專利名稱：應(yīng)用于豬鏈球菌2型致病性檢測的多重?zé)晒鈖cr檢測試劑及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用多重?zé)晒釶CR檢測豬鏈球菌2型致病性的試劑及檢測方法。更具體地說，本發(fā)明涉及同時應(yīng)用針對豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白(Muramidase-Released Protein，MRP)和胞外因子(extracellular factor，EF)兩種毒力因子編碼基因設(shè)計(jì)的熒光PCR引物對和探針進(jìn)行豬鏈球菌2型致病性檢測的試劑及檢測方法。
背景技術(shù)：
豬鏈球菌病(Swine Streptococcosis)是由豬鏈球菌(Streptococcus suis)侵害豬的上呼吸道、生殖道、消化道等組織而引起的一種疾病。病原包括豬鏈球菌(Streptococcus suis)、馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus suis equi subsp.zooepidemicus)、馬鏈球菌馬亞種(Streptococcussuis equi subsp equi)等。
豬鏈球菌2型感染廣泛發(fā)生于各養(yǎng)豬發(fā)達(dá)國家。英國的Field(1954)從暴發(fā)敗血癥、腦膜炎和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的乳豬中分離出一株α溶血豬鏈球菌，可是卻不能歸屬于當(dāng)時所認(rèn)識的19個蘭氏(Lance field)血清群。1956-1963年間，de Moor首次通過生化和血清學(xué)方法，對引起豬敗血性感染的新的a溶血性鏈球菌進(jìn)行了鑒定，認(rèn)為屬于革蘭氏R、S和T群。Elliot(1968年)按莢膜分類法把此菌命名為莢膜2型豬鏈球菌。之后，英國(Lamont，1980)、澳大利亞(Buddle，1981)、美國(Kochae，1982)、丹麥(Beate-Perch，1983)、日本(Azuma，1983)、加拿大(Toutt，1988)和歐洲和北美(Clifton-Hadley，1988)的許多國家均有豬鏈球菌2型感染豬只發(fā)病的報(bào)道。1968年丹麥?zhǔn)状螆?bào)道了人體感染豬鏈球菌導(dǎo)致腦膜炎的病例。目前全球已有200余例豬鏈球菌感染病例報(bào)告。
引起豬鏈球菌病的病原一般為豬鏈球菌2型。豬鏈球菌2型可以引起豬的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、肺炎和突發(fā)性死亡，也可引起相關(guān)從業(yè)人員腦膜炎并致死，是重要的人獸共患病病原，對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對公共衛(wèi)生尤其是相關(guān)從業(yè)人員的生命構(gòu)成威脅，所以引起世界范圍內(nèi)的高度重視。1990年我國廣東省首次分離到豬鏈球菌2型(黃毓茂等，1991)。據(jù)報(bào)道，豬鏈球菌2型在健康豬扁桃體中的帶菌率高達(dá)76％(143/188)(Davies，1991)。因此，該病給養(yǎng)豬業(yè)所帶來的危害越來越嚴(yán)重。
根據(jù)莢膜多糖的不同，可將豬鏈球菌分為35個血清型，其中以2型流行最廣、致病性最強(qiáng)，可引起嚴(yán)重的人—豬鏈球菌感染。但豬鏈球菌2型不一定都具有致病性，據(jù)我國江蘇獸醫(yī)研究所調(diào)查表明，正常豬群中豬鏈球菌2型的帶菌率很高，平均為42.6％[4]。而澳大利亞和新西蘭的研究表明75％的健康豬攜帶有豬鏈球菌2型菌，3％的健康豬血液培養(yǎng)陽性，但不發(fā)病。Davies(1991)報(bào)道健康豬的扁桃體帶菌率可高達(dá)76％(143/188))。故在疫情發(fā)生時，只確定病原是豬鏈球菌2型還遠(yuǎn)不夠，還必須弄清其致病力，以利于有針對性地采取應(yīng)對措施，防止疫情的蔓延。
鑒定豬鏈球菌2型毒力因子的經(jīng)典方法需通過蛋白電泳及免疫轉(zhuǎn)印等手段，方法較為繁瑣，而且要求提供的參考血清難以獲得。因此建立敏感度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、簡易、經(jīng)濟(jì)的檢測方法是發(fā)展的方向。分析蛋白圖譜時發(fā)現(xiàn)，從病豬體內(nèi)分離的菌株有MRP(溶菌酶釋放蛋白)、EF(細(xì)胞外因子)等毒力因子，可以作為致病力的重要檢測指標(biāo)。
在分子生物學(xué)研究方面，Vecht(1991)研究認(rèn)為，根據(jù)菌株MRP和EF基因的有無，可將豬鏈球菌2型分為高毒力株(MRP+EF+)、低毒力株(MRP+EF-)和無毒株(MRP-EF-)，引起嚴(yán)重人-豬感染的鏈球菌2型均為高致病性的MRP+EF+基因型。Vecht(1992)又用試驗(yàn)探討了豬鏈球菌2型與表型間的關(guān)系。MRP+EF+菌株引起無菌豬發(fā)熱，血液中多形核白細(xì)胞增高，特異臨床癥狀為神經(jīng)紊亂和跛行，組織學(xué)病變表現(xiàn)為腦膜炎、多發(fā)性漿膜炎及關(guān)節(jié)炎，MRP+EF-表型只引起非典型臨床癥狀，食欲缺乏和發(fā)熱。MRP-EF-則無癥狀出現(xiàn)。
