?jǐn)?shù)0.2～2％接種至種子培養(yǎng)基中，35～38℃下培養(yǎng)10～20h制得二級(jí)種子液；
s003、發(fā)酵培養(yǎng)基配制：配制發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至室溫。
在本發(fā)明提供的高濃度丁酸梭菌的發(fā)酵方法中，1l種子培養(yǎng)基包括酵母浸膏3g、牛肉浸膏10g、胰蛋白胨10g、葡萄糖5g、可溶性淀粉1g、氯化鈉5g、三水合乙酸鈉3g、半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，余量為水；ph7.0～7.2；
1000l發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖20kg，玉米粉3.3kg，豆粕粉40kg，硫酸銨1kg，蛋白胨4.5kg，酵母膏1.8kg，小蘇打1.2kg，磷酸二氫鉀1.8kg，碳酸鈣1.8kg，硫酸鎂0.63kg，硫酸錳0.18kg，消泡劑1l，余量為水；ph7.0～7.5。
在本發(fā)明提供的高濃度丁酸梭菌的發(fā)酵方法中，步驟s200中：采用連續(xù)或者分階段的方式流加混合碳源，流加的混合碳源總量占發(fā)酵液的體積分?jǐn)?shù)為0.5～5％。
在本發(fā)明提供的高濃度丁酸梭菌的發(fā)酵方法中，步驟s300中：采用連續(xù)或者分階段的方式補(bǔ)加含鈣、鎂、錳的復(fù)合液，含鈣、鎂、錳的復(fù)合液包括包括ca2+、mg2+、mn2+。例如，使用氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳配制所述含鈣、鎂、錳的復(fù)合液，ca2+、mg2+、mn2+的濃度大于0.01mol/l。
在本發(fā)明提供的高濃度丁酸梭菌的發(fā)酵方法中，步驟s300之后還包括：
s400、孢子分離：菌液分離后收集菌體孢子，干燥制成原粉級(jí)丁酸梭菌；
s500、丁酸提取：菌液分離后的發(fā)酵清液，萃取丁酸。
在本發(fā)明提供的高濃度丁酸梭菌的發(fā)酵方法中，步驟s400中，使用噴霧干燥塔干燥菌體孢子，噴霧干燥塔的干燥參數(shù)：進(jìn)風(fēng)溫度140～200℃，出風(fēng)溫度60～80℃。菌體孢子噴霧干燥后，可制成50億/克原粉級(jí)丁酸梭菌。
在本發(fā)明提供的高濃度丁酸梭菌的發(fā)酵方法中，步驟s500具體包括：
s501、調(diào)節(jié)發(fā)酵清液的ph至3.0；也可以事先離心或膜過(guò)濾發(fā)酵清液， 再用鹽酸等常規(guī)無(wú)機(jī)酸調(diào)節(jié)ph；
s502、磷酸三丁酯與n235按體積比70～100:0～30混合制成萃取劑；磺化煤油與大豆油按體積比0～50:50～100混合制成稀釋劑；其中，n235的學(xué)名三(辛-癸)烷基叔胺；
s503、萃取劑與稀釋劑按體積比20～50:50～80混合制成萃取液，萃取液與發(fā)酵清液混合后分離出有機(jī)相，例如，萃取液與發(fā)酵液等比例混合于反應(yīng)釜中，恒溫25℃、100rpm攪拌20分鐘，靜置待兩相平衡，可快速實(shí)現(xiàn)；使用碳酸鈉水溶液反萃取有機(jī)相，攪拌后靜置，待兩相平衡后分離出水相，得到高濃度丁酸，例如，有機(jī)相與1m碳酸鈉等比例混合反萃取，恒溫25℃、100rpm攪拌20分鐘，丁酸收率可到85％。若要高純度回收，可進(jìn)行多次萃取-反萃取工藝，丁酸總收率可達(dá)95％。
本發(fā)明還提供上述任意一種高濃度丁酸梭菌的發(fā)酵方法，在丁酸制備和/或丁酸梭菌制備過(guò)程中的應(yīng)用。
