專利名稱：人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在腎臟、眼底疾病中的用途的制作方法
人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在腎臟、眼底疾病中的用途
技術(shù)領(lǐng) 域本發(fā)明一般涉及間充質(zhì)干細(xì)胞的用途。具體而言，本發(fā)明涉及人脂肪來源的間充 質(zhì)干細(xì)胞在腎臟和/或眼底疾病中的用途。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)由于其自我更新和多系分化的能力，被廣泛應(yīng)用于多種疾 病的研究，人脂肪來源的MSCs (hAD-MSCs)由于其易獲得，易擴(kuò)增且具有與骨髓源MSCs具有 類似的分化潛能，近年來成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最為熱門的種子細(xì)胞。急性腎損傷以及由此引發(fā)的腎臟纖維化，是臨床上常見的病理過程。無論是各 種原發(fā)性腎小球疾病，還是糖尿病腎病、狼瘡性腎炎等繼發(fā)性腎臟疾病都與腎臟纖維化 病變的程度密切相關(guān)。這些疾病能引起腎小管上皮細(xì)胞的凋亡、基底膜斷裂、腎間質(zhì)炎 性細(xì)胞的浸潤、肌成纖維細(xì)胞的聚集，并在一些促纖維化因子的參與下，使細(xì)胞外基質(zhì) (extra-cellular matrix, ECM)成分生成增多、降解減少，腎間質(zhì)纖維化產(chǎn)生，導(dǎo)致腎功能 嚴(yán)重受損。目前臨床上對腎臟纖維化的治療措施多集中在控制加劇腎功能惡化的危險因 素，如高血壓、高血糖、高血脂、高蛋白攝入等方面，而這不能從根本上改善病人的預(yù)后。視網(wǎng)膜變性疾病是眼科主要的致盲性疾病，代表疾病為視網(wǎng)膜色素變性 (retinitis pigmentosa, RP) 0視網(wǎng)膜色素變性為常染色體隱性遺傳為主的遺傳性疾病。 通過病理學(xué)觀察目前普遍認(rèn)為，其主要致病機(jī)理為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞對視細(xì)胞外節(jié)盤膜 的吞噬消化功能障礙，致使外節(jié)盤膜崩解物殘留，堆積形成一層障礙物妨礙營養(yǎng)物質(zhì)從脈 絡(luò)膜到視網(wǎng)膜的轉(zhuǎn)運，從而引起視細(xì)胞的進(jìn)行性營養(yǎng)不良及逐漸變性和消失。但是引發(fā)這 一過程的原因，目前還不清楚，可能與基因異常、某些酶的缺乏及代謝障礙有關(guān)。目前臨床 對視網(wǎng)膜色素變性治療仍局限于使用血管擴(kuò)張劑、維生素類、組織療法、神經(jīng)營養(yǎng)、各種激 素等保守治療手段以延緩病情進(jìn)展，還沒有行之有效的針對性治療手段。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic ratinopathy，DR)是糖尿病最常見和嚴(yán)重的并發(fā)癥 之一。世界衛(wèi)生組織公布，糖尿病視網(wǎng)膜病變是全世界導(dǎo)致視力缺損和失明的第二大因素。 在美國，糖尿病視網(wǎng)膜病變占40歲以上成人失明原因的25%，糖尿病患者致盲的危險性是 非糖尿病的25倍。世界衛(wèi)生組織已經(jīng)將糖尿病視網(wǎng)膜病變確定為在世界范圍內(nèi)造成視力 損害及失明的一個主要原因。長期以來，科研人員對DR的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，但 迄今為止尚未完全闡明。特發(fā)性黃斑裂孔是正常眼自發(fā)形成的黃斑全層神經(jīng)上皮缺失，不伴有眼外傷和其 他原發(fā)病因，其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。從上個世紀(jì)70年代開始，人們一直致力于黃斑裂 孔治療的研究。并大幅提高了裂孔解剖閉合率。然而目前已發(fā)表的大規(guī)模臨床研究文獻(xiàn) 中，并沒有提出能夠達(dá)到100%裂孔閉合率的方法。分期較晚、裂孔重復(fù)裂開的復(fù)雜黃斑裂 孔仍然是眼底疾病治療的難點之一。但目前還沒有將hAD-MSCs應(yīng)用于眼底疾病移植治療 的文獻(xiàn)發(fā)表。因此，人們一直尋找治療腎臟損傷相關(guān)疾病和眼底疾病的新的藥物和治療方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一方面提供人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療腎臟和/或眼底疾 病的細(xì)胞制劑中的用途。本發(fā)明中，人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可治療的腎臟疾病包括急性腎損傷、腎臟 纖維化、腎小管上皮細(xì)胞損傷。本發(fā)明中，人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可治療的眼底疾病包括視網(wǎng)膜變性、糖尿 病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜裂孔。優(yōu)選地，本發(fā)明人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可治療的視網(wǎng)膜變性為視網(wǎng)膜色素變 性。在本發(fā)明中，用于治療腎臟和/或眼底疾病的細(xì)胞制劑可包含的人脂肪來源的間 充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)目可根據(jù)公知技術(shù)確定，優(yōu)選地，每單位細(xì)胞制劑可包含1XIO5至1 X IO6個 人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明中，治療腎臟和/或眼底疾病的細(xì)胞制劑具有本領(lǐng)域公知的含義，例如用 于治療腎臟和/或眼底疾病的細(xì)胞制劑可以使用本發(fā)明提供的人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì) 胞作為種子細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞制劑還可以包括用于治療腎臟和/或眼底疾病所需要本領(lǐng) 域公知的其他成分，如適合患者接納的材料或基質(zhì)，該基質(zhì)可作為細(xì)胞移植用的三維模板， 具有特定的孔徑，例如申請日為2004年6月7日的中國發(fā)明專利號為200480019202. 5，授 權(quán)公告號為CN100447186C的發(fā)明專利中所描述的基質(zhì)。還可以包括生物可降解聚合物如 白蛋白、纖維蛋白原、膠原蛋白、明膠等，并制作成治療用途的試劑盒的形式。本發(fā)明的細(xì)胞制劑滿足本領(lǐng)域技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，例如符合國家食品藥品監(jiān)督管理局《人 體細(xì)胞治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型為⑶11a，⑶31， CD34, CD45, HLA-DR 為陰性，CD29, CD44, CD105, CD166, Scar-1, Flk-I 為陽性，并且低表達(dá) MHC II類分子。本發(fā)明所提供的細(xì)胞制劑優(yōu)選地為靜脈注射劑。在視網(wǎng)膜眼底裂孔的治療中，本發(fā)明所提供的細(xì)胞制劑優(yōu)選地為視網(wǎng)膜下注射 劑。


