本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種運(yùn)用臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和環(huán)孢素A以及維生素B₁₂復(fù)合藥阻斷人類(lèi)發(fā)散性帕金森疾病淋巴細(xì)胞的細(xì)胞周期應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大約90 %的帕金森患者屬于散發(fā)性帕金森，平均年齡大約60歲，持續(xù)15年左右。到目前為止，治療帕金森疾病的臨床措施主要是對(duì)癥治療------用左旋多巴或多巴胺激動(dòng)劑補(bǔ)充腦部缺失的多巴胺，然而，長(zhǎng)期的多巴胺替代藥物療法卻極易引發(fā)患者的副作用，例如：動(dòng)作遲緩?？梢哉f(shuō)，能夠用于臨床上治療帕金森的藥物是極其有限，而且藥效也不是很理想，只能稍微緩解帕金森患者的初期癥狀，不能完全阻止疾病的進(jìn)展，臨床的治愈可能幾乎為零。因此，開(kāi)發(fā)新的神經(jīng)保護(hù)藥物用于阻斷或減緩帕金森疾病進(jìn)程就顯得至關(guān)重要，我們把目光放在臍血源神經(jīng)干細(xì)胞藥物上。

臍血源神經(jīng)干細(xì)胞用于治療人類(lèi)帕金森疾病是非常有前景的，這屬于一種利用細(xì)胞療法對(duì)人類(lèi)神經(jīng)退行性疾病的治療方案。臍血因其具有胚胎細(xì)胞的特性，所以它可以分化成神經(jīng)干細(xì)胞。臍帶血多能干細(xì)胞是一種發(fā)現(xiàn)較晚的一類(lèi)臍帶血干細(xì)胞。臍血源神經(jīng)干細(xì)胞與其他來(lái)源的干細(xì)胞相比具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：首先，來(lái)源充足，易于分離，純度高，無(wú)腫瘤細(xì)胞污染，并且具有很強(qiáng)的增殖能力；其次，不涉及倫理道德問(wèn)題，易于產(chǎn)業(yè)化制備；再次，對(duì)捐贈(zèng)者無(wú)任何危害和損傷；最后，避免像其它來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞移植那樣產(chǎn)生異體的免疫反應(yīng)，也就是我們常說(shuō)的移植物抗宿主反應(yīng)。

帕金森患者的發(fā)病機(jī)理是由于體內(nèi)紋狀體和黒質(zhì)部位嚴(yán)重缺少多巴胺能神經(jīng)元，試想如果能夠適時(shí)適量補(bǔ)給機(jī)體損失的細(xì)胞，一定就會(huì)對(duì)病情起到緩解乃至達(dá)到治愈的作用。細(xì)胞療法是指用細(xì)胞或組織移植來(lái)達(dá)到治療損傷機(jī)體的目的，該方法安全可靠。臍血源神經(jīng)干細(xì)胞作為一類(lèi)具有多分化潛能和自我更新能力的細(xì)胞，一旦植入帕金森患者體內(nèi)，就能夠在損傷區(qū)域分化為具有修復(fù)功能的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞，并與宿主神經(jīng)進(jìn)行有機(jī)整合，逐步恢復(fù)損傷的神經(jīng)功能。未分化的臍血源神經(jīng)干細(xì)胞主要是利用本身的環(huán)境富集作用，在帕金森疾病發(fā)生的相應(yīng)部位起到消除有毒物質(zhì)，進(jìn)而進(jìn)行腦損傷組織的修復(fù)再生，以此創(chuàng)建輔助的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。細(xì)胞療法用于帕金森疾病的治療將會(huì)是一種有效的治療手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是彌補(bǔ)現(xiàn)有藥物治療手段的不足之處，臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和環(huán)孢素A以及VB12復(fù)合藥具有阻斷發(fā)散性帕金森患者淋巴細(xì)胞的細(xì)胞周期的活性，具有廣泛的應(yīng)用前景，可能成為臨床上治療帕金森疾病的潛在治療手段。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種阻斷帕金森患者淋巴細(xì)胞周期的藥物，其特征在于：由以下組分組成，1X10⁶細(xì)胞/ml臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和20-60ng/ml環(huán)孢素A以及2-10 ng/ml 維生素B₁₂。

本發(fā)明由以下組分組成，1X10⁶細(xì)胞/ml臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和50ng/ml環(huán)孢素A以及4ng/ml 維生素B₁₂。

本發(fā)明由以下步驟組成，淋巴細(xì)胞接種于含有10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃，5 ％ CO₂培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)；待淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)到70-80 %，用1X10⁶/ml臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和50 ng/ml環(huán)孢素A以及4 ng/ml維生素B₁₂培養(yǎng)24 h即可。

DMEM培養(yǎng)基是 dulbecco's modified eagle medium的縮寫(xiě)；

DMEM的特性：

(1)氨基酸含量為依格爾培養(yǎng)基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等;

