專利名稱：一種小鼠胰腺干/祖細胞的離體篩選擴增技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型高效的離體篩選擴增小鼠胰腺干/祖細胞技術(shù)，具體涉及到
采用膠原酶部分消化后兩次轉(zhuǎn)接富集胰腺干/祖細胞，挑取單細胞集落純化，及進一步擴 增具有強增殖和分化能力的成體小鼠胰腺干/祖細胞的方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種由于胰島13細胞缺乏或功能缺陷引起的，以血糖增高為特征的代 謝疾病。近年來，隨著世界各國社會經(jīng)濟的發(fā)展和居民生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率和 患病率逐年提高，糖尿病已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)三大難癥之一。糖尿病不僅影響患者的生活質(zhì)量， 也給病人帶來沉重的心理負擔(dān)，而且糖尿病并發(fā)癥對患者的健康和生命構(gòu)成威脅。最近的 臨床試驗表明，胰島移植結(jié)合免疫抑制治療可以徹底治愈I型糖尿病，但供體的嚴(yán)重缺乏 制約了這一治療途徑的廣泛應(yīng)用。 胰腺干/祖細胞是一類具有高增殖能力并可以定向分化為胰島13細胞的多能細 胞，利用胰腺干/祖細胞離體擴增和分化為P細胞可以有效解決移植供體來源不足問題， 因而成為細胞替代療法治療糖尿病的基礎(chǔ)。但成體胰腺干/祖細胞做為移植供體細胞的來 源目前主要存在以下障礙(l)成體胰腺組織中干/祖細胞比率極低，缺少公認的標(biāo)志性分 子，難于通過流式細胞術(shù)篩選和富集；(2)利用離體培養(yǎng)方法篩選胰腺干/祖細胞過程中， 多種細胞混雜，尤其是成纖維細胞生長旺盛，從而導(dǎo)致上皮來源的胰腺干/祖細胞難于被 純化和大量擴增。因此，首先富集胰腺干/祖細胞，在培養(yǎng)過程中排除成纖維細胞污染，進 一步純化胰腺干/祖細胞并大量擴增是離體條件下獲得充足胰腺干/祖細胞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用模式動物小鼠建立了一種新型高效的胰腺干/祖細胞篩選方法，通過
膠原酶部分消化富集獲得胰腺干/祖細胞，根據(jù)不同類型細胞貼壁速度不等的原理，采用
了兩次轉(zhuǎn)接、反復(fù)貼壁的方法有效篩除了成纖維細胞，并進一步挑取具有強增殖能力的單
細胞集落，最終篩選獲得一群均質(zhì)的，具有典型干/祖細胞特性的胰腺上皮細胞。
具體步驟如下 —、小鼠胰腺組織的取材 1.取1 2只健康成年小鼠，頸椎脫臼法處死，用70% 75%乙醇浸泡5分鐘，超
凈臺內(nèi)打開小鼠腹腔，沿脾臟下方至十二指腸回彎處，用剪刀小心剪下淡粉色的胰腺組織。
2.在體視顯微鏡下剔除胰腺上的脂肪、血管、系膜及淋巴結(jié)，PBS緩沖液清洗兩 遍。 3.將胰腺移入干凈的3.5cm培養(yǎng)皿中，用彎頭剪剪成約lmm3大小的組織塊，加入 適量PBS緩沖液清洗一次，去除組織及細胞碎片。
二、胰腺單細胞的分離 1.向盛有胰腺組織的培養(yǎng)皿加入1 2mL 0. 8mg/mL膠原酶IV消化液以及20ul
30. lmg/mL的DNA酶I，置于37。C培養(yǎng)箱消化20min。 2.加入1.5 2mL冷PBS緩沖液，用帶有剪去尖部槍頭的移液器反復(fù)吹打組織，使
從組織塊上消化下來的單細胞盡可能解離釋放出來，自然沉降約10 15秒，收集含單細胞
的上清于15mL離心管中，重復(fù)清洗組織塊操作4 5次后棄掉未消化的組織塊。 3.將收集到的上清液置于水平離心機中，800 900rpm/min離心5min。棄去上清