圖1.流式細(xì)胞檢測hAD-MSCs表型及周期。A :hAD_MSCs表型。B 第三代hAD_MSCs 細(xì)胞形態(tài)(200X)。C hAD-MSCs細(xì)胞周期。圖2.病理學(xué)觀察。H&E染色結(jié)果顯示，移植組3天(B)，對照組3天(A)，移植組 21天(D)，對照組21天(C)，對照組6個月(E)，移植組6個月(F)，標(biāo)尺為50 μ m。 圖3. Masson染色顯示膠原沉積。A 對照組10天；B 移植組10天；C 對照組6 個月；D 移植組6個月。E :I/R后10天和6個月移植組的膠原沉積量明顯低于對照組，(ρ < 0. 05)。標(biāo)尺為 50 μ mo 圖4. hAD-MSCs和mBM_MSCs在損傷腎臟組織中的分布。A =RT-PCR檢測人特異性 β -actin表達(dá)，I/R后3天(3)，10天(5)，6個月(7)移植組腎臟被檢測，正常C57BL/6小鼠和同一時間點對照組腎臟(1，2，4，6)作為對照，hAD-MSCs作為陽性對照(8)。菲立磁的 普魯士藍(lán)染色顯示，I/R后3天(B)，腎臟皮質(zhì)區(qū)小管⑶和間質(zhì)(H)處有呈藍(lán)色顆粒樣的 陽性細(xì)胞存在，10天結(jié)果與三天類似(C)。抗人核抗體檢測結(jié)果與之類似(E，I)。β-gal, 綠色熒光蛋白抗體分別檢測Rosa鼠(F，G)和EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠(J，K)來源的供體MSCs細(xì) 胞的分布情況。L-O為陰性對照。標(biāo)尺為50 μ m。圖5.植入的hAD-MSCs在I/R模型腎臟中分化為腎小管上皮細(xì)胞。免疫熒光雙染 顯示，移植組3天腎臟中檢測到抗人核陽性的供體細(xì)胞(紅色熒光)，同時表達(dá)上皮細(xì)胞的 標(biāo)志pan-CK (綠色熒光)(A-C)。對照組腎臟作為陰性對照(D-E)。標(biāo)尺為50um。G =RT-PCR 檢測，1，正常C57BL/6小鼠腎臟；2，hAD-MSCs ；3，對照組3天；4，移植組3天；5，HK2細(xì)胞。 標(biāo)尺為50 μ m。圖6.體外誘導(dǎo)培養(yǎng)hAD-MSCs可以分化為上皮樣細(xì)胞。A 誘導(dǎo)前梭形hAD-MSCs ； B hAD-MSCs誘導(dǎo)后呈多變形上皮樣；抗CK18抗體免疫熒光染色誘導(dǎo)后見陽性細(xì)胞(C，綠 色熒光)，誘導(dǎo)前hAD-MSCs，作為陰性對照(D)0 RT-PCR檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)CD18 (2)， hAD-MSCs為陰性對照(1)，HK2為陽性對照(3)。標(biāo)尺為50 μ m。圖7.移植細(xì)胞劑量與植入比例的關(guān)系。用人特異性β -actin進(jìn)行RT-PCR檢測， 低劑量組和高劑量組的供體細(xì)胞植入比例沒有顯著差別。P < 0. 05。圖8. hAD-MSCs促進(jìn)腎臟增殖?？剐∈驪CNA單克隆抗體免疫組化染色，陽性細(xì)胞 為棕色核陽性。A，B, C，D分別為對照組3天、移植組3天、對照組10天、移植組10天。免 疫熒光雙染抗人特異性核抗體(紅色熒光)和抗PCNA抗體(綠色熒光)，E-G為移植組3 天，H-J為對照組3天。標(biāo)尺為50 μ m。圖9. hAD-MSCs促進(jìn)腎臟BMP7高表達(dá)?？剐∈驜MP7單克隆抗體進(jìn)行免疫組化染 色，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，陽性細(xì)胞為棕色胞漿染色。A，B分別為對照組1天和移植組1天； C，D為對照組3天和移植組3天。E =RT-PCR結(jié)果顯示I/R后1天和3天移植組BMP7表達(dá) 明顯高于對照組。標(biāo)尺為50 μ m。圖10 病理學(xué)觀察。hAD-MSCs移植后1天，移植組(B)和對照組(A)視網(wǎng)膜病理 結(jié)果顯示破壞程度沒有差別；移植后1周對照組(C)外核層出現(xiàn)塌陷，移植組破壞程度較輕 (D)；隨后2周、3周、6周移植組(F，H，J)的損傷修復(fù)情況均好于對照組(E，G，I)。標(biāo)尺長 度為50 μ m。圖11 hAD-MSCs的植入和分化。A-C 抗人核陽性的供體細(xì)胞(紅色熒光)同時表 達(dá)RPE特異的標(biāo)志MITF (綠色熒光)；D-F:抗人核陽性的供體細(xì)胞(紅色熒光)同時表達(dá) 感光細(xì)胞特異的標(biāo)志Rhodopsin (綠色熒光)；G-I 抗人核陽性的供體細(xì)胞(紅色熒光)同 時表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的標(biāo)志vWF (綠色熒光)。標(biāo)尺為50 μ m。圖12. hAD-MSCs對BRB功能的影響。STZ模型小鼠的BRB出現(xiàn)滲漏，造模后3個月 BRB功能一直處于異常狀態(tài)。移植組從移植后1周開始，BRB功能有所恢復(fù)，之后的2周，4 周BRB功能逐漸恢復(fù)到正常水平(ρ < 0. 01)。 圖13. hAD-MSCs對血糖的影響。與對照組相比較，移植組的血糖從移植后1周下 降，到移植后4周，血糖水平接近正常值(ρ < 0. 01)。圖14. hAD-MSCs的植入和分化。A-C 抗人核陽性的供體細(xì)胞(紅色熒光)同時表 達(dá)感光細(xì)胞特異的標(biāo)志Opsin (綠色熒光)，標(biāo)尺長度50 μ m ；D-F 抗人核陽性的供體細(xì)胞(紅色熒光)同 時表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞特異的標(biāo)志GFAP (綠色熒光)，標(biāo)尺長度50 μ m。圖15. OCT觀察。兔眼行裂孔術(shù)后的OCT檢查的結(jié)果A，2天；C，4天；E，12天；G， 20天；移植組分別為=B, 2天；D，4天；F, 12天；H, 20天。圖16.病理結(jié)果。術(shù)后1個月，H&E染色顯示，移植組(A)裂孔處組織略高于兩 側(cè)正常視網(wǎng)膜，可見細(xì)胞不規(guī)則排列；對照組(B)裂孔處低于正常視網(wǎng)膜組織，細(xì)胞排列無 序。C為正常兔眼視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。標(biāo)尺為50 μ m。圖17.裂孔處細(xì)胞免疫熒光染色。術(shù)后1個月對照組裂孔處主要為GFAP陽性的 膠質(zhì)細(xì)胞(A)，未見Opsin陽性和PKC陽性的細(xì)胞(D，G)；移植組除大量GFAP陽性的膠質(zhì)細(xì) 胞外(B)，還可觀察到少量Opsin陽性(E)的感光細(xì)胞，極少量PKC陽性的雙極細(xì)胞(H)；正 常視網(wǎng)膜的GFAP (C)、Opsin (F)和PKC染色(I)。標(biāo)尺為50 μ m。圖18. hAD-MSCs在視網(wǎng)膜裂孔的分布分化。hAD_MSCs移植后4周，可見少量抗人 核陽性(紅色熒光)供體細(xì)胞位于視網(wǎng)膜內(nèi)核層，并且表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志GFAP(綠色熒 光)(A-C)。標(biāo)尺為10 μ m。尚可見可見少量抗人核陽性(紅色熒光)供體細(xì)胞位于視網(wǎng)膜 外核層，并且表達(dá)感光細(xì)胞的標(biāo)志Opsin (綠色熒光)(D-F)。標(biāo)尺為50 μ m。
