一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，具體地涉及一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞（stem cells)不同于成熟細(xì)胞首先是因為它能夠在長時間內(nèi)保持自我更 新和擴(kuò)增的能力，其次干細(xì)胞能夠向多種細(xì)胞系分化。干細(xì)胞的這些特點使其成為良好的 種子細(xì)胞來源。其中，間充質(zhì)來源的成體多能干細(xì)胞（MSC)，具有取材方便體外培養(yǎng)容易的 優(yōu)點，已成為多種臨床細(xì)胞療法最可行的細(xì)胞來源之一。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSC)是存在 于脂肪組織中的干細(xì)胞，具有多向分化的潛能。2001年，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞首次從人抽脂術(shù) 中抽取的脂肪組織懸液中分離獲得，與骨髓等的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來 源更豐富易得，這使其已成為組織工程中種子細(xì)胞研宄的熱點。
[0003] 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)多采用低糖培養(yǎng)基L-DMEM，混合培養(yǎng)基DMEMF-12,培 養(yǎng)液中添加雙抗，采用較高的接種密度，細(xì)胞融合仍需要約5到7天時間。細(xì)胞狀態(tài)增殖能 力最佳的代次一般在P3代。最新研宄顯示，從脂肪組織中可以分離、培養(yǎng)得到間充質(zhì)干細(xì) 胞，通過鑒定其生物特征，可知其具有很強的增殖分化能力，免疫原性低。
[0004] 目前脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與傳代大規(guī)模培養(yǎng)中，在細(xì)胞傳代過程中使用胰酶 進(jìn)行細(xì)胞消化，對細(xì)胞損傷太大，導(dǎo)致傳代細(xì)胞容易衰老死亡。使用含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)影響 細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性。而接種密度按照1 :3?1 :5來接種細(xì)胞，在大規(guī)模培養(yǎng)及傳代中，這會 增加工作量，無法一次收集大量均一的細(xì)胞。目前傳統(tǒng)的傳代技術(shù)將脂肪干細(xì)胞的應(yīng)用代 數(shù)限制在6代以內(nèi)，大大的限制了脂肪干細(xì)胞的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明結(jié)合非酶消化法（TrypLE)，去除了酶解對 于細(xì)胞的損傷作用，選擇最佳的傳代接種密度，使用無血清培養(yǎng)基，并在其中添加合適的生 長因子，進(jìn)而將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代次數(shù)提高至15代以上仍然能保持原來的干性。從 而大大滿足間充質(zhì)干細(xì)胞在科學(xué)研宄與應(yīng)用上的需求。
[0006] 本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0007] 一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0008] 1)待原代培養(yǎng)分離后的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%，吸去細(xì)胞培養(yǎng)皿 中培養(yǎng)液，向每個培養(yǎng)皿內(nèi)加 PBS進(jìn)行清洗后，吸去培養(yǎng)皿中的PBS ;
[0009] 2)消化：在培養(yǎng)皿加入tryplE，轉(zhuǎn)移至CO2培養(yǎng)箱孵育l-2min后，加入無血清培 養(yǎng)基，用巴氏吸管反復(fù)吹打10-15次，待80-90%的細(xì)胞不再貼壁，終止消化；
[0010] 3)離心：將步驟2得到細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，lOOOrpm/min離心5min ;
[0011] 4)計數(shù)：離心結(jié)束后，棄去上清液，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，吹打混勻，取 20 μ 1細(xì)胞懸液用細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)。
