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技術領域：
】本發(fā)明屬于生物肥料
技術領域：
。更具體地，本發(fā)明涉及一種弧菌lx6-2，還涉及所述弧菌lx6-2在制備生物海藻肥中的用途。
背景技術：
：海藻是一種來源豐富的海洋生物，廣泛應用于食品、工業(yè)原料、植物性藥材。將海藻應用于農業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)已有幾百年歷史。海藻肥是一類純天然、無毒副作用的新型肥料，它含有豐富的氨基酸、礦物質、多糖、維生素及生理活性物質，具有提高作物產(chǎn)量、改善品質和增強作物抗旱、耐寒、抗病性等作用。因此，利用海藻生產(chǎn)有機肥料成為當今新型肥料研究的重要熱點之一。海藻肥是以生長在海洋中的大型速生褐藻類為原料，采用化學、物理或生物的方法提取海藻中的有效成分制成肥料，施予植物能促進植物生長，提高產(chǎn)量，改善農產(chǎn)品品質。海藻肥是天然的有機肥，其肥效依賴于海藻肥中所含有的細胞激動素、植物生長素、赤霉素、脫落酸、乙烯、甜菜堿、多胺等主要活性物質。海藻肥除含有大量的非含氮有機物和一定數(shù)量的氨基酸、蛋白質及微量營養(yǎng)元素外，還含有海洋生物特有的海藻多糖、藻朊酸、高度不飽和脂肪酸和陸生植物生長需要的鋅、溴、碘等微量礦物元素。目前，國內外海藻肥生產(chǎn)方法一般是化學水解法(即氫氧化鉀水解法)、物理提取法、生物發(fā)酵法(即酶降解法)等。另外，從海藻工業(yè)廢棄物中提取生物活性物質，再經(jīng)科學配制而得到的肥料。提取方法對于產(chǎn)品活性物質和營養(yǎng)成分含量的影響極大，相同含量但活性不同的話差異也很大?，F(xiàn)在國內外絕大部分廠家主要采用化學水解法生產(chǎn)海藻肥，這種方法的最大缺陷在于強堿高溫會破壞海藻內源物質的活性。物理提取法采用高壓低溫冷卻工藝以達到海藻細胞壁破碎的目的，該提取方法優(yōu)于化學提取法，但物理提純技術難度大，工業(yè)實施困難重重。生物發(fā)酵法是利用微生物在以海藻等為養(yǎng)分的代謝過程中產(chǎn)生的多種酶，將構成海藻大分子物質降解成小分子、水溶性的物質，因為發(fā)酵過程沒有化學法的強堿和高溫，也沒有物理法的高壓和低溫，因此最大限度完整地保留了海藻中的生物活性物質和營養(yǎng)物質，且都能被植物吸收利用。目前采用生物發(fā)酵法生產(chǎn)海藻肥在國內外僅限于實驗室研究，對其研制工藝及應用機理缺乏深入的系統(tǒng)研究，在產(chǎn)業(yè)化技術方面尚屬空白。海藻肥的使用方法主要有三種：(1)土壤施用：海藻肥含有的天然化合物如海藻多糖是天然土壤調節(jié)劑，不僅能螯合重金屬離子，增加土壤中有效成分的持久性和有效性，而且能促進土壤團粒結構的形成，改善土壤內部孔隙空間，協(xié)調土壤中固、液、氣三者比例，提高水分保持率和土壤的通氣性，恢復土壤的天然膠質平衡，增加土壤有機質。(2)種子浸泡：種子處理已被證明對于促進提早發(fā)芽和提高生長初期抗逆能力十分有效。(3)葉面噴施：葉面噴施是應用最廣泛的施肥方式，能快速補充植物對營養(yǎng)成分的邊緣缺乏，刺激根莖的發(fā)育和對營養(yǎng)成分的吸收。海藻肥中的褐藻酸可以降低水的表面張力，在植物葉表面形成一層薄膜，增大接觸面積，使水或水溶性物質比較容易透過葉表面細胞膜進入植物細胞，使植物最有效地吸收海藻提取液中的營養(yǎng)成分。因此海藻肥具有施用方法多樣，使用簡便，使用范圍廣泛等優(yōu)點，所以，以海藻肥為基礎根據(jù)不同需求開發(fā)出更加多樣化的海藻產(chǎn)品，必將更加適應市場的需求。技術實現(xiàn)要素：[要解決的技術問題]本發(fā)明的目的是提供一種弧菌lx6-2。本發(fā)明的另一個目的是提供所述弧菌lx6-2在制備生物海藻肥中的用途。[技術方案]本發(fā)明是通過下述技術方案實現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一種弧菌(vibriosp.)lx6-2，該菌株已于2015年3月23日在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為cgmccno.10659。本發(fā)明涉及所述的弧菌lx6-2在制備生物海藻肥中的用途。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述生物海藻肥的制備步驟如下：a.弧菌lx6-2斜面培養(yǎng)制備斜面培養(yǎng)基：配制含有5g/l海藻酸鈉、3g/l蛋白胨、3g/l氯化鈉、0.1g/l硫酸鎂、2g/l磷酸氫二鉀與20g/l瓊脂粉的ph7.0水溶液，然后在溫度121℃的條件下滅菌30min，得到所述的斜面培養(yǎng)基；將弧菌lx6-2菌株甘油管菌種接種于試管斜面固體培養(yǎng)基的斜面上，然后在恒溫培養(yǎng)箱中在溫度28～30℃的條件下斜面培養(yǎng)2～3d，得到斜面培養(yǎng)物；b.種子培養(yǎng)制備種子培養(yǎng)基：配制含有5g/l海藻酸鈉、3g/l蛋白胨、3g/l氯化鈉、0.1g/l硫酸鎂與2g/l磷酸氫二鉀的ph7.0水溶液，然后在溫度121℃的條件下滅菌30min，得到所述的種子培養(yǎng)基；使用接種環(huán)取一環(huán)步驟a得到的斜面培養(yǎng)物，將它接種到所述的種子培養(yǎng)基中，然后在恒溫搖床中在溫度28～30℃與轉速180rpm的條件下培養(yǎng)1～2d，得到種子培養(yǎng)物；c.