具體實施例方式本發(fā)明中使用的儀器和試劑均是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可通過商業(yè)機(jī)構(gòu)購買獲 得。本發(fā)明所使用的方法，如HE染色、Masson三色染色、免疫組化、菲立磁染色、免疫熒光 染色等均為本領(lǐng)域公知的方法，可通過教科書或相關(guān)文獻(xiàn)的描述進(jìn)行，本發(fā)明說明書中有 描述的，參照本發(fā)明中描述的方法進(jìn)行。實施例1 相關(guān)實驗方法1. 1、人脂肪來源的MSCs培養(yǎng)及擴(kuò)增取成人的脂肪組織，用D-Hank’ S液反復(fù)沖洗，剪碎，0. 2% I型膠原酶37°C，消化 30分鐘，用大量D-Hank，S液洗滌終止I型膠原酶的作用，離心1000r/m，IOmin后，用100 目的濾網(wǎng)過濾，并用移液管反復(fù)吹打，使之成為單細(xì)胞懸液，計數(shù)，接種密度為2X 106/ml， 用完全培養(yǎng)基(含 58% DMEM/F12+40% MCDB-201、2%胎牛血清(FCS)、10ng/ml EGFUOng/ ml PDGFUX 胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)、1 X 亞油 酸-牛血清白蛋白(linoleic acid-bovineserum albumin, LA-BSA)，50 μ M β 巰基乙醇， 2mM L-谷氨酰胺，100 μ g/ml青霉素和100U/ml硫酸鏈霉素)，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 1天后換液，棄去未貼壁的細(xì)胞，以后每三天半量換液。當(dāng)細(xì)胞達(dá)80 90%融合(約10天 左右)時，0.25%胰酶常規(guī)消化傳代。1. 2、小鼠骨髓來源的MSCs的分離與培養(yǎng)1、動物骨髓的取材。(1)用頸椎脫臼斷頸法處死小鼠。在無菌條件下取股骨和脛骨，除去骨表面附著的 肌肉組織，用D-Hank’ s液浸泡(或其它細(xì)胞培養(yǎng)用的平衡鹽溶液，添加青霉素100IU/ml， 鏈霉素 100ug/ml)。(2)用器械去除股骨近端和脛骨遠(yuǎn)端，暴露骨髓腔。然后除去股骨、脛骨另一端的 骨骺，并用Iml注射器在骨端的生長面上開一個小孔。(3)用Iml注射器吸Iml含血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，將針頭從上述小孔插入骨髓腔中，注入培養(yǎng)液，從骨的另一端收集沖洗出來的骨髓。(4)將收獲的全部骨髓用注射器反復(fù)抽吸，以打散組織成為細(xì)胞懸液。(5)收集細(xì)胞懸液，離心。用干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸沉淀的細(xì)胞。2、接種及培養(yǎng) (1)用干細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度。將6X IO7個骨髓有核細(xì)胞接種到T25培養(yǎng)瓶 中。在37 °C、5 % CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)原代接種后24小時，除去未貼壁的造血細(xì)胞，用D-Hank’S液換洗，半量換液。 以后每隔3 4天換液1次。(3) 12 14天后，當(dāng)形成一些較大的細(xì)胞克隆時，用D-Hank’S液將培養(yǎng)的細(xì)胞洗 2遍。加入0. 25%胰酶(含0. 01 % EDTA)消化液，室溫消化，顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變形時， 用含血清培養(yǎng)液或牛血清終止胰蛋白酶的作用。(4)用吸管輕輕吹打培養(yǎng)瓶的細(xì)胞貼附面，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，制成細(xì) 胞懸液。(5)將細(xì)胞以培養(yǎng)基重懸，將懸液接種到新的培養(yǎng)瓶中，于37°C、5% CO2、飽和濕度 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待傳代的細(xì)胞生長密度達(dá)到80% 90%時，即再次傳代。1.3、細(xì)胞周期的測定將人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞消化計數(shù)，1 X IO6細(xì)胞，70%冷乙醇4°C固定30min， PBS液洗滌細(xì)胞二遍，5 μ g/ml PI室溫染色5min，用流式細(xì)胞儀(FACSVantage型)檢測， ModFIT軟件分析結(jié)果。1. 4、流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞的表型用間接免疫熒光法檢測成人脂肪來源的MSC的免疫表型。針對細(xì)胞表面抗原，細(xì) 胞用胰酶消化后，用含0. 5 %的牛血清白蛋白的PBS沖洗，加入一抗4°C孵育30min。一抗為 小鼠抗人的單克隆抗體CD105、CD29、CD34、CD31、CD44、CD45、HLA-DR、Flk-I。為檢測細(xì)胞 內(nèi)抗原Flk-I，細(xì)胞與一抗孵育之前，用1 %多聚甲醛4°C固定15min，并在室溫下用0. 1 %的 皂角素透膜1小時。我們選用同種同型非相關(guān)IgG抗體作為陰性對照。細(xì)胞用洗液PBS洗 過后，加入FITC標(biāo)記的二抗4°C孵育30min。細(xì)胞洗兩次，并懸浮在500ul的PBS中，置于 冰上待流式細(xì)胞儀檢測。1. 5、hAD-MSCs體外誘導(dǎo)為上皮樣細(xì)胞分離C57BL/6小鼠的腎小管上皮細(xì)胞，以5X105/ml密度重懸于DF12培養(yǎng)基中。 經(jīng)IOGy照射后，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時。收集上清，與DF12以1 4比例混合，加入 20ng/mlHGF、10ng/mlFGF-4和2%胎牛血清作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將第三代hAD-MSCs以2X IO4/ cm2密度接種，培養(yǎng)3周。未經(jīng)誘導(dǎo)的hAD-MSCs作為陰性對照，人腎小管上皮細(xì)胞系HK2作 為陽性對照。1. 6、腎臟損傷模型和MSCs輸入雄性C57小鼠分為2組(20只/組)，8周齡，1 %戊巴比妥鈉腹腔麻醉，用無菌剪在 腹部右側(cè)剪開2cm左右的切口，暴露右側(cè)腎臟及周圍組織，用無損傷血管夾鉗夾右側(cè)腎蒂， 計時，在35分鐘松開血管夾，恢復(fù)血流。關(guān)閉腹腔，縫合切口。術(shù)中以及關(guān)腹前用無菌生理 鹽水補(bǔ)充液體。術(shù)后24小時內(nèi)，移植組的小鼠經(jīng)尾靜脈注射第3-5代的MSCs，lX106/只； 對照組術(shù)后僅尾靜脈輸注等量的生理鹽水。