[0012] 5)鋪板及培養(yǎng)：將細(xì)胞懸液接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，調(diào)整細(xì)胞密度為I. 3 X 104/cm2， 加入無血清培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基中添加 EGF，EGF的濃度為10ng/ml ;轉(zhuǎn)移至0)2細(xì)胞培養(yǎng) 箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0013] 步驟（1)所述PBS是沿著培養(yǎng)皿壁加入，不得直接沖洗培養(yǎng)皿底部；
[0014] 步驟（1)所述清洗是加入PBS后培養(yǎng)皿要前后、左右晃動大于10次。
[0015] 步驟（2)所述tryplE的用量為培養(yǎng)基總體積一半以內(nèi)，最低用量為達(dá)到覆蓋培養(yǎng) 皿底部。
[0016] 所述tryplE的用量為在Φ IOcm培養(yǎng)皿中加入2ml的tryplE或者在Φ 15cm培養(yǎng) 皿中加入3ml的tryplE。
[0017] 步驟（2)所述無血清培養(yǎng)基的用量等于或者大于（tryplE)用量。
[0018] 步驟（2)所述無血清培養(yǎng)基的用量為在Φ IOcm的培養(yǎng)皿中加入3ml的無血清培 養(yǎng)基或者在Φ 15cm的培養(yǎng)皿中加入5ml的無血清培養(yǎng)基。
[0019] 無血清培養(yǎng)基為 UltraCULTURE MEDIUM(Lonza) 〇
[0020] 步驟（4)所述無血清培養(yǎng)基的用量為5ml。
[0021] 步驟（4)所述細(xì)胞懸液計數(shù)前首先與0. 4%的臺盼藍(lán)染色液按照1 :1混合，染色 后Ih內(nèi)計數(shù)。
[0022] 在步驟（2)，鏡下觀察細(xì)胞消化情況，待80-90 %細(xì)胞不再貼壁，可以進(jìn)行終止消 化。
[0023] 步驟（5)所述無血清培養(yǎng)基的加入量為IOml或者15ml。
[0024] 現(xiàn)有技術(shù)傳代過程中存在的缺點：
[0025] (1)胰酶：傳代過程中使用0. 5% -0. 125%胰酶消化細(xì)胞，通常不能準(zhǔn)確根據(jù)細(xì)胞 生長活力狀態(tài)來選擇胰酶濃度及作用時間（lmin-5min)，常會超過一定程度而導(dǎo)致細(xì)胞傳 代后不能貼壁或者死亡，對細(xì)胞損傷過大，細(xì)胞增殖力下降。當(dāng)細(xì)胞連續(xù)傳代多次，則會出 現(xiàn)細(xì)胞老化死亡現(xiàn)象。
[0026] (2)接種密度：按照1 :3?1 :5的細(xì)胞密度接種細(xì)胞，滿足小規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)，在 操作中可行，而在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中，無法準(zhǔn)確確定細(xì)胞密度，細(xì)胞生長無法同步，細(xì)胞傳 代時間不統(tǒng)一，增加工作量，無法大量收集同一批次細(xì)胞。
[0027] (3)含血清培養(yǎng)基：血清對細(xì)胞的具有潛在毒性作用和血清源性污染。
[0028] 本發(fā)明在細(xì)胞傳代培養(yǎng)中，選擇非酶消化法（TrypLE)收集貼壁的脂肪間充質(zhì) 干細(xì)胞，使用最低的TrypLE用量，最大程度減少細(xì)胞消化過程中對細(xì)胞的損傷，并選擇 1. 3 XlOVcm2最佳接種密度培養(yǎng)細(xì)胞，使用無血清培養(yǎng)基（Ultra⑶LTURE MEDIUM)，并在培 養(yǎng)基中加入合適濃度的EGF(10ng/ml)，在Φ 15cm的培養(yǎng)皿中進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)。
[0029] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點及有益效果：
[0030] (1)本發(fā)明培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)良好，呈現(xiàn)梭形，簇團(tuán)性生長趨勢。
[0031] (2)本發(fā)明培養(yǎng)的細(xì)胞活性高，細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞計數(shù)儀鑒定，細(xì)胞活力達(dá)到90%以上， 符合細(xì)胞傳代及儲存條件。
[0032] (3)本發(fā)明培養(yǎng)的細(xì)胞增殖快，收獲細(xì)胞數(shù)量大。2. 5?3. 5天即可長至80? 90%。（plOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿收獲的細(xì)胞總數(shù)可到3?4X106,（pl5cm細(xì)胞培養(yǎng)皿收獲細(xì)胞可 達(dá) 6 ?8X106.