制備海藻消化液粉碎的干燥海藻原料與弱堿水溶液混合均勻，然后在溫度50～60℃與攪拌的條件下進行消化1～2h，得到一種海藻消化液；d.生物海藻液的發(fā)酵在裝有海藻消化液的發(fā)酵罐中，按照0.1～10g/l蛋白胨、0.1～10g/l氯化鈉、0.1～10g/l硫酸鎂與0.1～10g/l磷酸氫二鉀，把蛋白胨、氯化鈉、硫酸鎂與磷酸氫二鉀培養(yǎng)基成分加到步驟c得到的海藻消化液中；然后按照海藻消化液體積的1.5～2.5％，把步驟b得到的種子培養(yǎng)物接入到發(fā)酵罐中，在溫度28～30℃、通氣量1:1.0～1.2、壓力0.04～0.06mpa與轉速100～200rpm的條件下恒溫攪拌24h，海藻消化液完全發(fā)酵，得到所述的生物海藻肥。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的生物海藻肥還含有一種選自大分子聚谷氨酸發(fā)酵液、小分子聚谷氨酸發(fā)酵液、熒光假單胞菌發(fā)酵液或解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的大分子聚谷氨酸發(fā)酵液是根據(jù)cn101109010b描述的方法由保藏編號為cgmccno.2108的枯草芽孢桿菌(bacillussubtillis)發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵液。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的小分子聚谷氨酸發(fā)酵液是根據(jù)cn104694437a描述的方法由保藏編號為cgmccno.8821的地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis，b.licheniformis)lw發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵液。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的熒光假單胞菌發(fā)酵液是根據(jù)cn104152380a描述的方法由保藏編號為cgmccno.8820的紫外誘變型熒光假單胞菌(pseudomonasflorescens，p.florescens)f1發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵液。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液是根據(jù)cn105316266a描述的方法由保藏編號為cgmccno.11263的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)lx-j1發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵液。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，在含有所述發(fā)酵液的生物海藻肥中，枯草芽孢桿菌cgmccno.2108、地衣芽孢桿菌lw、紫外誘變型熒光假單胞菌f1與解淀粉芽孢桿菌lx-j1的有效活菌數(shù)分別是5億/ml以上。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，在含有所述發(fā)酵液的生物海藻肥中，大分子聚谷氨酸發(fā)酵液、小分子聚谷氨酸發(fā)酵液、熒光假單胞菌發(fā)酵液與解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液的含量分別是以所述生物海藻肥總體積計10％～50％。下面將更詳細地描述本發(fā)明。本發(fā)明涉及一種弧菌(vibriosp.)lx6-2，該菌株已于2015年3月23日在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為cgmccno.10659。下面將更加具體的描述該菌株的篩選過程。本發(fā)明人從腐爛海帶中分離出42株細菌，經(jīng)過下述平板篩選實驗確定，其中19株菌株能夠在平板培養(yǎng)的條件下不同程度地降解海藻酸，然后對19株菌株進行海藻酸降解初篩，其中7株菌株降解海藻酸效果更好，7株菌16srdna測序確定它們均為弧菌，其菌株編號分別列于表1中。詳細篩選方法描述如下：在海邊拾取的海帶泡于海水中，在室溫下放置7天、15天、30天時分別挑取海帶腐爛部分，移至由5g/l海藻酸鈉、3g/l蛋白胨、3g/l氯化鈉、0.1g/l硫酸鎂、2g/l磷酸氫二鉀與20g/l瓊脂粉組成的ph7.0平板培養(yǎng)基上。恒溫培養(yǎng)2-3天，海帶上的微生物菌群得到富集。挑取一環(huán)富集菌苔于上述平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)、純化，經(jīng)過反復多次的分離純化，最終在不同時期不同腐爛程度的海帶中分離出42株細菌。