液、上層的細胞碎片、DNA絮狀纏繞物及中間層血細胞，保留最下層乳白色的胰腺實質(zhì)細胞層。 三、胰腺干/祖細胞的篩選與純化 1.用含10%胎牛血清(FBS)的D/F12培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，將胰腺單細胞懸液接 種于1個6cm培養(yǎng)皿中，37t: 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40min。 2.將未貼壁的細胞連同培養(yǎng)基一起轉(zhuǎn)接到2個新6cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜，原培養(yǎng) 皿中已貼壁細胞主要為成纖維細胞，棄掉此培養(yǎng)皿。 3.將第一次轉(zhuǎn)接后過夜培養(yǎng)的皿中仍未貼壁細胞及其培養(yǎng)基一起轉(zhuǎn)接到另外2 個新6cm培養(yǎng)皿中，進行再過夜培養(yǎng)，第一次轉(zhuǎn)接后過夜培養(yǎng)貼壁的細胞換成擴增培養(yǎng)基 繼續(xù)培養(yǎng)。 4.24h后，棄去第二次轉(zhuǎn)接后再過夜培養(yǎng)的皿中未貼壁的細胞及其培養(yǎng)基，貼壁細 胞換成擴增培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每3天更換1/2原培養(yǎng)基。 5.擴增培養(yǎng)基為添加有2mmol/L谷氨酰氨、100IU青霉素-100iig鏈霉素、2X FBS 、 2 % B27 、 20ng/mL表皮生長因子、10ii g/mL胰島素、501111101/1^ -巰基乙醇的DMEM/F12
培養(yǎng)基。 6.第一次和第二次轉(zhuǎn)接后貼壁的細胞大部分為形態(tài)如鋪路石狀的胰腺上皮細胞， 其間偶爾摻雜成纖維細胞；擴增培養(yǎng)3 5d后，上皮細胞迅速增殖，在培養(yǎng)皿底壁可見一些 含有100個細胞左右的小集落，而成纖維細胞生長處于劣勢；培養(yǎng)7 10d后，可見多于300 個細胞的大集落。 7.擴增培養(yǎng)15d后，培養(yǎng)皿內(nèi)出現(xiàn)多于500個細胞的大集落，此時通過挑取上皮細 胞集落方法進一步純化胰腺干/祖細胞利用0. 125%胰蛋白酶消化液對單個大細胞集落 進行點狀消化，收集集落內(nèi)細胞，接種于48孔板培養(yǎng)孔中，加入含10% FBS的D/F12培養(yǎng) 基，37t: 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。24h后，棄去孔板中未貼壁的細包及其培養(yǎng)基，換成擴
增培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 四、胰腺干/祖細胞的大量擴增和保存 1.挑取至48孔培養(yǎng)板中的集落細胞經(jīng)擴增培養(yǎng)3d，純凈的上皮細胞成集落樣生 長，逐漸在培養(yǎng)孔底壁大范圍匯合，3d后布滿培養(yǎng)孔，此時可將孔內(nèi)細胞傳代至6cm培養(yǎng)皿 中。 2.棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入0. 8mLPBS緩沖液沖洗一次，加入50 y L 0. 125%胰蛋白
酶消化液，室溫消化lmin，加入含10% FBS的D/F12培養(yǎng)基，吹打3 4次，使細胞脫壁，將
細胞接種于1個6cm培養(yǎng)皿中，吸打均勻，37t: 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。 3. 24h后，棄去培養(yǎng)皿中未貼壁的細胞及其培養(yǎng)基，換成擴增培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，約
7d后，細胞布滿培養(yǎng)皿底壁，此時可對細胞按上述方法進行l(wèi) : 3傳代，并可按常規(guī)方法大
量凍存。
具體實施例方式
1.超凈臺和無菌間用紫外照射滅菌40min，然后關(guān)閉紫外設(shè)備，打開排風(fēng)系統(tǒng)， 5min后進入無菌間。 2.取3個直徑3.5cm的培養(yǎng)皿，置于超凈臺，其中兩個加入2mL冷PBS (4°C )，置 于冰袋上，備用。 3.準(zhǔn)備兩套無菌手術(shù)器械，置于超凈臺，備用。 4.頸椎脫臼法處死l只小鼠，將其置于75X乙醇中浸泡3min，消毒后帶入無菌間。
5.將小鼠左腹面向上，平置于干凈的10cm玻璃皿中，在超凈臺將小鼠腹腔打開， 暴露內(nèi)臟，小心的將胰腺取下，置于盛有冷PBS的3. 5cm培養(yǎng)皿中。 6.盛有胰腺組織的小皿移至體視顯微鏡下，用尖頭鑷子剔除脂肪、血管、系膜以及 淋巴結(jié)，然后將胰腺移至另一盛有冷PBS的3. 5cm培養(yǎng)皿中洗滌一次。