[0033] (4)脂肪干細(xì)胞能夠長期進(jìn)行傳代，15代之后仍然保持完整的干性，不出現(xiàn)衰老 跡象。
[0034] 為了實現(xiàn)（1)、（2)優(yōu)點，本發(fā)明在細(xì)胞傳代培養(yǎng)中，選擇非酶消化法（TrypLE)收 集貼壁的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，使用最低的TrypLE用量，最大程度減少細(xì)胞消化過程中對細(xì) 胞的損傷。
[0035] 為了實現(xiàn)（3)、（4)優(yōu)點，本發(fā)明選擇I. SXlOiZcma的最佳接種密度培養(yǎng)細(xì)胞， 在Φ IOcm(或Φ 15cm)的培養(yǎng)皿中進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)，并在無血清培養(yǎng)基中添加合適濃度 (10ng/ml)的 EGF。
【附圖說明】
[0036] 圖1為傳統(tǒng)法與無酶法細(xì)胞形態(tài)對比；A為傳統(tǒng)法第1代、第6代MSCs細(xì)胞 (100X) ;B 為傳統(tǒng)法第 1、6、15 代 MSCs 細(xì)胞（100X);
[0037] 圖2傳統(tǒng)法與無酶法細(xì)胞增殖曲線；
[0038] 圖3為第1代細(xì)胞表面標(biāo)記物流式檢測結(jié)果；
[0039] 圖4為第6代細(xì)胞表面標(biāo)記物流式檢測結(jié)果；
[0040] 圖5為第15代細(xì)胞表面標(biāo)記物流式檢測結(jié)果；
[0041] 圖6為第15代細(xì)胞成脂分化；
[0042] 圖7為羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變化（X 100)。
[0043] 圖8為不同接種密度增殖曲線圖。
【具體實施方式】
[0044] 術(shù)語解釋：
[0045] 胰酶：0· 25%胰蛋白酶+0· 02% EDTA(是質(zhì)量/體積百分?jǐn)?shù)）
[0046] PBS:磷酸緩沖液
[0047] EGF:上皮生長因子
[0048] ADMSC:脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞
[0049] IBMX :3_異丁基-1-甲基化黃嘌呤
[0050] 實施例1
[0051] 待原代培養(yǎng)分離后的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞融合度達(dá)到80%，用移液管吸去（tlOcm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，加入IOml PBS清洗2次，加入2ml TrypLE消化貼壁細(xì)胞，鏡下觀察 細(xì)胞消化情況，待細(xì)胞基本不再貼壁后，加入3ml無血清培養(yǎng)基（Ultra⑶LTURE MEDIUM)終 止消化，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以lOOOrpm/min離心5min，去上清液，用IOml無血清培 養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取20 μ 1細(xì)胞懸液，用Countstar自動細(xì)胞計數(shù)儀獲得細(xì)胞總數(shù)與細(xì)胞活 性信息。將細(xì)胞懸液以1.3Χ IOVcm2細(xì)胞密度接種到Φ 15cm細(xì)胞培養(yǎng)皿（無血清培養(yǎng)基 (UltraCULTURE MEDIUM))中，加入 15ml 含有 10ng/ml EGF 的無血清培養(yǎng)基（UltraCULTURE MEDIUM)，在培養(yǎng)皿蓋上做好標(biāo)記，轉(zhuǎn)移至5 % CO2、37°C、飽和濕度為95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn) 行培養(yǎng)。
[0052] 對比例1 :
[0053] 待原代培養(yǎng)分離后的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞融合度達(dá)到80%，用移液管吸去（tlOcm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，加入IOml PBS清洗2次，加入2ml、胰酶消化貼壁細(xì)胞，鏡下觀察細(xì) 胞消化情況，待細(xì)胞基本不再貼壁后，加入3ml完全培養(yǎng)基終止消化，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心 管中，以lOOOrpm/min離心5min，去上清液，用IOml完全培養(yǎng)基（含10% FBS)重懸細(xì)胞， 取20 μ 1細(xì)胞懸液，通過細(xì)胞計數(shù)板計算細(xì)胞總數(shù)與細(xì)胞活率。將細(xì)胞懸液按照1 :3的比 例接種到Φ IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