在平板上進行透明圈降解實驗，將篩選菌株分別在上述平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)3-4天，有19株菌可以不同程度地降解海藻酸，經(jīng)初篩，其中7株菌降解效果較好，于是對這7株菌進行16srdna測序，確定它們均為弧菌。16srdna序列測定條件如下：樣品總dna的制備：按常規(guī)的細菌dna提取方法進行。pcr引物：正向引物27f，反向引物1492r；pcr反應體系：反應體系體積：20μl，反應液組成：1μldna模板、10μl2×mastarmix、0.4μl27f、0.4μl1492r，超純水補足至20μl。pcr擴增程序：95℃2min；30個循環(huán)(84℃1min，52℃1min，65℃8min)；65℃18min。擴增產(chǎn)物經(jīng)0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送北京三博遠志公司測序。將測到的dna序列進行人工矯正后，使用ncbi中的biast軟件在線比對，經(jīng)過比對，所鑒定的9個菌株與弧菌的相似度為99％，所以斷定這9個菌株均為弧菌屬。為挑選出更適合處理海藻浸提液的菌株，進行了海藻浸提液處理的比較實驗，實驗方法如下：首先制備海藻浸提液。稱取適量馬尾藻，加入為馬尾藻體積約10～20倍的水，再加入少量碳酸鈉堿將其處理成稀漿糊狀漿液，然后按照3g/l蛋白胨、3g/l氯化鈉、0.1g/l硫酸鎂與2g/l磷酸氫二鉀，往這種漿液中加入蛋白胨、氯化鈉、硫酸鎂與磷酸氫二鉀，得到所述的海藻浸提液。其次制備種子培養(yǎng)液。將初篩獲得的7株菌株分別接種到含有5g/l海藻酸鈉、3g/l蛋白胨、3g/l氯化鈉、0.1g/l硫酸鎂與2g/l磷酸氫二鉀的ph7.0搖瓶種子培養(yǎng)基中，然后置于恒溫搖床中在溫度28～30℃與轉速180rpm的條件下培養(yǎng)1～2d，得到種子培養(yǎng)物；第三，按照海藻提取液體積的2％，將上述菌株種子培養(yǎng)物分別接入到上述海藻浸提液，在溫度28～30℃下恒溫勻速攪拌，在不同時間取樣，采用烏氏粘度計法測定其粘度，其實驗結果列于表1中：表1：7株弧菌菌株的海藻浸提液降解效果表1的實驗結果清楚表明，弧菌lx6-2菌株(⑥-2)優(yōu)勢明顯，在24h就可以將提取液的粘度可降低至60秒以下。弧菌lx6-2具有下述生物學特性：形態(tài)特征：通過顯微鏡和平板菌落觀測，該菌屬陰性桿菌，端生鞭毛，能運動，無芽孢。在液體培養(yǎng)條件下，該菌成細小桿狀，無明顯彎曲弧度。在固體培養(yǎng)平板條件下，培養(yǎng)2-3天時，菌落成圓形突起，直徑0.5-1.0毫米，邊緣整齊，菌落成淡黃色半透明狀，表面濕潤。結合該菌株的形態(tài)特征及16srdna測序結果，將該菌株命名為弧菌(vibriosp.)lx6-2，該菌株已于2015年3月23日在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為cgmccno.10659。本發(fā)明還涉及所述的弧菌lx6-2在制備生物海藻肥中的用途。根據(jù)本發(fā)明，所述生物海藻肥的制備步驟如下：a.弧菌lx6-2斜面培養(yǎng)制備斜面培養(yǎng)基：配制含有5g/l海藻酸鈉、3g/l蛋白胨、3g/l氯化鈉、0.1g/l硫酸鎂、2g/l磷酸氫二鉀與20g/l瓊脂粉的ph7.0水溶液，然后在溫度121℃的條件下滅菌30min，得到所述的斜面培養(yǎng)基；將弧菌lx6-2菌株甘油管菌種接種于試管斜面固體培養(yǎng)基的斜面上，然后在恒溫培養(yǎng)箱中在溫度28～30℃的條件下斜面培養(yǎng)2～3d，得到斜面培養(yǎng)物；在制備斜面培養(yǎng)物時使用的蛋白胨例如是由北京奧博星生物技術有限公司生產(chǎn)的商品名為胰蛋白胨產(chǎn)品；瓊脂粉例如是由北京奧博星生物技術有限公司生產(chǎn)的商品名為瓊脂粉的產(chǎn)品。在這個步驟中，使用的斜面培養(yǎng)設備都是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由上海實驗儀器廠有限公司生產(chǎn)的恒溫培養(yǎng)箱；滅菌所使用的設備是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由江陰濱江醫(yī)療設備有限公司生產(chǎn)的手提式壓力蒸汽滅菌器或西安常儀儀器設備有限公司的高壓滅菌鍋產(chǎn)品。b.種子培養(yǎng)制備種子培養(yǎng)基：配制含有5g/l海藻酸鈉、3g/l蛋白胨、3g/l氯化鈉、0.1g/l硫酸鎂與2g/l磷酸氫二鉀的ph7.0水溶液，然后在溫度121℃的條件下滅菌30min，得到所述的種子培養(yǎng)基；使用接種環(huán)取一環(huán)步驟a得到的斜面培養(yǎng)物，將它接種到所述的種子培養(yǎng)基中，然后在恒溫搖床中在溫度28～30℃與轉速180rpm的條件下培養(yǎng)1～2d，得到種子培養(yǎng)物；這個步驟使用的海藻酸鈉是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由奧博星公司以商品名海藻酸鈉銷售的產(chǎn)品，其它試劑如前面所述或是化工
技術領域：