在國內(nèi)，歐瑜、陸承平通過免疫印跡試驗(yàn)證實(shí)豬鏈球菌2型江蘇分離株HA9801存在MRP和EF因子，并檢測出豬鏈球菌2型有4種表型，其中表型MRP+EF+為強(qiáng)致病株，MRP+EF-為弱致病株，MRP-EF-為非致病株，未發(fā)現(xiàn)MRP-EF+表型。
在豬鏈球菌2型毒力因子的PCR檢測方面，國內(nèi)外組裝了多套PCR體系。何孔旺等(2002)根據(jù)豬鏈球菌2型毒力因子溶菌酶釋放蛋白(MRP)與細(xì)胞外蛋白因子(EF)基因(mrp與epf)序列，分別設(shè)計(jì)、合成一對引物，建立聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法。該方法擴(kuò)增出2型菌株的mrp大小為885bp，epf為626bp，PCR檢測的敏感度可達(dá)100個細(xì)菌。用建立的PCR對從病豬體內(nèi)分離的菌株進(jìn)行檢測，檢測的15株2型分離株中有13株mrp與epf均為陽性，為典型的高毒力表現(xiàn)型菌株(mrp+epf+)，1株為mrp+epf-，1株為mrp-epf-。劉軍等(2005)以豬鏈球菌2型和9型的莢膜多糖抗原編碼基因簇中的cps 2J和cps 9H基因、豬鏈球菌2型的主要毒力因子編碼基因epf和mrp為靶基因設(shè)計(jì)了四對引物，建立了檢測豬鏈球菌的多重PCR反應(yīng)體系。用該多重PCR反應(yīng)體系對10株豬鏈球菌分離株進(jìn)行了鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10株豬鏈球菌分離株中有5株是9型菌株，另有5株是2型菌株，2型菌株有2種基因型3株cps2+mrp+epf+型，2株cps2+mrp-epf-型。
熒光PCR(FQ-PCR)技術(shù)融合了PCR和DNA探針雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，直接探測PCR過程中熒光信號的變化，使PCR的擴(kuò)增及其分析過程均在同一封閉系統(tǒng)下完成，只需加樣時打開一次PCR反應(yīng)管，具有特異性好、假陽性低、靈敏度高(是常規(guī)PCR的100倍以上)、操作簡單、交叉污染和污染環(huán)境的機(jī)會少(不需要EB染色)等優(yōu)點(diǎn)，而且整個反應(yīng)可在0.5-1小時內(nèi)完成。多重?zé)晒釶CR是在同一個反應(yīng)體系中加入多個引物對和探針，同時檢測多個目的基因的方法，該方法可以方便的進(jìn)行一管多檢，從而達(dá)到省時省力的目的。在同時檢測多個因子(如豬鏈球菌2型的毒力因子)時，前景廣闊。
本研究同時選取豬鏈球菌2型的兩種毒力因子MRP和EF的編碼基因設(shè)計(jì)引物及探針，通過對反應(yīng)的退火溫度和鎂離子濃度進(jìn)行優(yōu)化，建立了用于檢測豬鏈球菌2型致病性的多重?zé)晒釶CR檢測試劑及方法，

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供用于豬鏈球菌2型致病性檢測的多重實(shí)時熒光PCR檢測試劑及方法。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在分析已報(bào)道豬鏈球菌2型兩種毒力因子MRP和EF序列的基礎(chǔ)上，分別設(shè)計(jì)PCR引物和熒光探針。在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上添加了一條標(biāo)記了兩個熒光染料基團(tuán)的核苷酸探針，報(bào)告熒光染料標(biāo)記在探針的5’端，淬滅熒光染料標(biāo)記在探針的3’端，二者構(gòu)成能量轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)。當(dāng)探針完整時，報(bào)告熒光染料所發(fā)射的熒光可被淬滅熒光染料吸收，在熒光PCR反應(yīng)的退火過程中，探針優(yōu)先結(jié)合到DNA模板上，當(dāng)引物延伸到探針結(jié)合位置時，在DNA聚合酶5’端到3’端的外切酶的作用下，探針被水解，從而導(dǎo)致報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)距離變遠(yuǎn)，報(bào)告熒光信號得以釋放出來而被儀器檢測到，從而實(shí)現(xiàn)對豬鏈球菌2型兩種毒力因子基因的檢測，并根據(jù)“MRP+EF+為強(qiáng)致病株、MRP+EF-為弱致病株、MRP-EF-為非致病株”的標(biāo)準(zhǔn)判定其致病性。
一個方面，本發(fā)明提供了一種用于豬鏈球菌2型致病性檢測的多重實(shí)時熒光PCR檢測試劑，該試劑包括分別特異性地針對毒力因子溶菌酶釋放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)編碼基因的引物對及探針，因而可同時針對豬鏈球菌2型的兩種毒力因子MRP和EF進(jìn)行檢測，其中所述的特異性地針對MRP編碼基因的引物對和探針的核苷酸序列為MRP引物(正向)5’-AGACCGTCCAAAAGTACCTTACCMRP引物(反向)5’-CATTTGTTCCTGGTGTCGTTGGMRP探針5’-TGACCCAACAGAGCCAGACGAGCC該探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料JOE，3’端標(biāo)記有淬滅熒光染料Eclipse；其中所述的特異性地針對EF編碼基因的引物對和探針的核苷酸序列為EF引物(正向)5’-ACAGTGCAGAAGCAGTAGGCEF引物(反向)5’-GAACATCTTGGGCGATTGAACC