分別在I/R后3天、10天、3周、2個月和6個月斷頸處死小鼠，取出右側(cè)腎臟，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片。另外一組腎臟則用液 氮冷凍，保存用于提取總RNA。1. 7、視網(wǎng)膜變性大鼠模型的建立及hAD-MSCs植入Lewis大鼠60只，80_100g，雄性，按50mg/Kg碘酸鈉的劑量經(jīng)尾靜脈注射1 %碘 酸鈉液，一周后隨機(jī)分為6組，每組中5只大鼠經(jīng)尾靜脈注射hAD-MSCs細(xì)胞懸液1ml，約 1 X IO7個hAD-MSCs，另5只大鼠注射等量的PBS液Iml作陰性對照。移植后1天、1周、2周、 3周、6周和3個月，分別將一組大鼠過量麻醉處死，手術(shù)顯微鏡下觀察大鼠眼底情況。摘除 眼球，10%中性福爾馬林溶液固定過夜，去除眼前節(jié)，梯度脫水，石蠟包埋，將眼球12點位 置向上做冠狀連續(xù)切片，分別作HE染色、免疫熒光檢測和免疫組化檢測。1. 8、STZ誘導(dǎo)的大鼠糖尿病模型的建立及hAD-MSCs植入60只大鼠空腹12h后，按60mg/kg的劑量腹腔一次性注射2% STZ溶解于的檸檬 酸緩沖液，PH值4. 2-4. 5)，7日后測血糖> 16. 7mmol/L，尿糖+++或++++者確定為糖尿病 大鼠模型。模型建立3月后，移植組尾靜脈注射hAD-MSCs，IX IO7/只，0. 5ml ；對照組以等量 的生理鹽水注射。1. 9、兔視網(wǎng)膜裂孔模型的建立及hAD-MSCs植入1、動物麻醉速眠新Iml肌肉注射，3%戊巴比妥Iml耳緣靜脈注射行基礎(chǔ)麻醉，鹽酸丁卡因滴 眼液滴眼表面麻醉。2、手術(shù)操作手術(shù)器械高溫消毒。連接灌注、氣液交換設(shè)備及玻璃體切除設(shè)備。將動物置于顯 微手術(shù)操作臺上，置左眼于手術(shù)顯微鏡操作視野下，鋪巾，充分散瞳。置開瞼器將眼瞼撐開， 用眼科剪打開結(jié)膜，固定鏡環(huán)，安放眼底鏡。在手術(shù)顯微鏡下檢查眼底有無異常。用尖刀于 耳側(cè)距角膜緣2. 5mm處做鞏膜切口，固定灌注頭。于鼻側(cè)同樣位置插入玻璃體切割頭，在手 術(shù)顯微鏡直視下充分切除玻璃體。玻切頻率450HZ，最大吸力400mmHg。玻璃體切除干凈 后，于視盤下方約2. Omm處，將毛細(xì)玻璃管小心插入視網(wǎng)膜下，緩慢注入生理鹽水，形成約 1. 5mm大小小泡，插入笛針垂直抵于小泡上，用最大負(fù)壓快速吸引，形成約1. 5mm左右大小 視網(wǎng)膜缺失。打開氣液交換開關(guān)，設(shè)送氣壓力40mmHg，充分氣液交換，笛針吸引使網(wǎng)膜復(fù)位。 取出灌注頭，縫合鞏膜切口、結(jié)膜。涂抹紅霉素眼膏預(yù)防感染。3、hAD-MSCs移植將細(xì)胞懸液混勻，用微量注射器吸取人hAD-MSCs懸液至需要 量，換氣鏡檢查眼底，在手術(shù)顯微鏡直視下將微量注射器于鞏膜切口處小心插入。在裂孔表 面緩慢注入hAD-MSCs懸液10 μ 1，細(xì)胞數(shù)約1 X IO5。4、對照組換用另一只微量注射器注入10 μ 1生理鹽水，方法同上。5、術(shù)中眼底檢查術(shù)中手術(shù)顯微鏡下觀察可見裂孔處網(wǎng)膜缺失，脈絡(luò)膜血管較正常，視網(wǎng)膜處更清 晰，裂孔周圍Imm范圍內(nèi)網(wǎng)膜稍隆起，該處脈絡(luò)膜血管模糊不清。注入hAD-MSCs后，在玻璃 體內(nèi)，網(wǎng)膜孔及附近網(wǎng)膜上方可見渾濁細(xì)胞懸液。1. 10、OCT和眼底檢查 手術(shù)后第2、4、8、12、20和32日對每只術(shù)眼行三維OCT檢查，掃描范圍裂孔周圍6mm視網(wǎng)膜。每只眼不同時間均取裂孔中心同一平面截取二維視網(wǎng)膜裂孔OCT圖像，比較 不同天數(shù)裂孔處視網(wǎng)膜厚度變化。比較相同天數(shù)hAD-MSCs移植組與對照組裂孔形態(tài)異同。 同時拍攝眼底彩照。1.11、RT-PCR1、將凍存的組織研磨碎后放入1. 5mLEp管中。2、加入Trizollml于Ep管中震蕩。3、加入氯仿200 μ L，劇烈震蕩15s，靜置20min。4、12000rpm，離心 15min。5、移取上清至新的Ep管中，加入等量異丙醇，混勻后靜置IOmin。6、12000rpm，離心 lOmin。7、去上清，用75%乙醇700ul洗沉淀，7500rpm離心5分鐘，棄上清，控干。加入去 離子水溶解RNA。8、測量RNA的純度和含量。9、取 2yL cDNA 模板，力口入 buffer 2 μ L, Mg2+(50mM) 1. 2μ L,5'和 3'引物各 1 μ L, dNTP 2 μ L，Taq酶0.2 μ L，純水10. 6 μ L，進(jìn)行PCR反應(yīng)。所用引物分別為β-actin F，5，-GCT CCT CCT GAG CGC AAG TA-3，R，5， -GAT GGA GGG GCC GGA CT-3，CK18 F，5，-CGC ATC GTC TTG CAG ATC GAC—3，R，5， -GCT GAG ACC AGT ACT TGT CCAG-3，human β—actin F，5，-CTG GAA CGG TGA AGG TGA CA—3，R，5， -AAG GGA CTT CCT GTA ACA ATG CA-3，PCR條件為94°C IOmin ；94°C變性 40s，60°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，循環(huán) 34 次； 最后72°C延伸lOmin。10,PCR結(jié)果進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓75伏，時間30min。觀察電泳結(jié)果。1. 12、實時定量 RT-PCR我們應(yīng)用Takara公司SYBR Premix Ex Taq 試劑盒，在ABI7500實時定量PCR 儀上進(jìn)行Real time RT-PCR實驗。為了防止提取的總RNA中污染基因組DNA，對實驗結(jié)果 產(chǎn)生干擾，我們所用的引物對均跨越內(nèi)含子，引物序列如下human β-actin F，5，-CTG GAA CGG TGA AGG TGA CA-3，；R，5， AAG GGA CTT CCT GTA ACA ATG CA—3，；BMP7F，5，-ACG GAC AGG GCT TCT CCT AC-3，，R，5， -ATG GTG GTA TCG AGG GTG GAA—3，。反應(yīng)在25μ 1 體系中進(jìn)行，包含 1μ 1 模板 cDNA，12. 5μ 1 2XSYBR Green I MasterMix, 0. 5μ 1 ROX校正染料，200nM上、下游引物。條件為95°C預(yù)變性IOs ；95°C變性 5s，60°C退火，延伸40s，循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后，溶解曲線分析和瓊脂糖電泳證實產(chǎn)物的特 異性，每對引物的反應(yīng)均包括一個無模板對照。我們以0-皿^11為內(nèi)參，1 ^-7-(3為校正 器(calibrator)，采用2_[Δ 法來計算MCF_7_ih細(xì)胞基因表達(dá)的相對值，公式如下基因 的相對值=2_[ΔΔα]，AACt= ACtsample-ACtcalibrator ； Δ Ct = Ctgeneofinterest-Ct 0_actinO 我們 對每份模板的每個基因都設(shè)置了 3個重復(fù)孔，獨立的實驗重復(fù)至少3次。