里通常使用的試劑。這個步驟使用的設備如前面所述，在此不再贅述。c.制備海藻消化液粉碎的干燥海藻原料與弱堿水溶液混合均勻，然后在溫度50～60℃與攪拌的條件下進行消化1～2h，得到一種海藻消化液；本發(fā)明海藻消化液制備方法是根據(jù)cn201510287164.1、發(fā)明名稱《一種活性海藻肥及其生產(chǎn)方法》專利申請說明書第0029-0039段所描述的方法。在本發(fā)明中，所述的海藻是一種或多種選自馬尾藻、海帶或泡葉藻的海藻。馬尾藻、海帶與泡葉藻都是目前市場上銷售的產(chǎn)品。干燥海藻原料是使用目前食品加工
技術領域：
里通常使用的設備進行粉碎的，例如由上海化三粉體設備有限公司公司以商品名scf雙軸微粉碎機銷售的粉碎設備。干燥海藻原料粉碎粒度不是特別關鍵，但合適的粒度則有利于后續(xù)的消化處理。一般地，干燥海藻的粒度是50～200目。根據(jù)本發(fā)明，所述的弱堿是碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸鈉或碳酸氫鈉，優(yōu)選地是碳酸鉀、碳酸氫鉀或碳酸鈉，更優(yōu)選地是碳酸鉀或碳酸氫鉀。本發(fā)明使用的弱堿水溶液的濃度是0.001～0.004g/ml。如果所述弱堿水溶液濃度過高或過低都是不合適的，因為如果弱堿水溶液濃度高于0.004g/ml，則溶液ph偏高，會破壞海藻中天然營養(yǎng)物質的活性；如果弱堿水溶液濃度低于0.001g/ml，則弱堿對海藻的溶脹作用有限，影響后面的酶解工藝，活性物質提取率下降。根據(jù)本發(fā)明，所述海藻與所述弱堿的質量比為5～8:1。優(yōu)選地，所述海藻與所述弱堿的質量比為6～8:1。更優(yōu)選地，所述海藻與所述弱堿的質量比為7～8:1。在使用弱堿消化時需要不斷攪拌，以便讓海藻粉顆粒能與弱堿水溶液充分接觸，消化反應完全。在這個步驟中，如果消化反應溫度低于50℃，則消化反應進行不完全，海藻細胞壁的溶脹作用受限，不利于海藻中營養(yǎng)物質的溶出；如果消化反應溫度高于60℃，則海藻中有效成分的活性受破壞，影響海藻肥的使用效果。因此，消化反應的溫度為50～60℃，優(yōu)選地是52～58℃，更優(yōu)選地是54～56℃。在消化反應溫度50～60℃的條件下，如果消化時間小于1h，則消化反應進行不完全，海藻細胞壁的溶脹作用受限，不利于海藻中營養(yǎng)物質的溶出；如果消化時間大于2h，則消化反應趨于平緩，造成能源的極大浪費，成本增加。因此，消化反應的時間為1～2h是合理的，優(yōu)選地是1.2～1.8h，更優(yōu)選地是1.4～1.6h。d.生物海藻液的發(fā)酵在裝有海藻消化液的發(fā)酵罐中，按照0.1～10g/l蛋白胨、0.1～10g/l氯化鈉、0.1～10g/l硫酸鎂與0.1～10g/l磷酸氫二鉀，把蛋白胨、氯化鈉、硫酸鎂與磷酸氫二鉀培養(yǎng)基成分加到步驟c得到的海藻消化液中；然后按照海藻消化液體積的1.5～2.5％，把步驟b得到的種子培養(yǎng)物接入到發(fā)酵罐中，在溫度28～30℃、通氣量1:1.0～1.2、壓力0.04～0.06mpa與轉速100～200rpm的條件下恒溫攪拌24h，海藻消化液完全發(fā)酵，得到所述的生物海藻肥。采用高效液相色譜檢測，本發(fā)明由lx6-2菌株發(fā)酵制備的生物海藻肥的赤霉素含量5000ppm以上，與常規(guī)化學處理方法和其他生物法相比，赤霉素含量提高了1-2倍，最大程度保護了海藻中原有活性物質，更加有效地促進了植物的生長發(fā)育和提高作物產(chǎn)量。根據(jù)本發(fā)明，所述的生物海藻肥還含有一種選自大分子聚谷氨酸發(fā)酵液、小分子聚谷氨酸發(fā)酵液、熒光假單胞菌發(fā)酵液或解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液的發(fā)酵液。在本發(fā)明中，含有大分子聚谷氨酸發(fā)酵液、小分子聚谷氨酸發(fā)酵液、熒光假單胞菌發(fā)酵液或解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液的生物海藻肥，也稱之復合生物海藻肥。所述的大分子聚谷氨酸發(fā)酵液是根據(jù)cn101109010b描述的方法由保藏編號為cgmccno.2108的枯草芽孢桿菌(bacillussubtillis)發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵液。所述的小分子聚谷氨酸發(fā)酵液是根據(jù)cn104694437a描述的方法由保藏編號為cgmccno.8821的地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis，b.licheniformis)lw發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵液。所述的熒光假單胞菌發(fā)酵液是根據(jù)cn104152380a描述的方法由保藏編號為cgmccno.8820的紫外誘變型熒光假單胞菌(pseudomonasflorescens，p.florescens)f1發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵液。所述的解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液是根據(jù)cn105316266a描述的方法由保藏編號為cgmccno.11263的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)lx-j1發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵液。在本發(fā)明中，采用本
