一種增強脂肪間充質(zhì)干細胞免疫學性能和遷移能力的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞治療技術領域脂肪間充質(zhì)干細胞技術領域，特別涉及一種增強脂 肪間充質(zhì)干細胞免疫調(diào)節(jié)功能和迀移能力的方法。
【背景技術】
[0002] 間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells, MSCs)作為一類成人干細胞，憑借其獨 特的生物學特性，在免疫治療和再生醫(yī)學領域得到了廣泛的研宄。這種成纖維樣細胞于 1968年首次被發(fā)現(xiàn)，并在隨后的研宄中證實，MSCs能夠從多種組織中分離得到，并且能夠 在體外培養(yǎng)擴增。
[0003] MSCs目前被廣泛應用于組織工程、損傷修復以及自身免疫性疾病等領域，這源于 MSCs所具備的以下特性：
[0004] 1)能夠在體內(nèi)向組織損傷部位進行迀移；
[0005] 2)具有多向分化潛能；
[0006] 3)能夠分泌多種生物活性因子，參與損傷修復和炎癥抑制；
[0007]4)具備免疫耐受性和免疫調(diào)節(jié)功能。
[0008] 對MSCs發(fā)揮組織修復、免疫抑制功能的分子機制的研宄，有助于進一步推進MSCs 在細胞治療工程領域的應用。
[0009] MSCs具有向受損傷組織迀移的能力，也被稱作歸巢能力，通過迀移到特定的受損 區(qū)域進而發(fā)揮修復功能。目前普遍認為MSCs是通過各種趨化因子、黏附分子及其受體之間 的相互作用，從而對損傷或炎癥組織作出回應，激活、迀移到損傷組織中，發(fā)揮修復功能。有 研宄證實，患有腫瘤或急性炎癥的動物模型中，損傷部位會合成釋放多種趨化因子，包括血 管內(nèi)皮生長因子、干細胞生長因子、SDF-1等，而表達相應受體的MSCs就會對此作出回應， 向受損部位迀移。
[0010] MSCs主要的免疫學特性是低免疫原性和免疫抑制能力：不表達共刺激分子，低水 平表達主要組織相容性復合體（Major histocompatibility complex, MHC) I類分子，非組 成型表達MHC II 類分子[Sharma R R，et al. Transfusion, 2014, 54 (5): 1418-1437.]。Kong 等研宄表明MSCs能夠影響各類T細胞亞群免疫性能，將MSCs與被激活的T細胞在體外共 培養(yǎng)能導致促炎因子分泌量降低，包括干擾素（Interferon, IFN) y、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF) a、IL_6等，同時增加抗炎因子IL-4和IL-10的分泌水平，表明MSCs 能夠平衡 Thl 和 Th2 的分泌活動[Kong Q, et al. J NEUR0IMMUN0L, 2009, 207(1) : 83-91.]。 此外，MSCs還能夠介導對B細胞增殖的影響，并抑制樹突狀細胞的分化、成熟。多種細胞分 子參與了 MSCs的免疫調(diào)節(jié)行為，包括肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor, HGF)、 前列腺素（Prostaglandin, PG)E2、轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming growth factor, TGF)0、 11-10、11^-6、吲噪胺2,3-過氧化酶（1]1(1〇163111；[116-2,3-(1;[(?5^6仙86，100)以及組織相容 性白細胞抗原（Histocompatibility leukocyte antigen, HLA)G5 等[Gesundheit B，et al. MED HYPOTHESES, 2014.]。
[0011] 由于MSCs能夠向損傷部位迀移，并具有強大的抗炎、免疫調(diào)節(jié)能力，使其在組織修 復和自身免疫性疾病治療等方面具有全新的思路和無限的潛能。自身免疫性疾病是由于宿 主對自體抗原的免疫耐受缺失，伴隨著一系列對自體特定的靶細胞和多器官系統(tǒng)的攻擊， 從而導致的一類慢性疾病[Anaya J M. Autoimmunity reviews, 2012, 11 (11) : 781-784. ] 〇 包括1型糖尿病、類風濕性關節(jié)炎、炎癥性腸病、移植宿主反應，以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。自 身免疫性疾病的傳統(tǒng)治療方案多以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑為主，雖能有效抑制異常的自 身免疫，但是長期使用會引發(fā)患者的耐受性以及諸多不良反應。于文龍等將臍帶間充質(zhì)干 細胞通過尾靜脈注射入1型糖尿病小鼠，3個月后檢測各組小鼠的血糖、每日胰島素使用 劑量、CD4+T細胞數(shù)量以及胰島a和0細胞的數(shù)量和體積。結(jié)果發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細胞 干預組胰島a、0細胞結(jié)構(gòu)更完整，數(shù)量明顯上升；⑶4+T細胞數(shù)量、胰島素用量和血糖水 平明顯降低[于文龍，徐薇，于江蘇.