1. 13、伊文思藍(lán)法1、制備 伊文思藍(lán)在甲酰胺中不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、按1. 33ml/kg腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液麻醉。3、麻醉后將大鼠固定在解剖臺上，鈍性分離右側(cè)頸靜脈和頸動脈，分別留置靜脈 和動脈插管，用100IU/ml的肝素鹽水潤管。4、按45mg/kg的劑量從右側(cè)頸靜脈注射伊文思藍(lán)染料，10秒鐘注入。5、2分鐘后通過頸動脈取血0.2ml。6、注射后每20分鐘從頸動脈插管取血0. 2ml，直到120分鐘時自左心室取血得到 最終血漿濃度；7、打開大鼠胸腔，左心室灌注37 °C的檸檬酸鈉緩沖液(pH值4. 5)，壓力為 1 OOmmHg，2 分鐘；8、灌注后立即取出大鼠眼球，顯微鏡下分離出視網(wǎng)膜；9、視網(wǎng)膜在烘箱鐘干燥1小時，稱重后將視網(wǎng)膜置于0.3ml甲酰胺溶液鐘，70°C保 溫10小時；10、4°C離心，l2000rpm，45 分鐘，取出上清；11、取50ul上清用分光光度計測量620nm和720nm的吸光光度值，計算凈A值= A620nm-A720nm ；12、將各次動脈血標(biāo)本混勻，4°C離心10000rpm，20分鐘，取上清液，用甲酰胺稀 1 500稀釋，分光光度計測量，同上；13、依照標(biāo)準(zhǔn)的伊文思藍(lán)在甲酰胺鐘的公式，計算各個標(biāo)本中伊文思藍(lán)的濃度；根據(jù)下列公式計算BRB損傷情況
伊文思藍(lán)(Hg) /視網(wǎng)膜重量(g)_
伊文思藍(lán)的血漿平均濃度(ug) /血漿(ul) x2 (h)實施例2 人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在腎臟缺血再灌注模型中的作用及機(jī)制的 研究2. 1、培養(yǎng)的hAD-MSCs的形態(tài)和表型從人脂肪中分離得到的MSCs在原代培養(yǎng)中，有兩類細(xì)胞，一種為成纖維細(xì)胞樣， 分散生長；另一種為內(nèi)皮細(xì)胞樣，呈多角形，緊密生長。經(jīng)過傳代，內(nèi)皮樣細(xì)胞逐漸減少，傳 至第2代時，基本消失，視野中都為梭形細(xì)胞(圖1.B)。流式表型分析，hAD-MSCs高表達(dá) ⑶29、⑶44、⑶105和Flk-I，而造血及內(nèi)皮標(biāo)志(⑶31、⑶34和⑶45)為陰性，并且其低表達(dá) MHC II類分子(圖1. A)。細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)hAD-MSCs都位于G0/G1期(圖1. C)。 我們分離培養(yǎng)的hAD-MSCs，具有多系分化潛能，免疫表型⑶11a，⑶31，⑶34，⑶45，HLA-DR 結(jié)果為陰性，⑶29，⑶44，⑶105，⑶166，Scar-1, Flk-I為陽性，體外誘導(dǎo)分化結(jié)果顯示， hAD-MSCs在體外可以分化為上皮樣的細(xì)胞，與體內(nèi)實驗結(jié)果一致。2. 2、人脂肪來源的MSCs在I/R模型中的作用2. 2.1、病理結(jié)果我們的實驗采用了腎臟缺血再灌注模型，模型小鼠分為兩組，移植組和對照組，分 別在損傷后24小時內(nèi)，經(jīng)尾靜脈注射給予1 X 106hAD-MSCs和等體系的生理鹽水。移植后3天、3周、以及6個月，分別取兩組小鼠的右側(cè)腎臟進(jìn)行病理檢測。H&E染色后觀察發(fā)現(xiàn)I/R 后3天，對照組腎臟近曲小管出現(xiàn)水腫，周圍有炎細(xì)胞浸潤，但是沒有顯著的壞死(圖2. A)； 而移植組腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常(圖2. B)。3周后，對照組腎間質(zhì)區(qū)大量炎癥細(xì)胞浸潤，小 管上皮細(xì)胞壞死，小管結(jié)構(gòu)喪失，出現(xiàn)纖維化(圖2. C)；而移植組，腎間質(zhì)區(qū)僅有少量炎癥 細(xì)胞，小管結(jié)構(gòu)完整(圖2. D)。造模后6月，移植組的腎臟結(jié)構(gòu)基本修復(fù)(圖2. F)，而在對 照組腎臟切片中可見腎小球聚集，形成纖維化修復(fù)(圖2. E)。2. 2. 2、膠原染色為了定量評估兩組小鼠的纖維化癥狀，進(jìn)一步進(jìn)行Masson三色染色，并通過膠 原沉積面積與組織總面積的比值(膠原沉積率)量化評估纖維化程度(圖3. E)。結(jié)果顯 示，I/R后10天處死的小鼠(對照組)腎臟出現(xiàn)大量膠原沉積(圖3. A)，膠原沉積率為 0. 37549士0. 03111 ；而在缺血再灌注損傷后給予hAD_MSCs治療的小鼠腎臟，10天后膠原 量明顯較對照組少(圖3. B)，膠原沉積率為0. 10997士0. 02045 ；相應(yīng)的，I/R六個月移植 組的膠原沉積量為0. 54712 士0. 03190 (圖3. D)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照組的0. 19217 士0. 06067 (圖
3.C)。由此可見，供者來源的hAD-MSCs植入一定程度上改善了腎臟缺血再灌注損傷的小鼠 腎臟組織，并且能夠減少膠原分泌積聚，有效的抑制了纖維化的形成。2. 3hAD-MSCs的植入與分化2. 3. 1、hAD-MSCs在模型小鼠腎臟組織中的分布我們將菲立磁標(biāo)記的人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hAD-MSCs)移植到I/R模型小 鼠中。RT-PCR結(jié)果顯示，I/R后3天和10天，移植組腎臟表達(dá)人特異性的β-actin(圖
4.A)。菲立磁的普魯士藍(lán)染色顯示，I/R后3天，腎臟皮質(zhì)區(qū)小管(圖4. D)和間質(zhì)(圖4. H) 處有呈藍(lán)色顆粒樣的陽性細(xì)胞存在，10天結(jié)果與三天類似(圖4. C)。因此我們選擇3天這 個時間點進(jìn)行檢測。通過免疫組化方法，用抗人核抗體檢測人源細(xì)胞在小鼠腎臟的分布，結(jié) 果與之類似(圖4. E，I)。為了與研究報道有所比較，我們分別將Rosa鼠和EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓來源的間 充質(zhì)干細(xì)胞(mBM-MSC)，輸注到缺血再灌注損傷的模型鼠，分別定義為Rosa移植組(Rosa mice-donor group)和 GFP 移植組(EGFP mice-donor group)。分別在 I/R 后 3 天取各組的 腎臟組織進(jìn)行檢測。通過免疫組織化學(xué)方法，用β _gal，綠色熒光蛋白抗體分別檢測Rosa 鼠(圖4. F，G)和EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠(圖4.G，K)的供體MSCs細(xì)胞的歸巢情況，如圖所示， I/R后3天在腎皮質(zhì)小管及間質(zhì)處均可以看到陽性細(xì)胞分布。上述實驗結(jié)果提示植入受損腎臟組織的異體MSC可植入到在受損腎臟的間質(zhì)和 皮質(zhì)區(qū)小管。2. 3. 