EP探針5’-ACGCCTTTGTCCTCTGCCGATTGC該探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料FAM，3’端標(biāo)記有淬滅熒光染料TAMRA。
其中所述的MRP引物對及探針與EF引物對及探針可以預(yù)先混合在一起，也可以獨(dú)立存在于所述檢測試劑中，使用時現(xiàn)用現(xiàn)配。
本發(fā)明所述的檢測試劑進(jìn)一步還可以含有其他PCR擴(kuò)增用成分，例如，包括但不限于PCR緩沖液、MgCl2和dNTP。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該試劑為表1所列成分的混合液表1.豬鏈球菌2型致病性檢測試劑

另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測豬鏈球菌2型致病性的多重實(shí)時熒光PCR檢測方法，該方法同時選取豬鏈球菌2型兩種毒力因子MRP和EF基因?yàn)槟康幕?，使用本發(fā)明所述的特異性地針對MRP和EF基因的引物對和探針實(shí)施檢測。
本發(fā)明人首先設(shè)計(jì)分別針對毒力因子MRP和EF基因的引物對和探針，采用軟件分析所設(shè)計(jì)引物對和探針的特異性，引物對和探針合成后分別進(jìn)行稀釋并確定反應(yīng)需要量，通過調(diào)整反應(yīng)體系中的鎂離子濃度和對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，以培養(yǎng)菌液或者帶菌組織DNA為檢測樣本，確定熒光PCR檢測培養(yǎng)菌液或者帶菌組織中每個毒力因子最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，采用倍比稀釋的豬鏈球菌2型培養(yǎng)菌液及帶菌組織DNA作為模板進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，采用其它的豬體致病菌為對照進(jìn)行特異性試驗(yàn)，以確保本方法的實(shí)際應(yīng)用效果。在此基礎(chǔ)上，將MRP和EF的檢測試劑組裝在一起，建立了豬鏈球菌致病性的多重實(shí)時熒光PCR檢測方法，并確定其敏感性和特異性。具體試驗(yàn)過程參見實(shí)施例1-5。
本發(fā)明所述方法可以直接對培養(yǎng)菌液進(jìn)行檢測，也可以對組織中攜帶的豬鏈球菌2型實(shí)施檢測。在采用培養(yǎng)菌液作為檢測材料時，菌體分離及培養(yǎng)須在P3實(shí)驗(yàn)室、按照CDC(中國疾病預(yù)防控制中心)推薦的豬鏈球菌分離培養(yǎng)程序進(jìn)行。即采用扁桃體拭子采取待檢豬的病料，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，分別接種綿羊鮮血瓊脂平板。37℃培養(yǎng)24h后，挑取可疑菌落接種于匹克氏增菌液，37℃培養(yǎng)24h后，再接種血清肉湯，37℃搖床培養(yǎng)后，滅活備用。在對帶菌的組織，如豬扁桃體、肌肉等進(jìn)行檢測時，須首先采用商品化的基因組提取試劑盒提取其基因組DNA作為熒光PCR檢測用模板。
在利用本發(fā)明所述方法對待檢樣本實(shí)施檢測時，可直接取一定量的本發(fā)明所述檢測試劑，按照確立的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行檢測并判定結(jié)果。簡而言之，本發(fā)明所述的用于檢測豬鏈球菌2型致病性的多重實(shí)時熒光PCR檢測方法包括下述步驟1)使用本發(fā)明所述的特異性地針對MRP和EF的引物對及熒光素標(biāo)記探針，與PCR擴(kuò)增用的dNTP、PCR緩沖液及聚合酶混合，得到檢測預(yù)混液；2)向上述檢測預(yù)混液中加入待檢菌液或以待檢組織提取的基因組DNA作為模板；3)將步驟2)中建立的擴(kuò)增反應(yīng)體系置于熒光PCR儀上；4)根據(jù)探針標(biāo)記的報(bào)告熒光類型，選擇對應(yīng)的熒光通道，按照本發(fā)明確立的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后讀取并記錄各檢測樣本的PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct)；5)根據(jù)各樣本的反應(yīng)Ct值，按照豬鏈球菌2型致病性判定標(biāo)準(zhǔn)判定待檢樣本中豬鏈球菌2型的致病性。