中國組織工程研宄，2013, 17 (19) =3474-3480.]。 Ma等進行的體內(nèi)實驗顯示，MRL/lpr狼瘡鼠的存活時間可通過移植MSCs發(fā)生明顯改善， 并且體內(nèi)活化B細胞、衆(zhòng)細胞數(shù)量均出現(xiàn)明顯下降[Ma X，et al. Cell transplantati on, 2013, 22(12) :2279-2290. ]。Zheng等研宄表明，MSCs能夠顯著抑制RA患者T細胞的 增殖及激活抗原的表達，并且這種抑制呈劑量依賴性，而且MSCs可以抑制⑶4+T細胞與 CD8+T 細胞分泌 IFN-y 和 TNF-a，同時上調(diào) IL-10 的水平[Zheng Z H, et al. Rheumatolo gy, 2008, 47(1) : 22-30. ] 〇
[0012] 脂肪間充質(zhì)干細胞（Adipose-derived stem cells, ASCs)作為一類來源于脂肪組 織的間充質(zhì)干細胞，相較于其他來來源的間充質(zhì)干細胞，在實驗研宄和臨床應用中具備更 多的優(yōu)勢：脂肪組織的取材方便、安全，通過簡單的麻醉吸脂術或者皮下脂肪組織的剪切即 可獲得，對供體帶來的疼痛和傷害更??；ASCs在脂肪組織中的含量更豐富，通過酶消化法 等技術即可分離出大量的原代細胞，并且不存在倫理問題。此外，ASCs具備間充質(zhì)干細胞 共有的生物學特性，包括向骨細胞、脂肪細胞等分化的潛能，在體內(nèi)向炎癥部位的趨向性， 更重要的是具備免疫調(diào)節(jié)能力。因此，ASCs將在組織工程、免疫性疾病治療等領域有著重 要的臨床研宄意義。而ASCs功能性的表達TLRs，表示被激活的TLRs可能通過啟動信號通 路級聯(lián)反應，最終調(diào)控ASCs的免疫因子的分泌，改變其免疫學性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明為了提升間充質(zhì)干細胞在免疫性疾病中的應用效果，增強其在體內(nèi)向損傷 /炎癥部位的迀移能力和發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，提出了一種通過激活功能性的表達于脂肪間 充質(zhì)干細胞表面的受體蛋白，上調(diào)脂肪間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)功能和迀移能力。
[0014] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是：
[0015] -種增強脂肪間充質(zhì)干細胞免疫學性能和迀移能力的方法，步驟如下：將分離提 取的脂肪間充質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)至80%融合，再進行傳代培養(yǎng)，選用生長良好的第三代細 胞，用含有TLR3激活劑Poly(I: C)的細胞培養(yǎng)液進行共培養(yǎng)，最后進行實驗組和對照組的 Real-timePCR和趨化性實驗對比檢測；
[0016] (1)脂肪間充質(zhì)干細胞的分離及原代培養(yǎng)
[0017] 從小鼠腹股溝部剪取脂肪組織，用HBSS緩沖液沖洗，充分剪碎，加入0. 1 % I型膠 原酶進行消化，然后過濾并離心l〇min得到的細胞生長培養(yǎng)液；對細胞生長培養(yǎng)液進行重 懸沉淀得到細胞懸液，將細胞懸液接種到培養(yǎng)瓶中，置于5% C02細胞培養(yǎng)箱中進行原代培 養(yǎng)；
[0018] (2)脂肪間充質(zhì)干細胞的傳代培養(yǎng)
[0019] 待步驟（1)原代培養(yǎng)至80%融合，用含0.25§/10011^￡0了4的胰蛋白酶液進行消 化，重懸細胞，然后接種到培養(yǎng)皿中傳代培養(yǎng)；待細胞培養(yǎng)至80%融合后，進行傳下一代培 養(yǎng)，得到第三代脂肪間充質(zhì)干細胞；
[0020] (3) POLY (I:C)對脂肪間充質(zhì)干細胞的刺激
[0021] 用含有TLR3激活劑Poly (I:C)的細胞生長培養(yǎng)液培養(yǎng)步驟⑵培養(yǎng)lh，得到的 第三代脂肪間充質(zhì)干細胞，然后用含〇. 25g/100mL EDTA的胰蛋白酶液進行消化，重懸細胞； 所述的含有TLR3激活劑Poly (I:C)的細胞生長培養(yǎng)液中Poly (I:C)的含量為lyg/mL; 細胞生長培養(yǎng)液中含有L-谷氨酸鈉2mM、三抗的體積百分數(shù)1 %、胎牛血清的體積百分數(shù) 10%;含有TLR3激活劑P〇ly(I:C)的細胞生長培養(yǎng)液為DMEM/F121:1培養(yǎng)基；
[0022] (4) Real-time PCR檢測細胞因子和趨化因子的表達
[0023] 利用Real-time PCR方法分別對經(jīng)過Poly(I:C)共培養(yǎng)后的脂肪間充質(zhì)干細胞和 未經(jīng)？〇17(1:〇刺激的脂肪間充質(zhì)干細胞進行對比實驗，對二者11^6、16?-|3、10 3-1、1((：、 Eotaxin-1、VEGF細胞因子或趨化因子mRAN表達水平進行檢測；
[0024] (5)體外趨化性試驗
[0025] 利用transwell小室進行細胞侵襲試驗，分別取生長至80 %融合的經(jīng)過 Poly(I:C)共培養(yǎng)后的