實(shí)施本發(fā)明，具有如下有益效果：建立了高濃度丁酸梭菌發(fā)酵方法及其孢子化工藝技術(shù)，在發(fā)酵過(guò)程中大幅提高丁酸梭菌菌體濃度的同時(shí)，促進(jìn)代謝產(chǎn)物丁酸的合成。孢子化的丁酸梭菌，經(jīng)過(guò)收集、干燥制成原粉級(jí)微生態(tài)制劑；發(fā)酵液經(jīng)過(guò)特定條件下的萃取系統(tǒng)萃取后，實(shí)現(xiàn)丁酸的高純度回收。同時(shí)生產(chǎn)出了高性價(jià)比的丁酸梭菌和丁酸，工業(yè)化優(yōu)勢(shì)進(jìn)一步提升，效益提升的同時(shí)也實(shí)現(xiàn)和滿足了環(huán)保要求。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。
實(shí)施例1
1)、生物發(fā)酵高濃度丁酸梭菌
1.1一級(jí)種子制備：配制種子培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至室溫，將丁酸桿菌菌種管按照體積分?jǐn)?shù)(v/v)0.1％接種至種子培養(yǎng)基中，35℃下培養(yǎng)30h，制得一級(jí)種子液；
1.2二級(jí)種子制備：配制種子培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至室溫，將一級(jí)種子液按照體積分?jǐn)?shù)(v/v)0.2％接種至種子培養(yǎng)基中，35℃下培養(yǎng)20h制得二級(jí)種子液；
1.3發(fā)酵培養(yǎng)基配制：配制發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至室溫；
1.4接種發(fā)酵：將丁酸梭菌種子液按照體積分?jǐn)?shù)(v/v)5％接種至丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基，ph6.0、溫度35℃下培養(yǎng)20h；
1.5補(bǔ)料發(fā)酵：流加混合碳源，補(bǔ)料發(fā)酵40小時(shí)；混合碳源包括100g/l糖、140g/l乙酸鈉；采用連續(xù)的方式流加混合碳源，流加的混合碳源總量占發(fā)酵液的體積分?jǐn)?shù)(v/v)為5％。
2)、丁酸梭菌孢子化發(fā)酵
補(bǔ)料發(fā)酵完成后，采用連續(xù)的方式補(bǔ)加含鈣、鎂、錳的復(fù)合液，孢子化發(fā)酵10小時(shí)，使丁酸梭菌孢子化。
3)、微生態(tài)制劑的制備
菌液分離后收集菌體孢子，使用噴霧干燥塔干燥菌體孢子，噴霧干燥塔的干燥參數(shù)：進(jìn)風(fēng)溫度140℃，出風(fēng)溫度60℃；菌體孢子噴霧干燥制成50億/克原粉級(jí)丁酸梭菌。
4)、丁酸萃取
4.1菌液分離后的發(fā)酵清液，離心或膜過(guò)濾去雜，調(diào)節(jié)發(fā)酵清液的ph至3.0；
4.2磷酸三丁酯作為萃取劑；磺化煤油與大豆油按體積比50:50混合制成稀釋劑；
4.3萃取劑與稀釋劑按體積比20:80混合制成萃取液，萃取液與發(fā)酵清液混合后分離出有機(jī)相；使用碳酸鈉水溶液反萃取有機(jī)相，攪拌20min后靜置待兩相平衡后分離出水相，得到高濃度丁酸。
實(shí)施例2
1)、生物發(fā)酵高濃度丁酸梭菌
1.1一級(jí)種子制備：配制種子培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至室溫，將丁酸桿菌菌 種管按照體積分?jǐn)?shù)(v/v)1％接種至種子培養(yǎng)基中，38℃下培養(yǎng)20h，制得一級(jí)種子液；
1.2二級(jí)種子制備：配制種子培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至室溫，將一級(jí)種子液按照體積分?jǐn)?shù)(v/v)2％接種至種子培養(yǎng)基中，38℃下培養(yǎng)10h制得二級(jí)種子液；
1.3發(fā)酵培養(yǎng)基配制：配制發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至室溫；
1.4接種發(fā)酵：將丁酸梭菌種子液按照體積分?jǐn)?shù)(v/v)10％接種至丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基，ph6.5、溫度38℃下培養(yǎng)10h；