在本發(fā)明中，所述的豬鏈球菌2型致病性判定標(biāo)準(zhǔn)為(1)反應(yīng)曲線呈對數(shù)增長時，Ct＜30，判定為陽性；30＜Ct＜40，判定為可疑，加大模板量重復(fù)擴(kuò)增，如果得到相同的試驗(yàn)結(jié)果，則判為陽性，否則為陰性；(2)反應(yīng)曲線為一條直線，則為陰性。對于陽性菌株，以有無MRP和EF基因作為標(biāo)準(zhǔn)來判定其致病性。MRP+EF+為強(qiáng)致病株，MRP+EF-為弱致病株，MRP-EF-為非致病株。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，取由表1所列成分組成的試劑10.5μl，加入0.5μlTaq DNA聚合酶(5U/μl)，加滅菌雙蒸水13.0μl，制備得到預(yù)混液，然后加入1μl滅活菌液或者待檢組織基因組DNA作為模板，即檢測體系體積為25μl。將各檢測體系放入實(shí)時(Real-time)PCR儀后，選擇FAM和JOE兩個熒光通道，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng)95℃預(yù)變性3min；然后采用二步法進(jìn)行反應(yīng)94℃，5s；55℃，10s，45個循環(huán)。每個循環(huán)結(jié)束后采集熒光信號。反應(yīng)結(jié)束后讀取各樣本擴(kuò)增曲線的Ct值并根據(jù)“MRP+EF+為強(qiáng)致病株、MRP+EF-為弱致病株、MRP-EF-為非致病株”的標(biāo)準(zhǔn)判定待檢樣本的致病性。


圖1圖示的是多重?zé)晒釶CR技術(shù)檢測培養(yǎng)菌液中豬鏈球菌2型毒力因子MRP基因的敏感性試驗(yàn)結(jié)果。其中曲線1-8代表PCR擴(kuò)增時加入反應(yīng)體系中的菌落數(shù)(CFU，菌落形成單位)分別為5000、1000、500、100、50、20、10、5。
圖2圖示的是多重?zé)晒釶CR技術(shù)檢測培養(yǎng)菌液中豬鏈球菌2型毒力因子EF基因的敏感性試驗(yàn)結(jié)果。其中曲線1-8代表PCR擴(kuò)增時加入反應(yīng)體系中的菌落數(shù)(CFU，菌落形成單位)分別為5000、1000、500、100、50、20、10、5。
圖3圖示的是多重?zé)晒釶CR檢測組織中豬鏈球菌2型MRP基因的敏感性試驗(yàn)結(jié)果。其中曲線1為陽性對照，曲線8為陰性對照，曲線2-7代表PCR擴(kuò)增時摻入組織中的菌落數(shù)(CFU，菌落形成單位)分別為1×104、5×103、1×103、500、100、50。
圖4圖示的是多重?zé)晒釶CR檢測組織中鏈球菌2型毒力因子EF的敏感性試驗(yàn)結(jié)果。其中，曲線-----為陽性對照；-●-●-●-代表PCR擴(kuò)增時摻入組織中的菌落數(shù)(CFU)為1×104、-◆-◆-◆-代表菌落數(shù)為5×103、-▲-▲-▲-代表菌落數(shù)為1×103、-●-●-●-代表菌落數(shù)為5×102、----代表菌落數(shù)為100、-■-■-■-代表菌落數(shù)為50、-◆-◆-◆-為陰性對照。
圖5圖示的是多重?zé)晒釶CR檢測培養(yǎng)菌液中豬鏈球菌2型毒力因子MRP的特異性試驗(yàn)結(jié)果。
圖6圖示的是多重?zé)晒釶CR技術(shù)檢測培養(yǎng)菌液中鏈球菌2型毒力因子EF的特異性試驗(yàn)結(jié)果。
圖7圖示的是多重?zé)晒釶CR檢測組織中豬鏈球菌2型毒力因子MRP的特異性試驗(yàn)結(jié)果。
圖8圖示的是多重?zé)晒釶CR檢測組織中鏈球菌2型毒力因子EF的特異性試驗(yàn)結(jié)果。
圖9圖示的是用本發(fā)明所述多重?zé)晒釶CR檢測方法對所采集扁桃體樣本進(jìn)行豬鏈球菌2型致病性檢測的結(jié)果，其中圖9A為MRP擴(kuò)增結(jié)果，圖9B為EF擴(kuò)增結(jié)果。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明的試劑及檢測方法充分利用了PCR技術(shù)的高效擴(kuò)增性、核酸雜交的良好特異性和熒光檢測技術(shù)的快速敏感性，反應(yīng)結(jié)束即時便可根據(jù)擴(kuò)增曲線判定是否含有MRP和EF兩個基因，并根據(jù)“MRP+EF+為強(qiáng)致病株、MRP+EF-為弱致病株、MRP-EF-為非致病株”的標(biāo)準(zhǔn)判定其致病性。
2.將針對豬鏈球菌2型毒力因子兩種毒力因子MRP和EF設(shè)計(jì)的引物對和探針組裝到一個熒光PCR體系中進(jìn)行多重?zé)晒釶CR檢測，且相互間沒有干擾，進(jìn)一步提高了檢測的敏感性和特異性。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而絕不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。除另有說明外，本申請中的所有科技術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。本申請中引用的任一專利、專利申請和出版物在此引入作為參考。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常采用常規(guī)條件例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的方法。
