本發(fā)明屬于解磷微生物肥料領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一株解磷bacillushorneckiae及其用途，以及采用該bacillushorneckiae制備的解磷微生物菌劑。
背景技術(shù)：
作為植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的三大營(yíng)養(yǎng)元素之一，磷是植物細(xì)胞中dna和atp等關(guān)鍵成分的基本元素，并同時(shí)參與植物的光合作用與生化代謝。因此，磷是農(nóng)作物種植與生產(chǎn)中最重要的營(yíng)養(yǎng)元素之一，但同時(shí)磷也是土壤中難以再生的資源。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)約2/3的耕地土壤缺乏磷資源，且95%以上的磷與ca2+、fe2+、fe3+與a13+等金屬離子結(jié)合形成難溶性磷酸鹽而難以被作物吸收利用。因此，篩選并開(kāi)發(fā)解磷微生物肥料，能夠分解土壤中被固定的磷元素，同時(shí)有效提高磷肥利用率，從而達(dá)到促進(jìn)農(nóng)作物高產(chǎn)的目的。
芽孢桿菌屬（bacillus）為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，能夠產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢，因此具有較好的環(huán)境適應(yīng)性。芽孢桿菌良好的抗逆性不僅有利于微生物菌劑的制備，也使其在土壤環(huán)境中具有更好的定殖能力。而菌株bacillushorneckiae屬于芽孢桿菌屬，國(guó)內(nèi)罕見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。細(xì)菌解磷的主要機(jī)制包括有機(jī)酸的產(chǎn)生、質(zhì)子的釋放與酸性磷酸酶的生物合成等，從而將土壤中的磷轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的形態(tài)。開(kāi)發(fā)解磷微生物菌劑，不僅可以充分利用土壤中固定態(tài)或吸附態(tài)的磷；而且對(duì)提高磷肥利用率，減少磷肥過(guò)量使用所造成的環(huán)境污染，進(jìn)而提高農(nóng)作物產(chǎn)量與品質(zhì)，都具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的為提供一種解磷細(xì)菌——bacillushorneckiaedsm23495。所述菌株具有生長(zhǎng)速度快、解磷能力強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠改善土壤結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)作物對(duì)肥料的吸收，具有良好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明的另一個(gè)目的為提供一種由所述菌株bacillushorneckiaedsm23495制備的解磷微生物菌劑。
本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
本發(fā)明所提供的菌株為bacillushorneckiaedsm23495，分離于青島膠州灣堿蓬濕地采集的鹽堿地土壤樣品，并保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期：2017年01月09日，保藏編號(hào)為cgmccno.13551。
本發(fā)明所提供的bacillushorneckiaedsm23495培養(yǎng)方法或繁殖方法包括：
（1）普通培養(yǎng)保存采用na固體培養(yǎng)基，配方：0.5%蛋白胨，0.3%牛肉膏，0.5%nacl，1.5%瓊脂，蒸餾水，ph調(diào)至7.0；
（2）種子搖瓶培養(yǎng)采用na液體培養(yǎng)基，配方：0.5%蛋白胨，0.3%牛肉膏，0.5%nacl，蒸餾水，ph調(diào)至7.0；
（3）種子罐液體發(fā)酵培養(yǎng)基，配方：玉米粉15g，葡萄糖4g，豆餅粉21g，魚(yú)粉4g，caco39g，(nh4)2so41.5g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.1g，nacl0.1g，水1000ml，ph調(diào)至7.5；
（4）規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)基同種子罐液體發(fā)酵培養(yǎng)基。
本發(fā)明所提供的解磷微生物菌劑制備方法包括：
（1）種子搖瓶：將活化好的bacillushorneckiaedsm23495接種到裝有na液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)12h；
（2）種子罐發(fā)酵：將步驟（1）制備的搖瓶種子液接種至種子罐，進(jìn)行發(fā)酵至菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；接種量按體積比1:100，發(fā)酵培養(yǎng)基為種子罐液體發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵溫度為30～32℃，通風(fēng)比為0.5～0.8:1；
（3）發(fā)酵罐發(fā)酵：將步驟（2）制備的種子罐種子液接種至發(fā)酵罐，接種量按體積比1:10，發(fā)酵20～30h，發(fā)酵條件及發(fā)酵培養(yǎng)基同步驟（2），菌體量達(dá)到50～80×108cfu/ml，即可出罐。
實(shí)驗(yàn)表明，所述菌株具有生長(zhǎng)速度快、解磷能力強(qiáng)的特點(diǎn)。所述菌株的發(fā)酵液或菌劑中含有解磷菌，具有解磷功能，能夠改善土壤結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)作物對(duì)肥料的吸收。
附圖說(shuō)明