技術領域：
的技術人員熟知的平板活菌計數(shù)法檢測，在含有所述發(fā)酵液的生物海藻肥中，枯草芽孢桿菌cgmccno.2108、地衣芽孢桿菌lw、紫外誘變型熒光假單胞菌f1與解淀粉芽孢桿菌lx-j1的有效活菌數(shù)分別是5億/ml以上。根據(jù)本發(fā)明，在含有所述發(fā)酵液的生物海藻肥中，大分子聚谷氨酸發(fā)酵液、小分子聚谷氨酸發(fā)酵液、熒光假單胞菌發(fā)酵液與解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液的含量分別是以所述生物海藻肥總體積計10％～50％。另外，本發(fā)明生物海藻肥為母液配以上述其它功能型微生物菌液而得到的復合生物海藻肥，它除了具有本發(fā)明生物海藻肥本身功效外，還具有其它功能型微生物肥的功效，功能更加豐富和具體化，可以滿足有不同需求的作物，有效的提高了施肥效率。本發(fā)明生物海藻肥按照其總體積的10％～50％與枯草芽孢桿菌cgmccno.2108發(fā)酵液混合得到的復合生物海藻肥，采用ctab法檢測它的聚谷氨酸含量為3g/l～15g/l，采用本
技術領域：
的技術人員熟知的平板活菌計數(shù)法檢測，它的枯草芽孢桿菌有效活菌數(shù)≥5億/ml，這種復合生物海藻肥除具有本發(fā)明生物海藻肥的功能功效外，還具有促進土壤形成團粒結構，增強土壤通透性的土壤改良作用。本發(fā)明生物海藻肥按照其總體積的10％～50％與地衣芽孢桿菌cgmccno.8821發(fā)酵液混合得到的復合生物海藻肥，采用ctab法檢測它的小分子聚谷氨酸含量為4g/l～20g/l，并且采用本
技術領域：
的技術人員熟知的平板活菌計數(shù)法檢測，它的地衣芽孢桿菌有效活菌數(shù)≥5億/ml，這種復合生物海藻肥除具有本發(fā)明生物海藻肥的功能功效外，還具有明顯提高植物抗旱抗逆能力，促生效果顯著的功能。本發(fā)明生物海藻肥按照其總體積的10％～50％與熒光假單胞菌cgmccno.8820發(fā)酵液混合得到的復合生物海藻肥，采用本
技術領域：
的技術人員熟知的平板活菌計數(shù)法檢測，它的熒光假單胞菌有效活菌數(shù)≥5億/ml，這種復合生物海藻肥除具有本發(fā)明生物海藻肥的功能功效外，還對小麥全蝕病和辣椒青枯病有很好的防效；本發(fā)明生物海藻肥按照其總體積的10％～50％與解淀粉芽孢桿菌cgmccno.11263發(fā)酵液混合得到的復合生物海藻肥，采用本
技術領域：
的技術人員熟知的平板活菌計數(shù)法檢測，它的解淀粉有效活菌數(shù)≥5億/ml，這種復合生物海藻肥除具有本發(fā)明生物海藻肥的功能功效外，還對禾谷絲核菌、立枯絲核菌、終極腐霉、白絹病菌、馬鈴薯黑痔病、花生白絹病都有很好的防治效果。[有益效果]本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明由lx6-2菌株發(fā)酵制備的生物海藻肥的赤霉素含量5000ppm以上，與常規(guī)化學處理方法和其他生物法相比，赤霉素含量提高了1-2倍，有效地促進植物生長發(fā)育和提高作物產(chǎn)量。本發(fā)明生物海藻肥為母液配以大分子聚谷氨酸發(fā)酵液、小分子聚谷氨酸發(fā)酵液、熒光假單胞菌發(fā)酵液或解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液，得到的復合生物海藻肥除具有上述功能功效外，還具有促進土壤形成團粒結構，增強土壤通透性的土壤改良作用，具有明顯提高植物抗旱抗逆能力，促生效果顯著的功能，對小麥全蝕病和辣椒青枯病有很好的防效，對禾谷絲核菌、立枯絲核菌、終極腐霉、白絹病菌、馬鈴薯黑痔病、花生白絹病很好的防治效果?！揪唧w實施方式】通過下述實施例將能夠更好地理解本發(fā)明。實施例1：本發(fā)明生物海藻肥的制備該實施例的實施步驟如下：a.弧菌lx6-2斜面培養(yǎng)制備斜面培養(yǎng)基：配制含有5g/l海藻酸鈉、3g/l蛋白胨、3g/l氯化鈉、0.1g/l硫酸鎂、2g/l磷酸氫二鉀與20g/l瓊脂粉的ph7.0水溶液，然后在溫度121℃的條件下滅菌30min，得到所述的斜面培養(yǎng)基；將弧菌lx6-2菌株甘油管菌種接種于試管斜面固體培養(yǎng)基的斜面上，然后在恒溫培養(yǎng)箱中在溫度28℃的條件下斜面培養(yǎng)2d，得到斜面培養(yǎng)物；b.種子培養(yǎng)制備種子培養(yǎng)基：配制含有5g/l海藻酸鈉、3g/l蛋白胨、3g/l氯化鈉、0.1g/l硫酸鎂與2g/l磷酸氫二鉀的ph7.0水溶液，然后在溫度121℃的條件下滅菌30min，得到所述的種子培養(yǎng)基；使用接種環(huán)取一環(huán)步驟a得到的斜面培養(yǎng)物，將它接種到所述的種子培養(yǎng)基中，然后在恒溫搖床中在溫度29℃與轉速180rpm的條件下培養(yǎng)1d，得到種子培養(yǎng)物；c.