實(shí)施例實(shí)施例1引物及探針的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)豬鏈球菌2型兩種毒力因子MRP(GenBank No.X64450)和EF(GenBankNo.A24023)編碼基因的公開序列、采用探針設(shè)計(jì)軟件Beacon Designer 2.1設(shè)計(jì)引物對及探針，引物序列為MRP(正向)5’-AGACCGTCCAAAAGTACCTTACCMRP(反向)5’-CATTTGTTCCTGGTGTCGTTGG，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為80bp；所述探針的序列為5’-TGACCCAACAGAGCCAGACGAGCC該探針的5’端用報(bào)告熒光染料JOE標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料Eclipse標(biāo)記。
EF(正向)5’-ACAGTGCAGAAGCAGTAGGCEF(反向)5’-GAACATCTTGGGCGATTGAACC，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為139bp；所述探針的序列為5’-ACGCCTTTGTCCTCTGCCGATTGC該探針的5’端用報(bào)告熒光染料FAM標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料TAMRA標(biāo)記。
上述兩種探針均針對待擴(kuò)增序列間的高GC含量區(qū)。
實(shí)施例2DNA的提取
2.1菌體分離及培養(yǎng)在中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院P3實(shí)驗(yàn)室，按照CDC(中國疾病預(yù)防控制中心)推薦的豬鏈球菌分離培養(yǎng)程序進(jìn)行。采用扁桃體拭子采取待檢豬的病料，帶回實(shí)驗(yàn)室后，分別接種綿羊鮮血瓊脂平板。37℃培養(yǎng)24h后，挑取可疑菌落接種于匹克氏增菌液，37℃培養(yǎng)24h后，再接種血清肉湯，37℃搖床培養(yǎng)后，革蘭氏染色、顯微鏡檢查后，滅活備用。
2.2組織基因組DNA的提取無菌采取待檢豬及健康豬的扁桃體、肌肉等組織，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，采用QIAGEN基因組提取試劑盒(DNeasy)，按DNeasy Tissue Handbook改進(jìn)后分別提取其基因組DNA，具體步驟如下A.在無菌環(huán)境下(最好是在實(shí)驗(yàn)室生物安全柜中或超凈工作臺上進(jìn)行操作)，將采集的組織樣本(如淋巴結(jié)、扁桃體、肌肉等)除去包膜和其它結(jié)締組織，選取內(nèi)部實(shí)質(zhì)部分，置玻璃勻漿器內(nèi)充分磨成糊狀后備用。
B.將研成糊狀的20mg的動物組織放入離心管中，加180μl的buffer ATL。
C.加入20μl的蛋白酶K，利用旋渦混合器混勻，55℃孵育直至組織完全消化(為保證試驗(yàn)結(jié)果，消化時間應(yīng)保持在1小時以上，如時間允許，過夜消化)，在消化的過程中需每隔一段時間振蕩混合一次。
D.旋渦15s，在樣品中加入200μl的buffer AL，旋渦混勻，70℃孵育30min。
E.在樣品中加入200μl的無水乙醇，旋渦混勻。
F.將試劑盒中的DNeasy Mini Spin Column安置于2ml的收集管上，將上述操作E中的溶液轉(zhuǎn)移至DNeasy Mini Spin Column中，≥6000g(8000rpm)離心1min，棄去濾液和收集管。
G將DNeasy Mini Spin Column安置于新的2ml的收集管上，加入500μl buffer AW1，≥6000g(8000rpm)離心1min，棄去濾液和收集管。
H.將DNeasy Mini Spin Column安置于新的2ml的收集管上，加入500μl buffer AW2，≥20000g(14000rpm)離心3min使DNeasy膜完全干燥，棄去濾液和收集管。
I.將DNeasy Mini Spin Column安置于新的1.5ml的收集管上，將100μl buffer AE直接加至DNeasy膜上，室溫孵育1min，≥6000g(8000rpm)離心1min洗脫DNA。
實(shí)施例3實(shí)時(Real-time)PCR擴(kuò)增方法的建立3.1PCR反應(yīng)體系將引物對和探針采用滅菌雙蒸水進(jìn)行溶解，MRP/EF上、下游引物濃度為20mM，不同標(biāo)記的MRP/EF探針濃度為10mM。然后按照如下比例配制反應(yīng)預(yù)混液20mM MRP/EF上、下游引物各0.5μl，探針各0.5μl，10×PCR緩沖液(Mg2+Free)2.5μl，25mM MgCl23.0μl，2.5mM dNTP 2μl，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 使用前，取上述預(yù)混液10.5μl，加入5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl，然后加入1μl待檢組織基因組DNA作為模板，加滅菌雙蒸水使體積至25μl。
3.2PCR反應(yīng)條件將樣品管放入Bio-Rad公司iCycler IQ Real-time PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng)95℃預(yù)變性3min；然后采用二步法進(jìn)行反應(yīng)94℃，5s；55℃，10s，45個循環(huán)。每個循環(huán)結(jié)束后采集數(shù)據(jù)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