圖1為磷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是示例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
實(shí)施例1：菌株bacillushorneckiaedsm23495的分離與鑒定
（1）菌株分離
本發(fā)明的菌株bacillushorneckiaedsm23495是從土壤中采用平板稀釋涂布與劃線(xiàn)等方法分離獲得，分離方法：（1）培養(yǎng)基：蒙金娜無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基；（2）土壤樣品采集：采集地點(diǎn)為青島膠州灣堿蓬濕地，采用5點(diǎn)取樣法；（3）分離步驟：稱(chēng)取1g土樣于100ml無(wú)菌水中，置于搖床中30℃、150r/min震蕩10min，依次稀釋至10-2、10-3、10-4濃度。分別吸取100μl上述稀釋液，均勻涂布于蒙金娜無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基平板表面，每個(gè)梯度涂布三個(gè)平行，30℃培養(yǎng)7d，觀察有無(wú)溶磷圈，根據(jù)溶磷圈直徑（d）與菌落直徑（d）比值大小初步確定菌株的解磷能力。
通過(guò)所述菌株篩選與分離工作，得到菌株bacillushorneckiaedsm23495，實(shí)驗(yàn)表明，所述菌株具有生長(zhǎng)速度快、解磷能力強(qiáng)的特點(diǎn)，具有良好應(yīng)用前景。
（2）菌株分子生物學(xué)鑒定
微生物學(xué)特性：菌株接種于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)兩天。菌落形態(tài)為圓形或橢圓形，乳白色，邊緣粗糙有褶皺；顯微鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體呈桿狀，能運(yùn)動(dòng)；革蘭氏染色呈陽(yáng)性（以大腸桿菌為對(duì)照），觀察染色后芽孢呈橢圓形或柱狀。
分子生物學(xué)特性：該菌株的16srdna基因序列測(cè)定結(jié)果如下：
cggctggctccaaaggttaccccaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccggcttcatgcaggcgagttgcagcctgcaatccgaactgagaatggttttatgggattggctaaacctcgcggtcttgcagccctttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgtcccccgaaggggaacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggagtgcttaatgcgtttgctgcagcactaaagggcggaaaccctctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgcgcctcagtgtcagttacagaccagaaagtcgccttcgccactggtgttcctccaaatctctacgcatttcaccgctacacttggaattccactttcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccacggttgagccgtgggctttcacatcagacttaaggaaccacctgcgcgcgctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtaccggcagttactccgatacttgttcttccctaacaacagagttttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtggccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggcccatctgtaagtgacagccgaaaccgtctttcagcctttcctcatgtgaggaaagggattatccggtattagctccggtttcccgaagttatcccagtcttacaggcaggttgcccacgtgttactcacccgtccgccgctaatcttgggagcaagctccctcagattcgctcgactgc
綜上所述，菌株鑒定為bacillushorneckiae，該菌株目前已保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（簡(jiǎn)稱(chēng)cgmcc，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所），保藏日期：2017年01月09日，保藏編號(hào)為cgmccno.13551。
實(shí)施例2：解磷能力測(cè)定
（1）采用蒙金娜無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基測(cè)定解磷菌的解磷能力。
蒙金娜無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基配方：葡萄糖10g，(nh4)2so40.5g，nacl0.3g，kcl0.3g，feso4·7h2o0.03g，mgso4·7h2o0.3g，mnso4·4h2o0.03g，ca3(po3)210g，蒸餾水1000ml，ph調(diào)至7.0，可用于定量測(cè)定解磷微生物的解磷能力。
將斜面上保存的菌株bacillushorneckiaedsm23495接種到na液體培養(yǎng)基中，30℃、180r/min搖床振蕩培養(yǎng)12h，得到種子液；按1%的接種量（v/v），將上述種子液接種到含100ml蒙金娜無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基的三角瓶中；并按同樣接種量，將無(wú)菌na液體培養(yǎng)基接種到蒙金娜無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中作為空白對(duì)照，在恒溫?fù)u床中30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)7d。