(2)維生素含量為依格爾培養(yǎng)基的4倍;

(3)含有糖酵解途徑中的重要物質(zhì)------丙酮酸;

(4)含有微量的鐵離子。

環(huán)孢素A是由11個(gè)氨基酸組成的環(huán)狀多肽類(lèi)物質(zhì)，它是一種選擇性作用于機(jī)體T淋巴細(xì)胞的強(qiáng)效免疫抑制劑，臨床上主要用于肝、腎以及心臟移植的抗排異反應(yīng)，也可與腎上腺皮質(zhì)激素同用，治療患者的免疫系統(tǒng)疾病。維生素B12（VB12）為B族維生素之一，是一類(lèi)含鈷的復(fù)雜有機(jī)化合物。VB12是神經(jīng)系統(tǒng)功能健全不可缺少的維生素，參與神經(jīng)組織中一種脂蛋白的形成，當(dāng)機(jī)體內(nèi)缺乏VB12時(shí)，可引起神經(jīng)障礙，脊髓變性以及周?chē)窠?jīng)炎，臨床表現(xiàn)有患者的情緒異常，表情呆滯以及反應(yīng)遲鈍等等。

以下是本發(fā)明針對(duì)某醫(yī)院康復(fù)科室診斷20名患者為散發(fā)性帕金森疾病的病人做出的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，其中：12男，8女，選擇20名年齡相仿的健康人作為對(duì)照組，對(duì)照組是帕金森患者的家人或者看護(hù)者，分別從散發(fā)性帕金森疾病和健康人中的外周血樣中分離純化淋巴細(xì)胞。

1）、增殖能力檢測(cè)：用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100 μl/孔），將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間（37 ℃，5 % CO₂）。向每孔加入10 μl CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)），將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

2）、細(xì)胞周期檢測(cè)：首先，收集每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的淋巴細(xì)胞，并用70 %乙醇固定并使細(xì)胞透化；然后，用PBS沖洗細(xì)胞，并用0.5 ml含有20 U/ml RNase的50 μg/ml PI溶液孵育30 min；最后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

（1）樣品制備

收集細(xì)胞，1000 rpm，離心5 min。棄上清，加入適量1 × PBS溶液，并用加樣槍輕輕吹打，洗滌，然后1000 rpm，離心5 min；棄上清，1 × PBS溶液重新洗滌一次，然后1000 rpm，離心5 min；棄上清，加入RIPA裂解液（含有蛋白酶抑制劑PMSF），在冰上裂解細(xì)胞30 min（裂解過(guò)程中，經(jīng)常彈一彈離心管，保證細(xì)胞完全裂解）。4 ℃，12000 rpm，離心5 min，收集細(xì)胞，將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加6 × loading buffer。沸水浴加熱10 min，10000 g，離心10 min，取上清，-20 ℃保存1個(gè)月。用BCA法，測(cè)定每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞總蛋白含量。

（2） SDS-PAGE電泳

用SDS-PAGE電泳分離蛋白。首先，清洗電泳槽和玻璃板，分別灌分離膠和濃縮膠以及插梳子，上樣。然后，80 V電泳，溴酚藍(lán)指示劑跑至濃縮膠底端，分離膠的前緣；120 V電泳，溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠底部，停止電泳。最后，取膠，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求切膠，為電轉(zhuǎn)移做準(zhǔn)備。

（3）電轉(zhuǎn)移

PVDF轉(zhuǎn)膜。首先，準(zhǔn)備夾心層（陰極塑料夾板-濾紙-凝膠-PVDF-濾紙-陽(yáng)極塑料夾板），注意PVDF做好標(biāo)記，例如：減去左上角。然后，裝好電轉(zhuǎn)移裝置，電泳，4 ℃，100 V，2 h。最后，取出PVDF，準(zhǔn)備封閉。

（4）抗體反應(yīng)和顯色反應(yīng)

首先，在室溫條件下，加入封閉液，封閉2 h，在這一過(guò)程中，要求蛋白面向上；或者，在4 ℃條件下，封閉過(guò)夜。然后，輕輕在1 × TBST中漂洗一下，加一抗，在室溫條件下，孵育2 h；1 × TBST，漂洗三次，每次5-15 min；加二抗，孵育和漂洗情況與一抗相同。最后，在暗室中，取出膜，稍微瀝干， ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行發(fā)光，顯影，以及最后的定影。用Image J進(jìn)行蛋白質(zhì)分析。

統(tǒng)計(jì)方法：所有結(jié)果用mean ± SEM表示。使用ANOVA方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，它屬于Tukey 的一種多重比較法。當(dāng)P < 0.05時(shí)，結(jié)果有顯著性差異，