實(shí)施例4豬鏈球菌2型感染的多重?zé)晒釶CR方法的敏感性確定4.1多重?zé)晒釶CR檢測培養(yǎng)菌液的敏感性試驗(yàn)以豬鏈球菌2型四川株(由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)培養(yǎng)菌液作為待檢菌液，計(jì)數(shù)后，采用血清肉湯培養(yǎng)液按照如下梯度稀釋后，直接進(jìn)行菌液PCR，熒光PCR擴(kuò)增后，分析Ct值，以Ct＝40作為檢測低限，確定本方法可以檢測的最少菌數(shù)。
表2.用于豬鏈球菌2型檢測的熒光PCR方法的敏感性實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)菌液濃度(CFU/μl)

4.2多重?zé)晒釶CR檢測組織中豬鏈球菌2型感染的敏感性試驗(yàn)按照試劑盒組織用量說明，分別稱取10mg扁桃體組織，在其中分別加入如下表所述的計(jì)數(shù)后的豬鏈球菌2型培養(yǎng)菌液，按照DNA提取試劑盒操作提取其中的基因組DNA，并取1μl作為模板進(jìn)行多重?zé)晒釶CR，PCR同時設(shè)置陽性和陰性對照。擴(kuò)增后，分析Ct值，以Ct＝40作為檢測低限，確定本方法可以檢測的組織中最低豬鏈球菌2型的數(shù)量。
表3.熒光PCR檢測豬鏈球菌2型感染的敏感性實(shí)驗(yàn)的組織中對應(yīng)菌數(shù)(CFU/μl)

試驗(yàn)結(jié)果多重?zé)晒釶CR技術(shù)檢測培養(yǎng)菌液中豬鏈球菌2型毒力因子MRP基因的敏感性試驗(yàn)的結(jié)果如圖1所示。自圖1中可以看出，第6管的Ct值為37.2，低于預(yù)設(shè)的Ct＝40的檢測限，按照取樣1μl計(jì)算，即采用本研究所建立的實(shí)時PCR方法單獨(dú)檢測MRP基因的敏感性為20CFU。
多重?zé)晒釶CR技術(shù)檢測培養(yǎng)菌液中豬鏈球菌2型毒力因子EF的敏感性試驗(yàn)的結(jié)果如圖2所示。自圖2中可以看出，第7管的Ct值為36.2，低于預(yù)設(shè)的Ct＝40的檢測限，按照取樣1μl計(jì)算，即采用本研究所建立的多重?zé)晒釶CR方法檢測培養(yǎng)液中豬鏈球菌2型EF基因的敏感性為10CFU。
多重?zé)晒釶CR技術(shù)檢測組織中豬鏈球菌2型MRP基因的敏感性試驗(yàn)的結(jié)果如圖3所示。自圖3中可以看出，第6管的Ct值為34.3，低于預(yù)設(shè)的Ct＝40的檢測限，按照取樣1μl計(jì)算，即采用本研究所建立的多重?zé)晒釶CR方法檢測MRP基因的敏感性為100CFU。
多重?zé)晒釶CR技術(shù)檢測組織中豬鏈球菌2型毒力因子EF的敏感性試驗(yàn)的結(jié)果如圖4所示。自圖4中可以看出，第7管的Ct值為34.0，低于預(yù)設(shè)的Ct＝40的檢測限，按照取樣1μl計(jì)算，即采用本研究所建立的多重?zé)晒釶CR方法檢測組織中豬鏈球菌2型EF基因的敏感性為50CFU。
實(shí)施例5豬鏈球菌2型感染的多重?zé)晒釶CR檢測方法特異性確定5.1多重?zé)晒釶CR檢測培養(yǎng)菌液的特異性試驗(yàn)以馬鏈球菌獸疫亞種、無乳鏈球菌、糞鏈球菌(這三種菌株購自中國獸藥監(jiān)察所)和豬霍亂沙門氏菌、豬多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌作為陰性對照，以豬鏈球菌2型四川株作為陽性對照，按照本研究建立的方法進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無判定本方法是否是檢測豬鏈球菌2型感染的特異性方法。
5.2多重?zé)晒釶CR檢測組織中豬鏈球菌2型感染的特異性試驗(yàn)采用正常組織基因組DNA作為空白對照，以在扁桃體組織中定量加入馬鏈球菌獸疫亞種、無乳鏈球菌、糞鏈球菌和大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌等菌株后提取的DNA作為陰性對照，以加入豬鏈球菌2型四川株的扁桃體組織作為陽性樣品，進(jìn)行多重?zé)晒釶CR，以檢驗(yàn)本研究所建立方法的特異性。
試驗(yàn)結(jié)果以馬鏈球菌獸疫亞種、無乳鏈球菌、糞鏈球菌和大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌等菌株作為陰性對照，以豬鏈球菌2型四川株作為陽性對照，按照本研究建立的方法進(jìn)行豬鏈球菌2型毒力因子MRP和EF的多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增。對培養(yǎng)菌液中MRP基因的擴(kuò)增曲線分析表明，只有陽性對照有明顯的擴(kuò)增曲線，而其它幾個對照菌株均沒有擴(kuò)增(見圖5)，說明本研究所建立方法具有高度的特異性，適合應(yīng)用于培養(yǎng)菌液中豬鏈球菌2型毒力因子MRP的檢測。