2、植入到腎臟的hAD-MSCs表達(dá)小管標(biāo)志 在上面的結(jié)果中，觀察到植入的MSC分布在腎臟小管和間質(zhì)中，為了進(jìn)一步驗 證處于小管位置的外源性細(xì)胞的確分化為小管上皮細(xì)胞，用pan-CK和抗人核抗體對 hAD-MSCs移植后3天的腎臟組織切片進(jìn)行免疫熒光雙染，結(jié)果顯示，分布于小管的抗人核 陽性的供體細(xì)胞(紅色熒光)pan-CK染色同時呈陽性結(jié)果(綠色熒光)，表明體內(nèi)注射MSC 可以分化為腎臟小管上皮細(xì)胞(圖5.A-C)。為了驗證這一結(jié)果，用RT-PCR的方法檢測移 植后3天的腎臟組織，結(jié)果顯示，在移植后3天，移植組的人特異的β -actin表達(dá)，且同時 表達(dá)人特異的上皮表達(dá)基因CK18 ；對照組顯示為陰性(圖5. G)。說明我們移植到受體鼠的hAD-MSCs可以分布到缺血再灌注損傷的腎臟，并且表達(dá)上皮特異基因。上述結(jié)果表明移植 到受損腎臟組織的hAD-MSCs可以直接分化為腎小管上皮細(xì)胞，參與對損傷腎臟的修復(fù)。2. 3. 3、MSC可在體外誘導(dǎo)為上皮樣細(xì)胞因為對于MSC是否可以分化為腎小管上皮等上皮細(xì)胞存在較大爭議，將hAD-MSC 擴(kuò)增后以腎小管上皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3周，光學(xué)顯微鏡觀察可見，經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)明顯 改變，梭形細(xì)胞逐漸變短，最終成為典型的上皮樣多邊形細(xì)胞(圖6. B)，免疫熒光顯示約 60%的細(xì)胞表達(dá)pan-CK(圖6. C)，同時RT-PCR結(jié)果顯示CK18表達(dá)陽性(圖6. E)。這部分 結(jié)果證實了 MSC細(xì)胞群具有向上皮分化的潛能，與體內(nèi)結(jié)果相互印證。2. 3. 4、植入細(xì)胞數(shù)量與分布比例的關(guān)系在確認(rèn)了 hAD-MSCs在腎臟組織損傷早期確實能夠植入，并且能夠分化為腎小管 上皮細(xì)胞之后，我們猜想，引發(fā)對于細(xì)胞是否直接分化的爭論的根源可能與移植數(shù)量相關(guān)。 我們分別將1 X IO5和1 X IO6個菲立磁標(biāo)記的hAD-MSCs經(jīng)尾靜脈移植到模型鼠中，移植后 三天取材，進(jìn)行普魯士藍(lán)染色和相對定量real time PCR檢測。普魯士藍(lán)染色顯示，兩組切 片的陽性細(xì)胞均在腎臟小管和間質(zhì)分布，與之前結(jié)果相同，而高劑量組切片上陽性細(xì)胞數(shù) 量高于低劑量組，但以半定量RT-PCR量化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高劑量組人來源的看家基因表達(dá)量雖 然較低劑量略高，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異(圖7)。以上結(jié)果說明移植細(xì)胞的數(shù)量與MSC在腎臟 組織分布有一定的比例關(guān)系，但是對于細(xì)胞分布和分化的性質(zhì)不產(chǎn)生根本影響。2. 4促進(jìn)增殖2. 4. 1、分化的hAD-MSCs并非直接參與修復(fù)的主要成員我們用PCNA抗體檢測了腎臟缺血再灌注后移植組和對照組細(xì)胞增殖的情況。免 疫組化結(jié)果顯示，I/R后3天，接受hAD-MSCs移植的小鼠(移植組)腎臟增殖細(xì)胞的數(shù)目 (圖8. B)明顯高于對照組(圖8. A)；而到第10天，實驗組增殖細(xì)胞的數(shù)量減少(圖8. D)， 對照組明顯增加(圖8. C)。這一結(jié)果表明，hAD-MSCs的確能夠通過促進(jìn)增殖，加快腎臟組 織修復(fù)。為了確定向腎小管上皮分化的hAD-MSCs是否直接對受損腎臟進(jìn)行了替代性修復(fù)， 這些增殖的細(xì)胞是否即是向腎小管上皮分化的hAD-MSCs，我們進(jìn)行了 PCNA和抗人核抗體 的免疫熒光雙染。染色結(jié)果顯示，雙陽性的細(xì)胞占的比例很少，也就是說供體細(xì)胞本身很少 在大量增殖，但同時也可以觀察到，供體細(xì)胞較多分布的區(qū)域與增殖細(xì)胞較多分布的區(qū)域 是吻合的(圖8. E-G)。這些結(jié)果說明，hAD-MSCs可能通過直接分化為腎小管上皮細(xì)胞參與修復(fù)，但并不 是其修復(fù)受損腎臟組織的主要成員，而可能是在通過某些途徑激活內(nèi)源性的修復(fù)，加快I/R 損傷后腎臟的修復(fù)中起重要作用。2. 4. 2、hAD-MSCs 的植入促進(jìn) BMP7 表達(dá) 實時定量RT-PCR方法檢測I/R后1天和3天，移植組和對照組腎臟組織中BMP7 表達(dá)，結(jié)果顯示，移植組BMP7的表達(dá)量明顯高于對照組(圖9. E)。我們進(jìn)一步用抗BMP7抗 體進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色，腎皮質(zhì)的小管和腎小球的足細(xì)胞可見陽性結(jié)果(圖9. B，D)。 可見，hAD-MSCs的植入促進(jìn)了損傷腎臟BMP7高表達(dá)，從而促進(jìn)腎臟內(nèi)源性修復(fù)。實施例3 hAD-MSCs在視網(wǎng)膜變性大鼠模型中的作用3. 1、hAD-MSCs移植后治療效果的病理評估正常大鼠視網(wǎng)膜色素上皮層完整，PRE細(xì)胞單層扁平，排列整齊連續(xù)，光感受器細(xì)胞外節(jié)縱行規(guī)律排列，視網(wǎng)膜各層清晰。碘酸鈉注射后，視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞首先受到破壞， 如圖所示，注射后1天RPE細(xì)胞數(shù)量開始減少，光感受器細(xì)胞外節(jié)層排列開始出現(xiàn)紊亂。 hAD-MSCs移植組(圖10. B)，與對照組(圖10. A)視網(wǎng)膜破壞程度和修復(fù)情況基本沒有差 別。碘酸鈉尾靜脈注射后3天，對照組RPE細(xì)胞進(jìn)一步減少，光感受器細(xì)胞外節(jié)層薄厚不均 勻，在RPE層上方的光感受器細(xì)胞外節(jié)層里有少量巨嗜細(xì)胞出現(xiàn)，同時在RPE層上方可見大 量細(xì)胞碎片堆積，視網(wǎng)膜外核層變薄，細(xì)胞核數(shù)量減少，可見外核層塌陷；同一時間點移植 組RPE細(xì)胞較多，光感受器細(xì)胞外節(jié)層薄厚均勻，在RPE層上方的光感受器細(xì)胞外節(jié)層里基 本不能觀察到巨嗜細(xì)胞的分布，RPE層上方少見細(xì)胞碎片，視網(wǎng)膜外核層較厚，細(xì)胞核數(shù)量 變化不明顯，外核層無明顯塌陷。碘酸鈉尾靜脈注射后7天，大鼠視網(wǎng)膜上大量光感受器細(xì) 胞外節(jié)進(jìn)解，視網(wǎng)膜外核層塌陷。外核層，甚至內(nèi)核層直接貼附在Bruch’ s膜上，整個視網(wǎng) 膜切面呈拱橋樣改變，周邊視網(wǎng)膜亦受累，中央視網(wǎng)膜較周邊視網(wǎng)膜受損明顯(圖10. C)； 同一時間點移植組大鼠視網(wǎng)膜上光感受器細(xì)胞外節(jié)發(fā)生形變，視網(wǎng)膜外核層局部位置出現(xiàn) 凹陷，結(jié)構(gòu)基本保持完整(圖10. D)。