細(xì)胞增殖能力結(jié)果。

利用CCK-8檢測(cè)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，帕金森患者淋巴細(xì)胞的細(xì)胞增殖率增加，臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和環(huán)孢素A以及VB12復(fù)合藥減低散發(fā)性帕金森患者淋巴細(xì)胞的增殖能力比左旋多巴組明顯，結(jié)果提示臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和環(huán)孢素A以及VB12復(fù)合藥能夠顯著減低散發(fā)性帕金森患者淋巴細(xì)胞的增殖（圖1）。

LDH是一種穩(wěn)定的細(xì)胞質(zhì)酶，當(dāng)細(xì)胞膜被破壞時(shí)，LDH會(huì)迅速釋放到培養(yǎng)基中，因此，我們可以用培養(yǎng)基中LDH的活性來(lái)表征細(xì)胞的壞死程度。帕金森患者淋巴細(xì)胞組與對(duì)照組相比，LDH的活性明顯增加，這說(shuō)明帕金森患者淋巴細(xì)胞處于損傷嚴(yán)重的狀態(tài)。臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和環(huán)孢素A以及VB12復(fù)合藥降低帕金森患者淋巴細(xì)胞所升高的LDH水平比左旋多巴組明顯（圖2）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和環(huán)孢素A以及VB12復(fù)合藥能夠明顯降低帕金森患者淋巴細(xì)胞所升高的LDH水平。

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，以此驗(yàn)證臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和環(huán)孢素A以及VB12復(fù)合藥阻滯帕金森患者淋巴細(xì)胞的細(xì)胞周期。帕金森患者淋巴細(xì)胞組，細(xì)胞的周期活動(dòng)主要集中在G1期； 臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和環(huán)孢素A以及VB12復(fù)合藥組和左旋多巴組，都使細(xì)胞的周期活動(dòng)明顯集中在S期，且臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和環(huán)孢素A以及VB12復(fù)合藥恢復(fù)效果好（圖3）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和環(huán)孢素A以及VB12復(fù)合藥能夠明顯阻滯帕金森患者淋巴細(xì)胞的G1/S期。

用Western blot檢測(cè)Cyclin D3蛋白含量，進(jìn)一步確定臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和環(huán)孢素A以及VB12復(fù)合藥阻滯帕金森患者淋巴細(xì)胞的細(xì)胞周期。Cyclin D3是參與G1/S期的標(biāo)志性節(jié)點(diǎn)蛋白。帕金森患者淋巴細(xì)胞組，Cyclin D3的蛋白表達(dá)明顯升高；臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和環(huán)孢素A以及VB12復(fù)合藥降低Cyclin D3蛋白表達(dá)的能力高于左旋多巴組（圖4）。Western blot與流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和環(huán)孢素A以及VB12復(fù)合藥能夠明顯阻滯帕金森患者淋巴細(xì)胞G1/S期的Cyclin D3蛋白表達(dá)。

一種阻斷帕金森患者淋巴細(xì)胞周期的藥物簡(jiǎn)稱復(fù)合藥物。

本發(fā)明的有益效果是：到目前為止，對(duì)于帕金森疾病的治療只是對(duì)癥治療，不能根除病因，本發(fā)明是一種新型的臨床上治療帕金森疾病的新藥物組合，能夠明顯降低帕金森患者淋巴細(xì)胞所升高的LDH水平。

附圖說(shuō)明

圖1是臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和環(huán)孢素A以及VB12復(fù)合藥對(duì)于散發(fā)性帕金森患者淋巴細(xì)胞的細(xì)胞增殖的影響。

數(shù)據(jù)代表± SEM。n=3。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

圖2是臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和環(huán)孢素A以及VB12復(fù)合藥對(duì)于散發(fā)性帕金森患者淋巴細(xì)胞的LDH的影響。

數(shù)據(jù)代表± SEM。n=3。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

圖3是流式細(xì)胞儀分析臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和環(huán)孢素A以及VB12復(fù)合藥對(duì)于散發(fā)性帕金森患者淋巴細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響。

數(shù)據(jù)代表± SEM。n=3。

圖4是Western blot分析臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和環(huán)孢素A以及VB12復(fù)合藥對(duì)于散發(fā)性帕金森患者淋巴細(xì)胞的Cyclin D3蛋白表達(dá)的影響。

數(shù)據(jù)代表± SEM。n=3。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001 vs. 對(duì)照組；#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001 vs. 散發(fā)性帕金森患者淋巴細(xì)胞組。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1X10⁶細(xì)胞/ml臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和20ng/ml環(huán)孢素A以及2ng/ml 維生素B₁₂。

實(shí)施例2

1X10⁶細(xì)胞/ml臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和50ng/ml環(huán)孢素A以及4ng/ml 維生素B₁₂。

實(shí)施例3

1X10⁶細(xì)胞/ml臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和60ng/ml環(huán)孢素A以及10 ng/ml 維生素B₁₂。