以馬鏈球菌獸疫亞種、無乳鏈球菌、糞鏈球菌和大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌等菌株作為陰性對照，以豬鏈球菌2型四川株作為陽性對照，按照本研究建立的方法進(jìn)行豬鏈球菌2型毒力因子MRP和EF的多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增。對EF基因的擴(kuò)增曲線分析表明，只有陽性對照有明顯的擴(kuò)增曲線，而其它幾個對照菌株均沒有擴(kuò)增(見圖6)，說明本研究所建立方法具有高度的特異性，適合應(yīng)用于培養(yǎng)菌液中豬鏈球菌2型毒力因子EF的聯(lián)合檢測。
以馬鏈球菌獸疫亞種、無乳鏈球菌、糞鏈球菌和大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌等菌株作為陰性對照，以豬鏈球菌2型四川株作為陽性對照，按照本研究建立的方法進(jìn)行豬鏈球菌2型毒力因子MRP和EF的多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增。對組織中MRP基因的擴(kuò)增曲線分析表明，只有陽性對照有明顯的擴(kuò)增曲線，而其它幾個對照菌株均沒有擴(kuò)增(見圖7)，說明本研究所建立方法具有高度的特異性，適合應(yīng)用于組織中豬鏈球菌2型毒力因子MRP的檢測。
以馬鏈球菌獸疫亞種、無乳鏈球菌、糞鏈球菌和大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌等菌株作為陰性對照，以豬鏈球菌2型四川株作為陽性對照，按照本研究建立的方法進(jìn)行豬鏈球菌2型毒力因子MRP和EF的多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增。對EF基因的擴(kuò)增曲線分析表明，只有陽性對照有明顯的擴(kuò)增曲線，而其它幾個對照菌株均沒有擴(kuò)增(見圖8)，說明本研究所建立方法具有高度的特異性，適合應(yīng)用于組織中豬鏈球菌2型毒力因子EF的聯(lián)合檢測。
結(jié)果判定方法反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動給出每個樣品的Ct值。記錄Ct值，分析檢測結(jié)果。如果反應(yīng)曲線呈對數(shù)增長，而且Ct＜30，則表明為陽性；如果30＜Ct＜40，判為可疑，可以加大模板量再重復(fù)擴(kuò)增，根據(jù)結(jié)果得到重復(fù)，則判為陽性，否則為陰性；如果反應(yīng)曲線為一條直線，則為陰性。對于陽性菌株，以有無MRP和EF基因作為標(biāo)準(zhǔn)來判定其致病性。MRP+EF+為強(qiáng)致病株，MRP+EF-為弱致病株，MRP-EF-為非致病株。
實(shí)施例6北京市某屠宰場扁桃體樣品85份，按照實(shí)施例2.2中所述方法提取組織基因組DNA后用ddH2O溶解。在各檢測管內(nèi)加入10.5μl表1所示的致病性檢測試劑、0.5μl聚合酶、13μlddH2O，加入1μl上述提取的待檢DNA，反應(yīng)同時設(shè)置摻入豬鏈球菌2型(四川株)菌液的扁桃體提取的DNA 1μl作為模板進(jìn)行的陽性對照和以ddH2O作為陰性對照。
將樣品管放入熒光PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng)95℃預(yù)變性3min；然后采用二步法進(jìn)行反應(yīng)94℃ 5s；55℃ 10s，40個循環(huán)。每個循環(huán)結(jié)束后采集熒光信號，反應(yīng)結(jié)束后儀器自動給出Ct值。分析Ct值發(fā)現(xiàn)，陽性樣本的MRP擴(kuò)增曲線的Ct值為21.5(圖9A)，EF為21.9(圖9B)，陰性對照沒有擴(kuò)增曲線，表明試驗(yàn)成立；各樣本均沒有明顯擴(kuò)增曲線，表明各樣本均沒有檢出豬鏈球菌2型毒力因子MRP和EF，即所采集的所有扁桃體均不攜帶有豬鏈球菌2型。
序列表<110>中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動植物檢疫研究所<120>應(yīng)用于豬鏈球菌2型致病性檢測的多重?zé)晒釶CR檢測試劑及方法<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(23)<223>
<400>1agaccgtcca aaagtacctt acc 23<210>2
<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(22)<223>
<400>2catttgttcc tggtgtcgtt gg 22<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>探針<222>(1)..(24)<223>
<400>3tgacccaaca gagccagacg agcc 24<210>4
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(20)<223>
<400>4acagtgcaga agcagtaggc 20<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(22)<223>
<400>5gaacatcttg ggcgattgaa cc 22<210>6
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>探針<222>(1)..(24)<223>
<400>6acgcctttgt cctctgccga ttgc 2權(quán)利要求