7.將剔凈的胰腺組織移入第三個培養(yǎng)皿，用彎頭剪將胰腺組織剪成O. 1咖3大小的 組織塊，加入2mLPBS清洗一次，以去除組織及細胞碎片。 8.加入1 2mL 0. 8mg/mL膠原酶IV消化液以及20ul 0. lmg/mL的DNA酶I，置 于37。C培養(yǎng)箱消化20min。 9.將培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中取出，用移液器加入1. 5 2mL冷PBS，將槍頭剪成合適 大小，反復(fù)吹打組織，使組織塊及細胞團中的單細胞盡可能多的解離釋放出來，經(jīng)自然沉降 10 15秒，吸取上清，收集于15mL離心管中。 10.重復(fù)步驟9清洗組織塊的操作5次左右，棄掉未消化的組織塊，將收集到的上 清液置于水平離心機中，800 1000rpm/min離心5min。 11.棄去上清液，上層的細胞碎片、死細胞來源的DNA絮狀纏繞物等，以及中間層 的血細胞，保留最下層乳白色的實質(zhì)細胞。 12.用含10% FBS的D/F12培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，將胰腺單細胞懸液接種于一個 6cm培養(yǎng)皿中，37t: 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40min。 13.將未貼壁的細胞連同培養(yǎng)基一起轉(zhuǎn)接到2個新6cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜，棄去 已貼壁細胞。 14. 24h后，將轉(zhuǎn)接后過夜培養(yǎng)的皿中仍未貼壁的細胞及其培養(yǎng)基再次轉(zhuǎn)接到另外 2個新6cm培養(yǎng)皿中，再進行過夜培養(yǎng)，第一次轉(zhuǎn)接后貼壁的細胞換成擴增培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 15.24h后，棄去第二次轉(zhuǎn)接后孔板中未貼壁的細胞及其培養(yǎng)基，對貼壁細胞換成 擴增培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每3天更換1/2原培養(yǎng)基。 16.擴增培養(yǎng)基的配制DMEM/F12培養(yǎng)基，添加有2mmol/L谷氨酰氨、100IU青霉
素-lOOii g鏈霉素、2X FBS、2% B27、20ng/mL表皮生長因子、10ii g/mL胰島素、50iimo1/
LP-巰基乙醇，4t:貯存，備用。如15天內(nèi)沒有用完需按原比例補加谷氨酰氨。 17.擴增培養(yǎng)15d左右，用10iiL槍頭吸取3 5iiL0. 125%胰蛋白酶消化液，對
細胞集落(300 500細胞大小)進行點狀消化，吸打8 15次，挑取細胞集落，接種于48
孔板培養(yǎng)孔中，加入含10% FBS的D/F12培養(yǎng)基，吸打均勻，37t: 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
18.24h后，棄去孔板中未貼壁的細胞及其培養(yǎng)基，換成擴增培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
19.3d后細胞布滿培養(yǎng)孔底壁，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入0.8mL PBS緩沖液沖洗一 次，加入50ii L 0. 125%胰蛋白酶消化液，室溫消化lmin，加入含10% FBS的D/F12培養(yǎng)基， 吹打3 4次，使細胞脫壁，將細胞接種于1個6cm培養(yǎng)皿中，吸打均勻，37t: 5% C02培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)過夜。 20.24h后，棄去培養(yǎng)皿中未貼壁的細胞及其培養(yǎng)基，換成擴增培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