1.5補(bǔ)料發(fā)酵：流加混合碳源，補(bǔ)料發(fā)酵20小時(shí)；混合碳源包括60g/l糖、100g/l乙酸鈉；采用分階段的方式流加混合碳源，流加的混合碳源總量占發(fā)酵液的體積分?jǐn)?shù)(v/v)為0.5％。
2)、丁酸梭菌孢子化發(fā)酵
補(bǔ)料發(fā)酵完成后，采用分階段的方式補(bǔ)加含鈣、鎂、錳的復(fù)合液，孢子化發(fā)酵30小時(shí)，使丁酸梭菌孢子化。
3)、微生態(tài)制劑的制備
菌液分離后收集菌體孢子，使用噴霧干燥塔干燥菌體孢子，噴霧干燥塔的干燥參數(shù)：進(jìn)風(fēng)溫度200℃，出風(fēng)溫度80℃；菌體孢子噴霧干燥制成50億/克原粉級(jí)丁酸梭菌；
4)、丁酸萃取
4.1菌液分離后的發(fā)酵清液，離心或膜過(guò)濾去雜，調(diào)節(jié)發(fā)酵清液的ph至3.0；
4.2磷酸三丁酯與n235按體積比70:30混合制成萃取劑；大豆油按作為稀釋劑；
4.3萃取劑與稀釋劑按體積比50:50混合制成萃取液，萃取液與發(fā)酵清液混合后分離出有機(jī)相；使用碳酸鈉水溶液反萃取有機(jī)相，攪拌20min后靜置待兩相平衡后分離出水相，得到高濃度丁酸。
實(shí)施例3
1)、生物發(fā)酵高濃度丁酸梭菌
1.1一級(jí)種子制備：配制種子培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至室溫，將丁酸桿菌菌種管按照體積分?jǐn)?shù)(v/v)0.6％接種至種子培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)25h，制得一級(jí)種子液；
1.2二級(jí)種子制備：配制種子培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至室溫，將一級(jí)種子液按照體積分?jǐn)?shù)(v/v)1％接種至種子培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)15h制得二級(jí)種子液；
1.3發(fā)酵培養(yǎng)基配制：配制發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至室溫；
1.4接種發(fā)酵：將丁酸梭菌種子液按照體積分?jǐn)?shù)(v/v)8％接種至丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基，ph6.3、溫度37℃下培養(yǎng)15h；
1.5補(bǔ)料發(fā)酵：流加混合碳源，補(bǔ)料發(fā)酵30小時(shí)；混合碳源包括80g/l糖、120g/l乙酸鈉；采用連續(xù)的方式流加混合碳源，流加的混合碳源總量占發(fā)酵液的體積分?jǐn)?shù)(v/v)為3％。
2)、丁酸梭菌孢子化發(fā)酵
補(bǔ)料發(fā)酵完成后，采用連續(xù)的方式補(bǔ)加含鈣、鎂、錳的復(fù)合液，孢子化發(fā)酵10～30小時(shí)，使丁酸梭菌孢子化。
3)、微生態(tài)制劑的制備
3.1孢子分離：菌液分離后收集菌體孢子，使用噴霧干燥塔干燥菌體孢子，噴霧干燥塔的干燥參數(shù)：進(jìn)風(fēng)溫度160℃，出風(fēng)溫度70℃；菌體孢子噴霧干燥制成50億/克原粉級(jí)丁酸梭菌；
4)、丁酸萃取
4.1菌液分離后的發(fā)酵清液，離心或膜過(guò)濾去雜，調(diào)節(jié)發(fā)酵清液的ph至3.0；
4.2磷酸三丁酯與n235按體積比85:15混合制成萃取劑；磺化煤油與大豆油按體積比20:80混合制成稀釋劑；
4.3萃取劑與稀釋劑按體積比30:70混合制成萃取液，萃取液與發(fā)酵清液混合后分離出有機(jī)相；使用碳酸鈉水溶液反萃取有機(jī)相，攪拌20min后靜置待兩相平衡后分離出水相，得到高濃度丁酸。
顯然，上面描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。