（2）采用鉬銻抗比色法測(cè)定發(fā)酵液中有效磷的含量，發(fā)酵液中有效磷含量越高，表明該菌株的解磷能力越強(qiáng)。將發(fā)酵液搖勻，取20ml至離心管中，8000r/min離心10min；吸取0.5～2ml上清液至50ml容量瓶中，以蒸餾水稀釋至30ml左右；加入2滴2,6-二硝基酚指示劑，逐滴加入4mnaoh至溶液呈現(xiàn)黃色，再加入1mh2so4至溶液黃色剛好褪去；加入5ml的鉬銻抗試劑，以蒸餾水定容到50ml，25℃下顯色30min，以紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定700nm波長(zhǎng)的吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算有效磷含量。
（3）磷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：分別吸取5mg/l的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2、4、6、8、10ml至50ml容量瓶中，以蒸餾水稀釋至30ml左右，按照上述鉬銻抗比色法所述步驟，分別測(cè)定不同濃度磷標(biāo)準(zhǔn)溶液在700nm波長(zhǎng)的吸光度。以磷濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，如圖1所示。
實(shí)驗(yàn)表明，空白對(duì)照溶液中有效磷濃度為75.4mg/l，菌株bacillushorneckiaedsm23495的發(fā)酵液中有效磷濃度達(dá)148.5mg/l，表明菌株bacillushorneckiaedsm23495是一株高效解磷細(xì)菌。
實(shí)施例3：菌株bacillushorneckiaedsm23495的液體規(guī)模發(fā)酵
（1）菌株活化：菌株bacillushorneckiaedsm23495保存在na培養(yǎng)基斜面，-20℃保存。使用前，將菌株劃線(xiàn)接種在na培養(yǎng)基表面，活化2次備用。
（2）種子搖瓶：將活化好的菌株bacillushorneckiaedsm23495接種到裝有na液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)12h；
（3）種子罐發(fā)酵：將步驟（1）制備的搖瓶種子液接種至種子罐，進(jìn)行發(fā)酵至菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；
種子罐液體發(fā)酵培養(yǎng)基，配方：玉米粉15g，葡萄糖4g，豆餅粉21g，魚(yú)粉4g，caco39g，(nh4)2so41.5g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.1g，nacl0.1g，水1000ml，ph調(diào)至7.5。
發(fā)酵條件：溫度30～32℃，罐壓0.5kg/cm2，通風(fēng)量0.5～0.8:1；接種后，每隔2小時(shí)取樣一次，無(wú)菌水稀釋10～100倍后，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)菌體數(shù)量，并采用結(jié)晶紫染色法觀察生長(zhǎng)是否正常；若菌體大小基本一致，而數(shù)量突然增多時(shí)，即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（約需要12h），此時(shí)可以接種至發(fā)酵罐。
（4）發(fā)酵罐發(fā)酵：將種子罐發(fā)酵所得的種子液按10%（v/v）接種量接種至發(fā)酵罐，發(fā)酵條件及培養(yǎng)基與種子罐發(fā)酵一致。在正常發(fā)酵條件下，20～30h后，菌體數(shù)目能夠達(dá)到50～80×108cfu/ml。
實(shí)施例4：菌株bacillushorneckiaedsm23495的小區(qū)試驗(yàn)
試驗(yàn)材料：菌株bacillushorneckiaedsm23495的發(fā)酵菌粉，具有解磷功效，有效活菌數(shù)大于108cfu/g。
試驗(yàn)時(shí)間：2015年10月～2016年5月
試驗(yàn)地點(diǎn)：山東省林科院中試基地
供試品種：小麥（山農(nóng)21）
試驗(yàn)土壤：菜園土
試驗(yàn)設(shè)計(jì)：以清水拌種作為對(duì)照，以不同稀釋度（稀釋10倍、20倍、30倍）的菌粉液體拌種作為示范，每個(gè)處理三個(gè)平行，小區(qū)面積20m2，隨機(jī)分布。
施肥量與施肥方法：播種前，采用不同稀釋度（稀釋10倍、20倍、30倍）的菌粉液體拌種，以清水拌種作為對(duì)照，其他措施同當(dāng)?shù)?，統(tǒng)一澆水、除草等田間管理措施。
農(nóng)藝性狀及產(chǎn)質(zhì)量調(diào)查：于收獲前一天測(cè)量株高、分蘗數(shù)、有效穗、成穗率、穗粒數(shù)、千粒重。
由表1可見(jiàn)，采用bacillushorneckiaedsm23495原菌粉的稀釋液拌種的小麥，其在農(nóng)藝性狀方面好于清水拌種的小麥。
小麥?zhǔn)斋@后，測(cè)量各小區(qū)產(chǎn)量，并比較其顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)表2。
由表2可見(jiàn)，采用bacillushorneckiaedsm23495原菌粉的稀釋液拌種的小麥，其產(chǎn)量比用清水拌種的對(duì)照高。其中，原菌粉的10倍稀釋液拌種的小麥，產(chǎn)量與空白對(duì)照差異顯著，增產(chǎn)效果明顯。
可見(jiàn)，菌株bacillushorneckiaedsm23495具有生長(zhǎng)速度快、解磷能力強(qiáng)的特點(diǎn)。含有該菌株的發(fā)酵液或菌劑，具有解磷功能，能夠改善土壤結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)作物對(duì)肥料的吸收。
sequencelisting
<110>杜豐玉
<120>一株芽孢桿菌及其應(yīng)用
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<213>bacillushorneckiaedsm23495的16srrna基因序列
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