21.約7d后，細胞布滿培養(yǎng)皿底壁，棄去皿中培養(yǎng)基，加入2mL PBS緩沖液沖洗一 次，加入500ii L 0. 125%胰蛋白酶消化液，室溫消化1 2min，加入含10% FBS的D/F12培 養(yǎng)基，吹打5 8次，使細胞脫壁，將細胞平均接種于3個6cm培養(yǎng)皿中，吸打均勻，37°C 5% (A培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。 22.24h后，棄去培養(yǎng)皿中未貼壁的細胞及其培養(yǎng)基，換成擴增培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。平 均每7天按同樣方法對細胞進行1:3傳代。


附圖是采用膠原酶部分消化后兩次轉(zhuǎn)接富集篩選胰腺干/祖細胞，并挑取單細胞 集落擴增胰腺干/祖細胞的具體流程。
權(quán)利要求
一種小鼠胰腺干/祖細胞的離體篩選擴增技術(shù)，其特征在于通過膠原酶部分消化、兩次轉(zhuǎn)接，挑取細胞集落的方法篩選和擴增出具有強增殖能力及多向分化潛能的成體胰腺干/祖細胞的技術(shù)方法。步驟如下(1)膠原酶部分消化向剪碎的胰腺組織塊中加入0.8mg/ml膠原酶IV消化液及0.1mg/mL的DNA酶I，體積以沒過組織為準(zhǔn)，37℃孵育20分鐘對胰腺組織進行部分消化。(2)胰腺干/祖細胞篩選用含10％胎牛血清的D/F12培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，將胰腺單細胞懸液接種于一個6cm培養(yǎng)皿中，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40min，將未貼壁的細胞連同培養(yǎng)基一起轉(zhuǎn)接到2個新6cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜；24h后，將經(jīng)過夜培養(yǎng)皿中仍未貼壁的細胞及其培養(yǎng)基一起第二次轉(zhuǎn)接到另外2個新6cm培養(yǎng)皿中，再進行過夜培養(yǎng)，第一次轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)貼壁的細胞換成擴增培養(yǎng)基(添加有2mmol/L谷氨酰氨、100IU青霉素-100μg鏈霉素、2％胎牛血清、2％B27、20ng/mL表皮生長因子、10μg/mL胰島素、50μmol/Lβ-巰基乙醇的DMEM/F12培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)；24h后，棄去第二次轉(zhuǎn)接再過夜培養(yǎng)皿中未貼壁細胞及其培養(yǎng)基，換成擴增培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每3天更換1/2原培養(yǎng)基；擴增培養(yǎng)15d左右。(3)挑取兩次轉(zhuǎn)接后獲得的大上皮細胞集落進一步篩除成纖維細胞10μL槍頭吸取3～5μL 0.125％胰蛋白酶消化液，對準(zhǔn)兩次轉(zhuǎn)接后獲得的一個大上皮細胞集落(300～500個細胞大小)進行點狀消化，吸打8～15次，收集細胞接種于48孔板培養(yǎng)孔中，加入含10％胎牛血清的D/F12培養(yǎng)基，吸打均勻，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。24h后，棄去孔板中未貼壁的細胞及其培養(yǎng)基，換成擴增培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型、高效的小鼠胰腺干/祖細胞離體篩選擴增技術(shù)，包括小鼠胰腺組織的取材、胰腺單細胞的分離、胰腺干/祖細胞的富集與純化、胰腺干/祖細胞的大量擴增等步驟。本發(fā)明的技術(shù)關(guān)鍵是通過膠原酶部分消化富集胰腺干/祖細胞，通過兩次轉(zhuǎn)接方法有效地篩除成纖維細胞，最后通過胰蛋白酶點狀消化挑取細胞集落的方法純化胰腺干/祖細胞并大量擴增，最終篩選獲得一群均質(zhì)的，具有強增殖能力及多向分化潛能的胰腺上皮干/祖細胞。
文檔編號C12N5/071GK101735977SQ20101003245
公開日2010年6月16日 申請日期2010年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月13日
發(fā)明者張麗新, 滕春波, 王法 申請人:東北林業(yè)大學(xué);滕春波;王法