專利名稱：神經(jīng)干細(xì)胞三維立體培養(yǎng)體外擴(kuò)增的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，特別是涉及了一種神經(jīng)干細(xì)胞三維立體培養(yǎng)體外擴(kuò)增的方法。
背景技術(shù)：
長期以來，利用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞克隆技術(shù)，從胚胎或胎腦分離純化神經(jīng)干細(xì)胞技術(shù)已基本完善，但體外長期培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞體外擴(kuò)增問題仍然未解決，采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法不僅培養(yǎng)出的神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量少，而且成活率低，很難滿足臨床的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種神經(jīng)干細(xì)胞三維立體培養(yǎng)體外擴(kuò)增的方法。
為了實(shí)現(xiàn)這一發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種神經(jīng)干細(xì)胞三維立體培養(yǎng)體外擴(kuò)增的方法，它包括選擇具有三維立體環(huán)境的多孔微載體；對微載體進(jìn)行預(yù)處理，其中它還包括以下步驟(1)將含有40-60ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、40-60ng/ml表皮細(xì)胞生長因子(EGF)和B27的DMEM/F12神經(jīng)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液包被上述的微載體，使促進(jìn)細(xì)胞分裂的堿性成纖維細(xì)胞生長因子和表皮細(xì)胞生長因子均勻地滲透于微載體內(nèi)；(2)將上述處理好的微載體放入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入上述神經(jīng)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液，然后在培養(yǎng)瓶加入1×105-1×106個神經(jīng)干細(xì)胞，混合均勻后，再充入含有5％濃度的二氧化碳?xì)怏w，并在37℃左右的恒溫下進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞的增殖情況，每5-7天更換神經(jīng)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液；(3)將長滿神經(jīng)干細(xì)胞的微載體從培養(yǎng)瓶中取出，放入含有0.05％胰蛋白酶的D-hank’s緩沖液中，在室溫下消化10-30分鐘，去除微載體，漂洗細(xì)胞，得到神經(jīng)干細(xì)胞；本發(fā)明提供了一種神經(jīng)干細(xì)胞三維立體培養(yǎng)體外擴(kuò)增的方法，其中所述微載體的預(yù)處理是將1份的微載體放入100份的PBS緩沖液中，在室溫下浸泡20-40分鐘，同時不時顛倒微載體，使微載體與緩沖液充分接觸，然后在120℃左右的溫度和0.11兆帕左右的壓力下，將上述微載體消毒15-30分鐘，再將上述微載體用PBS緩沖液洗滌兩次，用無血清培養(yǎng)液洗滌一次后，將上述微載體置于4℃左右的冰箱中過夜；本發(fā)明提供了一種神經(jīng)干細(xì)胞三維立體培養(yǎng)體外擴(kuò)增的方法，其中所述PBS緩沖液的PH值為7.4左右。
本發(fā)明與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明是在傳統(tǒng)神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上，使用具有三維立體環(huán)境的多孔微載體，這樣有助于擴(kuò)大培養(yǎng)面積，并且采用含有40～60ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子、40～60ng/ml表皮細(xì)胞生長因子和B27的DMEM/F12神經(jīng)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液包被微載體，可使促進(jìn)細(xì)胞增殖分裂的堿性成纖維細(xì)胞生長因子和表皮細(xì)胞生長因子均勻滲透于微載體內(nèi)，改善細(xì)胞生存的微環(huán)境，有利于神經(jīng)干細(xì)胞增殖分裂，達(dá)到神經(jīng)干細(xì)胞體外擴(kuò)增的目的。


圖1為未接種細(xì)胞的微載體的顯微放大圖；圖2為接種神經(jīng)干細(xì)胞的微載體的顯微放大圖；圖3為從微載體內(nèi)向外增殖的神經(jīng)干細(xì)胞的顯微放大圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞三維立體培養(yǎng)體外擴(kuò)增的方法包括選擇具有三維立體環(huán)境的多孔微載體，例如選擇瑞典Amersham Biosciences公司的CytoporeTM2微載體；對微載體進(jìn)行預(yù)處理，如將1g的微載體放入100ml的PBS緩沖液中，在室溫下浸泡30分鐘，同時不時顛倒微載體，使微載體與緩沖液充分接觸，然后在120℃左右的溫度和0.11兆帕左右的壓力下，將上述微載體消毒20分鐘，再將上述微載體用PH值為7.4左右的PBS緩沖液洗滌兩次，用無血清培養(yǎng)液洗滌一次后，將上述微載體置于4℃左右的冰箱中過夜；將含有50ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、45ng/ml表皮細(xì)胞生長因子(EGF)和B27(商品名稱)的DMEM/F12神經(jīng)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液包被上述的微載體，使促進(jìn)細(xì)胞分裂的堿性成纖維細(xì)胞生長因子和表皮細(xì)胞生長因子均勻地滲透于微載體內(nèi)；B27(商品名稱)的用量可以根據(jù)產(chǎn)品說明書的介紹進(jìn)行添加。