碘酸鈉尾靜脈注射后7天，視網(wǎng)膜損傷達(dá)到峰值，在移 植后2周、3周、6周，受損眼球病理結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯改變(圖10.E，G，I)，而移植組進(jìn)一 步修復(fù)(圖10. F，H)，在移植后6周，結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)(圖10. J)，與正常鼠眼類似。從以上結(jié)果可見，移植后1周、2周、3周、6周、12周移植組視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞、光感 受器細(xì)胞數(shù)量、光感受器細(xì)胞層厚度、視網(wǎng)膜外核層塌陷程度和數(shù)量，均好于對照組。 3. 2、hAD-MSCs在視網(wǎng)膜變性大鼠體內(nèi)的分布、分化和療效觀察hAD-MSCs移植后1周、2周、3周均可見視網(wǎng)膜RPE層和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層有 hAD-MSCs存在，并且整合到宿主的RPE層和毛細(xì)血管內(nèi)皮中，表現(xiàn)出RPE細(xì)胞和血管內(nèi)皮 細(xì)胞特有形態(tài)，第3周時還可見一些hAD-MSCs存在于視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞層。6周和3個 月時僅見視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞層散在hAD-MSCs存在。第1、2周，hAD-MSCs雖然整合到宿 主脈絡(luò)膜毛細(xì)血管和視網(wǎng)膜外層，但是并沒有表達(dá)宿主靶細(xì)胞特有的標(biāo)志。到第3周，可見 hAD-MSCs分布于視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞層、RPE層和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層，并且表達(dá)光感受器 細(xì)胞標(biāo)志Rhodopsin、RPE細(xì)胞標(biāo)志MITF、血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志vWF(圖11)。實施例4 干細(xì)胞在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的應(yīng)用4.1、hAD-MSCs 對 BRB 功能的改善BRB在DR早期開始損傷，我們采用了伊凡思藍(lán)染色方法來檢測糖尿病大鼠BRB 功能的改變。如圖12所示，與正常大鼠(7.0士0.6)相比細(xì)胞移植前DR大鼠BRB水 平(20. 8 士 3.1)明顯上升；hAD-MSCs移植后1周，移植組(9. 9 士 1.5)滲漏水平較對 照組(20. 2 士 2. 8)有所下降；植入后2周結(jié)果與1周類似，移植組對照組9.8 士 1.6vs 19. 5士4. 0 ；移植后4周，移植組基本恢復(fù)正常，達(dá)到8. 0士 1. 2，而對照組依然維持在較高水 平19. 2士0. 3。由此可見，hAD-MSCs的輸入對于BRB滲漏水平明顯改善，顯著提高了 BRB的 功能。4. 2、血糖改變我們分別觀察DR在細(xì)胞植入后1周、2周和4周血糖的變化(圖13)，結(jié)果顯示，植 入后1周，移植組DR大鼠的血糖(19. 7士4. 9ml/L)較對照組(21. 9士3. 2ml/L)有所下降，但 二者之間沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。細(xì)胞植入后2周，移植組血糖進(jìn)一步下降(14. 5士4. 9ml/ L)，而對照組沒有變化(24. 3士2. 9ml/L)。到第4周移植了 hAD-MSCs的大鼠血糖下降到10. 6士4. 5ml/L ；對照組血糖一直維持在高水平(22. 1 士2. lml/L)。hAD_MSCs的植入確實可 以降低DR大鼠的血糖水平，可能對于減輕視網(wǎng)膜損傷有一定的作用。4. 3、hAD-MSCs在視網(wǎng)膜細(xì)胞的分化及分布我們之前的研究顯示，hAD-MSCs可以分布在多種損傷的組織，這里我們使用抗人 核抗體，通過免疫熒光方法檢測供體細(xì)胞在眼底的分布狀況。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞 移植后一周，植入細(xì)胞在視網(wǎng)膜的內(nèi)核及外核層都有分布。隨后，抗Rhodopsin、抗GFAP和 抗人核的免疫熒光雙染顯示，分布在視網(wǎng)膜的供體細(xì)胞也表達(dá)感光細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的的標(biāo)志。實施例5 在視網(wǎng)膜裂孔疾病模型中的應(yīng)用5.1、三維 OCT 檢查視網(wǎng)膜裂孔術(shù)后第2日，手術(shù)眼內(nèi)氣體基本吸收完全，行兔眼三維OCT及眼底檢 查顯示裂孔大小約1. 5mm左右，邊緣整齊近圓形，網(wǎng)膜復(fù)位無脫離，裂孔處RPE層無損傷。 術(shù)眼玻璃體清，OCT成像清晰，術(shù)眼視網(wǎng)膜裂孔周邊網(wǎng)膜復(fù)位良好，視網(wǎng)膜裂孔邊緣及裸露 RPE層均無新生組織形成(圖15.A)。眼底檢查示裂孔范圍視網(wǎng)膜呈蒼白色，遮擋脈絡(luò)膜 血管。hAD-MSCs移植組與對照組受體眼三維OCT檢查圖像基本相同，未見明顯細(xì)胞團(tuán)堆積 (圖 15. B)。術(shù)后第4日，對照組的術(shù)眼視網(wǎng)膜裂孔邊緣界限消失，修復(fù)組織出現(xiàn)，新生組織在 裂孔邊緣最為豐富，向裂孔中心逐漸減少，裂孔中心處修復(fù)組織薄，厚度約為正常視網(wǎng)膜厚 度的1/5 (圖15. C)。hAD-MSCs移植組的術(shù)眼視網(wǎng)膜裂孔邊緣也始修復(fù)，孔中心厚度達(dá)約為 正常視網(wǎng)膜的1/2(圖15. D)。眼底檢查視網(wǎng)膜裂孔處呈乳白色，余視網(wǎng)膜正常。術(shù)后12日，對照組與hAD-MSCs移植組視網(wǎng)膜裂孔均進(jìn)一步修復(fù)。hAD-MSCs移植 組裂孔中心厚度即恢復(fù)到與正常視網(wǎng)膜基本相同(圖15. F)，對照組裂孔中心厚度為正常 的1/2 (圖15. E)。眼底檢查較前無明顯變化。術(shù)后20日對照組裂孔中心厚度仍僅約為正 常視網(wǎng)膜的2/3 (圖15. G)，且不再有明顯變化。眼底檢查較前無明顯變化。術(shù)中對照組2只小鼠術(shù)后裂孔邊緣的視網(wǎng)膜未完全復(fù)位，裂孔邊緣翹起，邊緣貼 附于RPE層處出現(xiàn)新生修復(fù)組織，而翹起處無修復(fù)組織出現(xiàn)，至術(shù)后3周裂孔均仍未閉合， 于裂孔局部注入hAD-MSCs懸液10 μ 1 (約1 X IO5)，移植后術(shù)眼裂孔修復(fù)，修復(fù)過程與干細(xì) 胞移植組一致。5. 2、病理檢查術(shù)后1個月，HE染色結(jié)果顯示，對照組視網(wǎng)裂孔處組織厚度較正常視網(wǎng)膜略薄，正 常視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)不清晰，基本被膠原纖維樣組織所替代，裂孔處細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)為近 圓形或長圓形，部分為長桿狀(圖16. A)。