本發(fā)明屬于生物防治植物害蟲領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一株甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌（bacillusmethylotrophicus）kacc13105及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

甜菜夜蛾（spodopteraexiguahübner）（鱗翅目：夜蛾科）是我國(guó)農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中的一種重要害蟲，尤其對(duì)蔬菜、棉花等經(jīng)濟(jì)作物為害最重。目前，甜菜夜蛾的危害已遍及20多個(gè)省、市和自治區(qū)，而對(duì)其的防治仍依賴于化學(xué)合成農(nóng)藥。由于化學(xué)合成農(nóng)藥的濫用和不合理使用，甜菜夜蛾對(duì)較多種類的殺蟲劑已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性，且?guī)砹酥T多負(fù)面影響，如食品安全（農(nóng)藥殘留超標(biāo)）與環(huán)境污染等。

微生物農(nóng)藥因其“環(huán)境友好”特性，在國(guó)內(nèi)外獲得了又一次發(fā)展的機(jī)遇?！秶?guó)家中長(zhǎng)期科學(xué)與技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要（2006-2020）》和《國(guó)家“十二五”科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃》已經(jīng)將農(nóng)業(yè)生物藥物與生態(tài)農(nóng)業(yè)作為優(yōu)先發(fā)展方向。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2011年全球生物農(nóng)藥市場(chǎng)價(jià)值達(dá)13億美元，2017年有望達(dá)到32億美元；而中國(guó)市場(chǎng)由于農(nóng)藥管理制度日趨嚴(yán)格，公眾對(duì)天然產(chǎn)品需求日益增長(zhǎng)，已經(jīng)成為生物農(nóng)藥發(fā)展最快的市場(chǎng)之一。因此，加快微生物農(nóng)藥的研究與開發(fā)，已經(jīng)成為未來綠色農(nóng)藥發(fā)展的趨勢(shì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的為提供一株甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌（bacillusmethylotrophicus）kacc13105及其應(yīng)用。該菌株易于規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)，其發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)提取分離后對(duì)甜菜夜蛾等植物害蟲具有較好的殺蟲活性，可用于制備微生物殺蟲劑，發(fā)展前景良好。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明所提供的菌株為甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌（bacillusmethylotrophicus）kacc13105，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡(jiǎn)稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所），保藏日期：2016年12月09日，保藏編號(hào)為：cgmccno.13437。

甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌（bacillusmethylotrophicus）kacc13105的保存方法：采用lb固體培養(yǎng)基保存。lb固體培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%nacl，1.5%瓊脂，蒸餾水，ph調(diào)至7.0。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌（bacillusmethylotrophicus）kacc13105的發(fā)酵方法，其特征是，

1）將保存的甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌kacc13105接種于lb固體平板表面，30℃培養(yǎng)2-4天，作為規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)的菌種，待用；

2）將菌種接種于無菌的、盛有l(wèi)b液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，30℃120rpm搖床培養(yǎng)10-20天，得到發(fā)酵產(chǎn)物待用；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%nacl，蒸餾水，ph調(diào)至7.0。

上述發(fā)酵產(chǎn)物可以進(jìn)一步提取，具體包括以下步驟：

1）采用有機(jī)溶劑提取，提取液減壓蒸餾得浸膏；所述有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇、乙醇或者正丁醇中的一種或幾種，優(yōu)選乙酸乙酯；

2）然后浸膏進(jìn)行柱層析分離，所述柱層析可采用硅膠柱層析、凝膠柱層析、反相柱層析及大孔吸附樹脂柱層析中的一種或幾種，優(yōu)選硅膠柱層析；

3）然后以氯仿-甲醇梯度洗脫，收集氯仿-甲醇體積比10:1梯度的洗脫組分i與體積比5:1梯度的洗脫組分ⅱ用于制備微生物殺蟲劑；所述氯仿-甲醇洗脫梯度為100:1至1:1。

本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：

甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌kacc13105，分離于青島膠州灣濕地采集的鹽生植物堿蓬樣品，屬于堿蓬內(nèi)生細(xì)菌，且具有較高的耐鹽堿性。所述菌株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)甜菜夜蛾具有較好的殺蟲活性，在濃度為0.4mg/ml時(shí)，致死率為84.3±1.2%。所述菌株發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、提取分離得到，可以利用微生物進(jìn)行不同規(guī)模的發(fā)酵，具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、周期短、產(chǎn)品成本低等優(yōu)點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是示例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例1：甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌（bacillusmethylotrophicus）kacc13105菌株鑒定