1.一種用于豬鏈球菌2型致病性檢測的多重實(shí)時熒光PCR檢測試劑，該試劑包括分別特異性地針對豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)編碼基因的引物對及探針，其中所述的引物對及探針混合或各自獨(dú)立地存在于該檢測試劑中。
2.權(quán)利要求1所述的多重實(shí)時熒光PCR檢測試劑，其中所述的特異性地針對MRP編碼基因的引物對及探針的核苷酸序列為MRP引物(正向)5’-AGACCGTCCAAAAGTACCTTACCMRP引物(反向)5’-CATTTGTTCCTGGTGTCGTTGGMRP探針5’-TGACCCAACAGAGCCAGACGAGCCMRP探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料JOE，3’端標(biāo)記有淬滅熒光染料Eclipse；所述的特異性地針對EF編碼基因的引物對和探針的核苷酸序列為EF引物(正向)5’-ACAGTGCAGAAGCAGTAGGCEF引物(反向)5’-GAACATCTTGGGCGATTGAACCEP探針5’-ACGCCTTTGTCCTCTGCCGATTGCEP探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料FAM，3’端標(biāo)記有淬滅熒光染料TAMRA。
3.權(quán)利要求1或2所述的多重實(shí)時熒光PCR檢測試劑，該試劑中進(jìn)一步還包括PCR擴(kuò)增用的PCR緩沖液、MgCl2和dNTP。
4.權(quán)利要求3所述的多重實(shí)時熒光PCR檢測試劑，該試劑為由下列成分組成的混合液10X PCR緩沖液 2.5μl20mM MRP引物(正向)0.5μl20mM MRP引物(反向)0.5μl10mM MRP探針 0.5μl20mM EF引物(正向) 0.5μl20mM EF引物(反向) 0.5μl10mM EF探針 0.5μl25mM MgCl23.0μl2.5mM dNTP2.0μl
5.一種用于豬鏈球菌2型致病性檢測的多重實(shí)時熒光PCR檢測方法，該方法包括下列步驟1)使用特異性地針對MRP和EF的引物對及熒光素標(biāo)記探針，與PCR擴(kuò)增用的dNTP、PCR緩沖液及聚合酶混合，得到檢測預(yù)混液；2)向步驟1)得到的檢測預(yù)混液中加入待檢菌液或從待檢組織提取的基因組DNA作為擴(kuò)增模板；3)將步驟2)中建立的擴(kuò)增反應(yīng)體系置于熒光PCR儀上；4)根據(jù)探針標(biāo)記的報(bào)告熒光類型，選擇對應(yīng)的熒光通道，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，記錄各檢測樣本的PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct)；5)根據(jù)各樣本的反應(yīng)Ct值，按照豬鏈球菌2型致病性判定標(biāo)準(zhǔn)判定待檢樣本中豬鏈球菌2型的致病性。
6.權(quán)利要求5所述的多重實(shí)時熒光PCR檢測方法，該方法使用權(quán)利要求2所述的MRP引物對及探針和EF引物對及探針。
7.權(quán)利要求5所述的多重實(shí)時熒光PCR檢測方法，其中熒光PCR擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性3min；然后采用二步法進(jìn)行反應(yīng)94℃，5s；55℃，10s，45個循環(huán)。
8.權(quán)利要求5所述的多重實(shí)時熒光PCR檢測方法，其中所述的豬鏈球菌2型致病性判定標(biāo)準(zhǔn)為(1)反應(yīng)曲線呈對數(shù)增長時，Ct＜30，判定為陽性；30＜Ct＜40，判定為可疑，加大模板量重復(fù)擴(kuò)增，得到相同的試驗(yàn)結(jié)果，則判為陽性，否則為陰性；(2)反應(yīng)曲線為一條直線，則為陰性；對于陽性菌株，以有無MRP和EF基因作為標(biāo)準(zhǔn)來判定其致病性，MRP+EF+為強(qiáng)致病株，MRP+EF-為弱致病株，MRP-EF-為非致病株。
全文摘要
本發(fā)明涉及多重?zé)晒釶CR檢測豬鏈球菌2型致病性的試劑及方法。更具體地說，本發(fā)明提供了同時應(yīng)用針對豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)兩種毒力因子編碼基因設(shè)計(jì)的熒光PCR引物和探針序列進(jìn)行豬鏈球菌2型致病性檢測的試劑和方法。本發(fā)明采用針對MRP和EF兩個基因設(shè)計(jì)的引物和探針，通過對目的基因序列和標(biāo)記熒光基團(tuán)的選擇和反應(yīng)體系、反應(yīng)條件的優(yōu)化，組裝了檢測豬鏈球菌2型致病性的試劑，建立了對豬鏈球菌2型菌株致病性進(jìn)行檢測的多重?zé)晒釶CR方法，根據(jù)擴(kuò)增曲線即可判定待檢菌的致病性。
文檔編號C12Q1/68GK1908191SQ200610090148
公開日2007年2月7日 申請日期2006年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月29日
發(fā)明者林祥梅, 吳紹強(qiáng), 韓雪清, 劉建, 梅琳, 賈廣樂 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動植物檢疫研究所