制備海藻消化液按照海藻與弱堿的質量比為6:1，粉碎的干燥馬尾藻原料與濃度為0.0034g/ml的碳酸鈉水溶液混合均勻，然后在溫度58℃與攪拌的條件下進行消化1.8h，得到一種海藻消化液；d.生物海藻液的發(fā)酵在裝有海藻消化液的發(fā)酵罐中，按照0.1g/l蛋白胨、3g/l氯化鈉、6g/l硫酸鎂與0.1g/l磷酸氫二鉀，把蛋白胨、氯化鈉、硫酸鎂與磷酸氫二鉀培養(yǎng)基成分加到步驟c得到的海藻消化液中；然后按照海藻消化液體積的2.2％，把步驟b得到的種子培養(yǎng)物接入到發(fā)酵罐中，在溫度29℃、通氣量1:1.0、壓力0.04mpa與轉速100rpm的條件下恒溫攪拌24h，海藻消化液完全發(fā)酵，得到所述的生物海藻肥。實施例2：本發(fā)明生物海藻肥的制備該實施例的實施步驟如下：a.弧菌lx6-2斜面培養(yǎng)制備斜面培養(yǎng)基：配制含有5g/l海藻酸鈉、3g/l蛋白胨、3g/l氯化鈉、0.1g/l硫酸鎂、2g/l磷酸氫二鉀與20g/l瓊脂粉的ph7.0水溶液，然后在溫度121℃的條件下滅菌30min，得到所述的斜面培養(yǎng)基；將弧菌lx6-2菌株甘油管菌種接種于試管斜面固體培養(yǎng)基的斜面上，然后在恒溫培養(yǎng)箱中在溫度29℃的條件下斜面培養(yǎng)3d，得到斜面培養(yǎng)物；b.種子培養(yǎng)制備種子培養(yǎng)基：配制含有5g/l海藻酸鈉、3g/l蛋白胨、3g/l氯化鈉、0.1g/l硫酸鎂與2g/l磷酸氫二鉀的ph7.0水溶液，然后在溫度121℃的條件下滅菌30min，得到所述的種子培養(yǎng)基；使用接種環(huán)取一環(huán)步驟a得到的斜面培養(yǎng)物，將它接種到所述的種子培養(yǎng)基中，然后在恒溫搖床中在溫度28℃與轉速180rpm的條件下培養(yǎng)2d，得到種子培養(yǎng)物；c.制備海藻消化液按照海藻與弱堿的質量比為7:1，粉碎的干燥馬尾藻原料與濃度為0.002g/ml的碳酸氫鈉水溶液混合均勻，然后在溫度52℃與攪拌的條件下進行消化2.0h，得到一種海藻消化液；d.生物海藻液的發(fā)酵在裝有海藻消化液的發(fā)酵罐中，按照2g/l蛋白胨、0.1g/l氯化鈉、4g/l硫酸鎂與5g/l磷酸氫二鉀，把蛋白胨、氯化鈉、硫酸鎂與磷酸氫二鉀培養(yǎng)基成分加到步驟c得到的海藻消化液中；然后按照海藻消化液體積的1.5％，把步驟b得到的種子培養(yǎng)物接入到發(fā)酵罐中，在溫度28℃、通氣量1:1.1、壓力0.05mpa與轉速200rpm的條件下恒溫攪拌24h，海藻消化液完全發(fā)酵，得到所述的生物海藻肥。實施例3：本發(fā)明生物海藻肥的制備該實施例的實施步驟如下：a.弧菌lx6-2斜面培養(yǎng)制備斜面培養(yǎng)基：配制含有5g/l海藻酸鈉、3g/l蛋白胨、3g/l氯化鈉、0.1g/l硫酸鎂、2g/l磷酸氫二鉀與20g/l瓊脂粉的ph7.0水溶液，然后在溫度121℃的條件下滅菌30min，得到所述的斜面培養(yǎng)基；將弧菌lx6-2菌株甘油管菌種接種于試管斜面固體培養(yǎng)基的斜面上，然后在恒溫培養(yǎng)箱中在溫度30℃的條件下斜面培養(yǎng)2d，得到斜面培養(yǎng)物；b.種子培養(yǎng)制備種子培養(yǎng)基：配制含有5g/l海藻酸鈉、3g/l蛋白胨、3g/l氯化鈉、0.1g/l硫酸鎂與2g/l磷酸氫二鉀的ph7.0水溶液，然后在溫度121℃的條件下滅菌30min，得到所述的種子培養(yǎng)基；使用接種環(huán)取一環(huán)步驟a得到的斜面培養(yǎng)物，將它接種到所述的種子培養(yǎng)基中，然后在恒溫搖床中在溫度30℃與轉速180rpm的條件下培養(yǎng)1d，得到種子培養(yǎng)物；c.制備海藻消化液按照海藻與弱堿的質量比為5:1，粉碎的干燥海帶原料與濃度為0.001g/ml的碳酸氫鉀水溶液混合均勻，然后在溫度50℃與攪拌的條件下進行消化1.0h，得到一種海藻消化液；d.生物海藻液的發(fā)酵在裝有海藻消化液的發(fā)酵罐中，按照10g/l蛋白胨、7g/l氯化鈉、0.1g/l硫酸鎂與10g/l磷酸氫二鉀，把蛋白胨、氯化鈉、硫酸鎂與磷酸氫二鉀培養(yǎng)基成分加到步驟c得到的海藻消化液中；然后按照海藻消化液體積的1.8％，把步驟b得到的種子培養(yǎng)物接入到發(fā)酵罐中，在溫度30℃、通氣量1:1.2、壓力0.06mpa與轉速140rpm的條件下恒溫攪拌24h，海藻消化液完全發(fā)酵，得到所述的生物海藻肥。實施例4：本發(fā)明生物海藻肥的制備該實施例的實施步驟如下：a.弧菌lx6-2斜面培養(yǎng)制備斜面培養(yǎng)基：配制含有5g/l海藻酸鈉、3g/l蛋白胨、3g/l氯化鈉、0.1g/l硫酸鎂、2g/l磷酸氫二鉀與20g/l瓊脂粉的ph7.0水溶液，然后在溫度121℃的條件下滅菌30min，得到所述的斜面培養(yǎng)基；將弧菌lx6-2菌株甘油管菌種接種于試管斜面固體培養(yǎng)基的斜面上，然后在恒溫培養(yǎng)箱中在溫度29℃的條件下斜面培養(yǎng)3d，得到斜面培養(yǎng)物；b.