微生物學(xué)特性：菌株接種于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)兩天。菌落形態(tài)為圓形或橢圓形，乳白帶微黃色，邊緣凸起不透明；顯微鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體呈桿狀，能運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)芽孢；革蘭氏染色呈陽性（以大腸桿菌為對(duì)照），觀察染色后芽孢呈橢圓形。

分子生物學(xué)特性：該菌株的16srdna基因序列測(cè)定結(jié)果如下：

ggctggctcctaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgccgccctatttgaacggcacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgttgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagccgaagccaccttttatgtctgaaccatgcggttcaaacaaccatccggtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatcagggagcaagctcccatctgtccgctcgactgc

綜上所述，菌株鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌（bacillusmethylotrophicus），該菌株目前已保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（簡(jiǎn)稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所），保藏日期：2016年12月09日，所述菌株的保藏編號(hào)為cgmccno.13437。

實(shí)施例2：甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌（bacillusmethylotrophicus）kacc13105發(fā)酵產(chǎn)物的制備

（1）發(fā)酵培養(yǎng)

按照微生物的常規(guī)培養(yǎng)方法，挑取少量保存于lb固體培養(yǎng)基斜面的菌株bacillusmethylotrophicuskacc13105，接種于lb固體平板表面，30℃培養(yǎng)2天，作為規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)的菌種，待用。

lb固體培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%nacl，1%瓊脂，蒸餾水，ph調(diào)至7.0。

將上述lb固體平板表面的菌種接種于無菌的、盛有l(wèi)b液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，30℃120rpm搖床培養(yǎng)10天。

（2）發(fā)酵產(chǎn)物的制備

將上述lb液體培養(yǎng)基用乙酸乙酯提取3次，合并乙酸乙酯提取液，減壓蒸餾得浸膏。將其進(jìn)行硅膠vlc（vacuumliquidchromatography）快速柱層析，按照洗脫液極性遞增順序，以體積比100:1至1:1的氯仿-甲醇（流速為150ml/min）進(jìn)行梯度洗脫，收集氯仿-甲醇體積比10:1和5:1梯度的洗脫組分ⅰ與ⅱ，即得菌株bacillusmethylotrophicuskacc13105發(fā)酵產(chǎn)物。

實(shí)施例3：甜菜夜蛾殺蟲活性測(cè)定

采用葉碟浸漬法測(cè)定菌株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)甜菜夜蛾3齡幼蟲的殺蟲活性。（趙麗,劉麗,胡江春,高錦明,王書錦.中國(guó)生物防治學(xué)報(bào),2011,27:331-337）。

操作步驟：（1）將新鮮的甘藍(lán)葉片葉肉部分剪成1cm×1cm的小葉碟，樣品（實(shí)施例2中發(fā)酵產(chǎn)物的洗脫組分ⅰ與ⅱ）用90%丙酮溶液配制成一定濃度的溶液；（2）吸取50μl樣品溶液加入裝有4片葉碟的24孔板中，每濃度8個(gè)重復(fù)，以90%丙酮溶液做空白對(duì)照；（3）待溶劑揮干后，加入甜菜夜蛾3齡幼蟲，每孔1頭，蓋好蓋子，35℃、rh40%條件下避光培養(yǎng)；（4）培養(yǎng)48h后，觀察甜菜夜蛾幼蟲取食和死亡情況，計(jì)算校正死亡率。校正死亡率=（a?ck）/（1?ck）×100%，a為樣品孔致死率，ck為對(duì)照孔致死率。

實(shí)驗(yàn)表明，菌株bacillusmethylotrophicuskacc13105的發(fā)酵產(chǎn)物在濃度為0.4mg/ml時(shí)，對(duì)甜菜夜蛾具有較好的殺蟲活性，致死率為84.3±1.2%，可用于制備防治甜菜夜蛾的微生物殺蟲劑。

sequencelisting

<110>杜豐玉

<120>一株甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌kacc13105及其應(yīng)用

<130>1

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<141>2017-02-22

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<210>1

<211>1413

<212>dna

<213>甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌（bacillusmethylotrophicus）kacc13105的16srrna基因序列

<400>1

ggctggctcctaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacg60

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