將上述處理好的微載體放入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入上述神經(jīng)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液，然后在培養(yǎng)瓶加入1×105-1×106個神經(jīng)干細(xì)胞，混合均勻后，再充入含有5％濃度的二氧化碳?xì)怏w，并在37℃左右的恒溫下進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞的增殖情況，每5-7天更換神經(jīng)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液；將長滿神經(jīng)干細(xì)胞的微載體從培養(yǎng)瓶中取出，放入含有0.05％胰蛋白酶的D-hank’s緩沖液中，在室溫下消化20分鐘，去除微載體，漂洗細(xì)胞，得到神經(jīng)干細(xì)胞。
圖1和圖2分別為未接種細(xì)胞的微載體和已接種神經(jīng)干細(xì)胞的微載體的顯微放大圖，從這兩個圖的對比中，可以看出神經(jīng)干細(xì)胞在微載體內(nèi)生長的狀態(tài)。從圖3中可以更清楚地看出神經(jīng)干細(xì)胞從微載體內(nèi)向外增殖的狀態(tài)。
以上描述是對本發(fā)明的解釋，不是對發(fā)明的限定，本發(fā)明所限定的范圍參見權(quán)利要求，在不違背本發(fā)明的精神的情況下，本發(fā)明可以作任何形式的修改。
權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)干細(xì)胞三維立體培養(yǎng)體外擴(kuò)增的方法，它包括選擇具有三維立體環(huán)境的多孔微載體；對微載體進(jìn)行預(yù)處理，其特征在于它還包括以下步驟(1)將含有40-60ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、40-60ng/ml表皮細(xì)胞生長因子(EGF)和B27的DMEM/F12神經(jīng)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液包被上述的微載體，使促進(jìn)細(xì)胞分裂的堿性成纖維細(xì)胞生長因子和表皮細(xì)胞生長因子均勻地滲透于微載體內(nèi)；(2)將上述處理好的微載體放入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入上述神經(jīng)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液，然后在培養(yǎng)瓶加入1×105-1×106個神經(jīng)干細(xì)胞，混合均勻后，再充入含有5％濃度的二氧化碳?xì)怏w，并在37℃左右的恒溫下進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞的增殖情況，每5-7天更換神經(jīng)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液；(3) 將長滿神經(jīng)干細(xì)胞的微載體從培養(yǎng)瓶中取出，放入含有0.05％胰蛋白酶的D-hank’s緩沖液中，在室溫下消化10-30分鐘，去除微載體，漂洗細(xì)胞，得到神經(jīng)干細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)干細(xì)胞三維立體培養(yǎng)體外擴(kuò)增的方法，其特征在于所述微載體的預(yù)處理是將1份的微載體放入100份的PBS緩沖液中，在室溫下浸泡20-40分鐘，同時不時顛倒微載體，使微載體與緩沖液充分接觸，然后在120℃左右的溫度和0.11兆帕左右的壓力下，將上述微載體消毒15-30分鐘，再將上述微載體用PBS緩沖液洗滌兩次，用無血清培養(yǎng)液洗滌一次后，將上述微載體置于4℃左右的冰箱中過夜。
3.權(quán)利要求2所述的神經(jīng)干細(xì)胞三維立體培養(yǎng)體外擴(kuò)增的方法，其特征在于所述PBS緩沖液的PH值為7.4左右。
全文摘要
本發(fā)明涉及神經(jīng)干細(xì)胞三維立體培養(yǎng)體外擴(kuò)增的方法，它包括選擇具有三維立體環(huán)境的微載體，對微載體進(jìn)行預(yù)處理，然后用含有40－60ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長因子、40－60ng/ml表皮細(xì)胞生長因子和B27的DMEM/F12神經(jīng)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液包被上述的微載體，再在培養(yǎng)瓶加入1×10
文檔編號C12N5/08GK101092606SQ20061009002
公開日2007年12月26日 申請日期2006年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月23日
發(fā)明者蔡哲, 潘琳, 張嵐, 舒峻, 房青 申請人:中日友好醫(yī)院