種子培養(yǎng)制備種子培養(yǎng)基：配制含有5g/l海藻酸鈉、3g/l蛋白胨、3g/l氯化鈉、0.1g/l硫酸鎂與2g/l磷酸氫二鉀的ph7.0水溶液，然后在溫度121℃的條件下滅菌30min，得到所述的種子培養(yǎng)基；使用接種環(huán)取一環(huán)步驟a得到的斜面培養(yǎng)物，將它接種到所述的種子培養(yǎng)基中，然后在恒溫搖床中在溫度29℃與轉速180rpm的條件下培養(yǎng)2d，得到種子培養(yǎng)物；c.制備海藻消化液按照海藻與弱堿的質量比為8:1，粉碎的干燥泡葉藻原料與濃度為0.004g/ml的碳酸鉀水溶液混合均勻，然后在溫度60℃與攪拌的條件下進行消化1.2h，得到一種海藻消化液；d.生物海藻液的發(fā)酵在裝有海藻消化液的發(fā)酵罐中，按照8g/l蛋白胨、10g/l氯化鈉、10g/l硫酸鎂與5g/l磷酸氫二鉀，把蛋白胨、氯化鈉、硫酸鎂與磷酸氫二鉀培養(yǎng)基成分加到步驟c得到的海藻消化液中；然后按照海藻消化液體積的2.5％，把步驟b得到的種子培養(yǎng)物接入到發(fā)酵罐中，在溫度29℃、通氣量1:1.1、壓力0.05mpa與轉速160rpm的條件下恒溫攪拌24h，海藻消化液完全發(fā)酵，得到所述的生物海藻肥。采用高效液相色譜法檢測了實施例1-4制備的生物海藻肥的赤霉素含量，以及從市場中購買的由某公司生物酶法處理得到的液體海藻肥產(chǎn)品與從市場上銷售的由化學法生產(chǎn)的液體海藻肥產(chǎn)品對照產(chǎn)品的赤霉素含量，這些結果列于表1中。表1：不同方法生產(chǎn)的海藻肥中赤霉素含量分析結果赤霉素(ppm)某廠家生物酶法生產(chǎn)的海藻液肥產(chǎn)品2284.535某廠家化學法生產(chǎn)的海藻液肥產(chǎn)品2564.006實施例1制備的海藻液肥產(chǎn)品5503.142實施例2制備的海藻液肥產(chǎn)品5211.688實施例3制備的海藻液肥產(chǎn)品5475.269實施例4制備的海藻液肥產(chǎn)品5383.867表1列出的結果表明，與常規(guī)化學處理方法和其他生物法相比，本發(fā)明方法制備的產(chǎn)品的赤霉素含量提高了1-2倍，因此能夠最大程度地保護海藻中原有活性物質，更加有效地促進了植物的生長發(fā)育和提高作物產(chǎn)量。試驗實施例1：含枯草芽孢桿菌的復合生物海藻肥的應用試驗該復合生物海藻肥含有以體積計50％本發(fā)明生物海藻肥與50％枯草芽孢桿菌cgmccno.2108發(fā)酵液?？莶菅挎邨U菌cgmccno.2108是一株高產(chǎn)大分子聚谷氨酸的菌株，大分子聚谷氨酸對改善土壤團粒結構具有明顯的作用。本試驗實施例使用的是實施例1制備的生物海藻肥；本試驗實施例使用的枯草芽孢桿菌cgmccno.2108發(fā)酵液是采用領先生物農業(yè)股份有限公司擁有的、cn101109010b、發(fā)明名稱《一株產(chǎn)γ-聚谷氨酸的菌株及其培養(yǎng)方法》中描述發(fā)酵方法制備的發(fā)酵液；采用cn201510127399.4、發(fā)明名稱《一株地衣芽胞桿菌及其在生產(chǎn)γ-聚谷氨酸中的用途》中描述提取與純化方法，從上述發(fā)酵液中提取聚谷氨酸并進行了純化。i、聚谷氨酸對土壤團粒結構的作用將土樣風干，在土樣潮濕時將大塊土用手掰碎，除去植物根系及小石塊，準確稱量每份為700g的土樣。設置3個處理，其大分子聚谷氨酸質量濃度分別為0％(ck)、0.3％、0.6％。將稱量風干土樣與大分子聚谷氨酸混合均勻裝入盆缽中，澆150ml水，重復2次，根據(jù)沙維諾夫分級法(濕篩法)的標準方法檢測在處理10個月后土壤團粒結構，其檢測結果列于表2中。表2：聚谷氨酸純品對土壤團粒結構的改良作用由表2列出的結果可以看出，純聚谷氨酸對促進土壤團粒結構具有明顯的作用。ii、復合生物海藻肥對土壤團粒結構的作用取供試土樣，準確稱量一份為1000g的土樣。以體積計50％本發(fā)明生物海藻肥與50％枯草芽孢桿菌cgmccno.2108發(fā)酵液混合得到的復合生物海藻肥含有16g/l聚谷氨酸。將這種復合生物海藻肥用水稀釋100倍，按照每次300ml將稀釋復合生物海藻肥澆灌到土樣中，半個月一次，連續(xù)澆灌5次，以清水澆灌為對照，根據(jù)沙維諾夫分級法(濕篩法)的標準方法檢測在處理10個月后土壤團粒結構，其檢測結果列于表3中。表3：復合生物海藻肥對土壤團粒結構的改良作用名稱>5mm(％)2～5mm(％)1～2mm(％)0.5～1mm(％)0.25～0.5mm(％)匯總(％)ck1.255.99811.16416.76820.81855.998復合生物海藻肥2.4267.94411.95417.74419.79859.866由表2列出的結果可以看出，本發(fā)明復合生物海藻肥對土壤團粒結構具有明顯的改善作用。試驗實施例2：含熒光假單胞菌的復合生物海藻肥的小麥全蝕病防治試驗該復合生物海藻肥含有以體積計80％本發(fā)明生物海藻肥與20％熒光假單胞菌cgmccno.8820發(fā)酵液，采用本
技術領域：