hAD-MSCs移植組術(shù)后1個月，裂孔修復(fù)組織略高 出兩側(cè)正常視網(wǎng)膜，裂孔處細(xì)胞的細(xì)胞核多為不規(guī)則圓形，基本不存在長桿狀細(xì)胞核(圖 16. B)。5. 3、修復(fù)后裂孔的細(xì)胞分型為了進(jìn)一步了解裂孔修復(fù)的情況，我們分別采用GFAP(膠質(zhì)纖維酸性蛋白，glial fibrillary acidic protein，GFAP)，R0PSIN，PKC抗體對膠質(zhì)細(xì)胞、感光細(xì)胞和雙極細(xì)胞進(jìn) 行了標(biāo)記。結(jié)果顯示，對照組術(shù)眼裂孔處只有GFAP陽性細(xì)胞在裂孔修復(fù)組織、脈絡(luò)膜視網(wǎng) 膜粘合處廣泛分布，走向與RPE層平行(圖17.A)。裂孔處雙極細(xì)胞標(biāo)記抗原PKC、感光細(xì)胞標(biāo)記抗原Opsin免疫熒光檢測均為陰性(圖17. D. G)。而移植組術(shù)眼裂孔處除大量無序 分布的GFAP陽性的膠質(zhì)細(xì)胞外(圖17. B)，可見少量Ropsin陽性的感光細(xì)胞(圖17. E)和 PKC陽性的雙極細(xì)胞(圖17. H)分布。這個結(jié)果提示，移植組和對照組均主要以膠質(zhì)細(xì)胞修 復(fù)為主，但同時移植組有少量感光細(xì)胞及雙極細(xì)胞分布，而對照組僅為膠質(zhì)修復(fù)。5. 4、植入的MSC在損傷部位的分布及分化我們用抗人核抗體檢測植入的hAD-MSCs在裂孔處的分布情況。如圖所示，裂孔處 可見少量散在分布的抗人核陽性的供體細(xì)胞。進(jìn)一步通過免疫熒光雙染檢測供體細(xì)胞的分 化，結(jié)果可見，部分供體細(xì)胞表達(dá)GFAP抗原(圖18. A-C)，同時少量供體細(xì)胞表達(dá)Opsin (圖 18. D-F)，而PKC抗原陽性的細(xì)胞和與抗人核陽性的細(xì)胞沒有重疊。上述結(jié)果說明，供體來 源的間充質(zhì)干細(xì)胞通過直接分化參與了模型小鼠眼損傷的修復(fù)，但僅局限于很小的數(shù)目， 對于裂孔的修復(fù)不起決定性作用。序列表<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在腎臟、眼底疾病中的用途<130>890136CG<160>10<170>PatentIn version 3.4<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1gctcctcctg agcgcaagta20<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>2gatggagggg ccggact17<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3cgcatcgtct tgcagatcga c21<210>4<211>22<212>DNA <213>人工序列
<400>4gctgagacca gtacttgtcc ag 22<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5ctggaacggt gaaggtgaca20<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>6aagggacttc ctgtaacaat gca 23<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7ctggaacggt gaaggtgaca20<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>8aagggacttc ctgtaacaat gca 23<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9acggacaggg cttctcctac20<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>10atggtggtat cgagggtgga a2權(quán)利要求
1.人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療腎臟和/或眼底疾病的細(xì)胞制劑中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的腎臟疾病包括急性腎損傷、腎臟纖維化、腎 小管上皮細(xì)胞損傷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的眼底疾病包括視網(wǎng)膜變性、糖尿病視網(wǎng)膜 病變、視網(wǎng)膜裂孔。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其中所述的視網(wǎng)膜變性為視網(wǎng)膜色素變性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的用途，其中每單位所述的細(xì)胞制劑包含IXlO5 至IXlO6個人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的用途，其中所述的人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞 是種子細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的用途，其中所述的人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞 免疫表型為 CDlla，CD31, CD34, CD45, HLA-DR 為陰性，CD29, CD44, CD105, CD166, Scar-I, Flk-I為陽性，并且低表達(dá)MHC II類分子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的用途，其中所述的細(xì)胞制劑為靜脈注射劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其中所述的細(xì)胞制劑為視網(wǎng)膜下注射劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在腎臟、眼底疾病中的用途。本發(fā)明提供人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療腎臟和/或眼底疾病的細(xì)胞制劑中的用途，所述的疾病可以是急性腎損傷、腎臟纖維化、腎小管上皮細(xì)胞損傷、視網(wǎng)膜變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變或視網(wǎng)膜裂孔等。本發(fā)明的細(xì)胞制劑可促進(jìn)腎臟構(gòu)和受損眼球病理結(jié)構(gòu)的修復(fù)，具有良好的效果。
文檔編號A61P13/12GK102048756SQ20091020932
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月4日
發(fā)明者于偉鴻, 晁緯靜, 李康華, 楊治坤, 王旭倩, 董方田, 趙春華, 趙潺, 閆曦, 韓欽 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所