的技術人員熟知的平板活菌計數(shù)法檢測，熒光假單胞菌cgmccno.8820為7.2億/ml。其中，本試驗實施例使用的生物海藻肥是實施例2制備的生物海藻肥；本試驗實施例使用的熒光假單胞菌cgmccno.8820發(fā)酵液是采用領先生物農業(yè)股份有限公司的cn201410386364、發(fā)明名稱《一株紫外誘變型熒光假單胞菌及其用途》中描述的發(fā)酵方法制備的發(fā)酵液。試驗地點：秦皇島撫寧地區(qū)，全蝕病發(fā)病嚴重地塊。試驗方法，該試驗設置三個處理：ck：基肥處理1：基肥+本發(fā)明生物海藻肥處理2：基肥+含熒光假單胞菌的復合生物海藻肥其中：基肥為每畝n量23kg、p2o5量15kg、k2o量23kg。從小麥出苗期開始施肥直到分蘗期共施肥2次，每次用量為20l/畝，澆灌，在小麥結穗期開始調查，在此期間觀察小麥長勢情況及全蝕病的發(fā)病情況。調查結果列于表4中。表4：不同處理的小麥生長勢況調查分別調查200棵小麥全蝕病發(fā)病情況，根據(jù)下式能夠計算出平均防治效果。防效(％)＝(對照病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100％調查結果如下：對照處理的小麥全蝕病病情指數(shù)為97％，處理1使用本發(fā)明生物海藻肥澆灌，小麥全蝕病病情指數(shù)為47％，只是使用本發(fā)明生物海藻肥除促進生長外，還提高了植株的抗病性，防病效果達51.5％；處理2使用了本發(fā)明復合生物海藻肥的小麥全蝕病的病情指數(shù)為10％，防病效果達到89.7％。這些調查結果表明，本發(fā)明含有熒光假單胞菌的復合生物海藻肥除了對植株生長具有明顯的促進作用外，還起到了很好防治效果，提高了施肥效率，降低了用肥成本。試驗實施例3：含地衣芽孢桿菌的復合生物海藻肥的小白菜應用試驗該復合生物海藻肥含有以體積計70％本發(fā)明生物海藻肥與30％地衣芽孢桿菌cgmccno.8821發(fā)酵液，采用本
技術領域：
的技術人員熟知的平板活菌計數(shù)法檢測，地衣芽孢桿菌是8.5億/ml；其中，本試驗實施例使用的生物海藻肥是實施例3制備的生物發(fā)酵液；本試驗實施例使用的復合生物海藻肥是采用領先生物農業(yè)股份有限公司的、cn201510127399.4、發(fā)明名稱《一株地衣芽胞桿菌及其在生產(chǎn)γ-聚谷氨酸中的用途》中描述的發(fā)酵培養(yǎng)方法制備得到發(fā)酵液；該試驗在泡沫箱中進行，通過控水驗證肥料對小白菜抗旱的影響。試驗方法：該試驗設置四個處理，每組2個平行；處理1：不控水(清水澆灌，按正常供水，持水量65％～75％)處理2：控水(清水澆灌，中度干旱，持水量40％～50％)處理3：控水(澆灌本發(fā)明生物海藻肥，中度干旱，持水量40％～50％)處理4：控水(澆灌本發(fā)明復合生物海藻肥，中度干旱，持水量40％～50％)每個泡沫箱中裝9kg土；設計控水量為中度干旱(土壤最大持水量的40％～50％)，苗期首次施肥后開始控水，待自然干旱至設定的土壤含水量標準范圍后，在每晚17:00～18:00用數(shù)字水分儀測定土壤含水量，并補水控水，整個生長期35天，共計施肥2次(20l/畝用量)。試驗結果列于表5中。表5：在生長期結束后調查各處理小麥生長情況：處理1處理2處理3處理4株高cm27.7818.5629.1630.8鮮重g/株16.955.3620.9628.17從試驗結果可以看出，添加含地衣芽胞桿菌發(fā)酵液的復合生物海藻肥能明顯提高植物的抗旱抗逆性，在干旱缺水的條件下仍能保持良好的生長趨勢。試驗實施例4：含解淀粉芽孢桿菌復合生物海藻肥的平板抑菌試驗該復合生物海藻肥含有以體積計60％本發(fā)明生物海藻肥與40％解淀粉芽孢桿菌cgmccno.8821發(fā)酵液，采用本
技術領域：
的技術人員熟知的平板活菌計數(shù)法檢測，解淀粉芽孢桿菌的有效活菌數(shù)是8.3億/ml；其中，該試驗實施例使用的復合生物海藻肥是實施例4制備的發(fā)酵液；該試驗實施例使用的解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液是采用領先生物農業(yè)股份有限公司的、cn201510894025、發(fā)明名稱《一株解淀粉芽孢桿菌lx-j1及其用途》中描述的制備方法制備得到的發(fā)酵液。平板抑菌試驗如下：制備pda固體培養(yǎng)基：按照200g/l比例把去皮土豆置于水中煮沸30min，冷卻，再用2層紗布進行過濾，接著按照20g/l蔗糖與20g/l瓊脂，往得到的濾液中添加蔗糖與瓊脂，滅菌，得到所述的pda固體培養(yǎng)基。將禾谷絲核菌、立枯絲核菌、終極腐霉菌、花生白絹病菌、馬鈴薯黑痔病菌的菌餅分別接種在上述制備的pda固體培養(yǎng)上，在溫度25℃下培養(yǎng)4-5d，待病原真菌長滿整個培養(yǎng)皿。拮抗效果測定：首先用打孔器從培養(yǎng)皿中取其直徑約6mm的病原菌菌餅，置于pda平板中心，分別在其左右兩側約150mm處打孔，并加入20μl本發(fā)明含解淀粉芽孢桿菌的復合生物海藻肥；同時以不加所述復合生物海藻肥作為對照，在溫度25℃下培養(yǎng)4-5d，待對照長滿整個培養(yǎng)皿，記錄復合生物海藻肥對各病原菌的抑菌直徑，其試驗結果列于表6中，并根據(jù)下述公式計算得到相應的抑菌率：菌落生長抑制率＝(對照菌落凈生長直徑－處理菌落凈生長直徑)/對照菌落凈生長直徑×100％表6：本發(fā)明復合生物海藻肥抑菌效果病原菌禾谷絲核立枯絲核終極腐霉花生白絹病馬鈴薯黑痣病抑菌率87.6％69.8％88.7％76.4％72.9％表6的結果清楚地表明，解淀粉芽孢桿菌lx-j1與本發(fā)明生物海藻肥復配，即本發(fā)明復合生物海藻肥，對禾谷絲核菌、立枯絲核菌、對終極腐霉、花生白絹病、馬鈴薯黑痔病菌仍有較強的抑制效果，也就是說復配后該款功能型海藻肥除具有生物海藻肥的基礎功效外，還可以對植物病害起到有效的防治，一舉多得。當前第1頁12