專利名稱：含有生脂間充質(zhì)干細胞的聚乙二醇－雙丙烯酸酯(pegda)交聯(lián)的水凝膠的制作方法
使用包埋在生物相容的水凝膠中的成體間充質(zhì)干細胞，將包括脂肪組織和成纖維細胞在內(nèi)的軟組織生物工程化為預(yù)定的形狀和尺寸。
背景軟組織缺損的修復(fù)是當(dāng)代醫(yī)療實踐的重大挑戰(zhàn)。多種類型的乳腺癌和面部癌癥是危及生命的并且一旦將其切除就會造成患者的軟組織缺損和變形。乳房切除術(shù)和腫瘤切除外科手術(shù)是必須的手術(shù)操作的實例，這種手術(shù)操作需要替換缺失的軟組織以恢復(fù)自然形狀和/或生理功能。在諸如基底細胞癌、鱗狀上皮細胞癌、黑素瘤以及其它頭與頸部癌癥等癌癥切除術(shù)之后，需要面部整形手術(shù)。改善的癌癥醫(yī)學(xué)控制可以提高生存率，并且使癌癥生存者產(chǎn)生恢復(fù)其軟組織缺損的形態(tài)和功能的愿望。在戰(zhàn)爭期間造成的損傷會導(dǎo)致除了骨骼損傷以外的軟組織創(chuàng)傷。與工作相關(guān)的事故和交通事故是造成軟組織缺損的其它原因。在燒傷后軟組織缺損不僅需要對皮膚而且還要對皮下軟組織進行重建。在先天異常，例如半側(cè)面部肢體發(fā)育不良(與另一側(cè)面部相比一側(cè)面部發(fā)育不良)中，缺損大量的軟組織并且需要對其進行重建。在2003年，美國有總共約6百萬個體接受了由整形外科醫(yī)生進行的重建手術(shù)操作(美國整形外科醫(yī)生協(xié)會，http://www.plasticsurgery.org/public_education/2004Statistics.cfm)。
在美國，2002年在外科美容操作上花費了約50億美元，在非外科美容操作上花費了約20億美元(例如膠原注射)。與之相關(guān)的是一年進行的約7百萬整容外科和非外科操作。
近幾十年來，外科醫(yī)生使用其創(chuàng)造性的智慧改善了軟組織重建操作。在軟組織重建操作中自體軟組織移植和合成材料是主要的實踐。每種方法均具有其優(yōu)缺點，并且適合基于臨床判斷的特定類型的患者和軟組織缺損。不幸的是，當(dāng)前的軟組織重建和增大操作并不理想，其具有不良副作用，例如供體部位發(fā)病、泄漏、突出、不自然的結(jié)構(gòu)、再吸收以及免疫排異反應(yīng)。雖然已經(jīng)將自體成熟脂肪組織用作軟組織缺損的填充物，但是結(jié)果難以預(yù)見的。體積減少似乎是自體移植物高達70％的再吸收的主要問題。自體軟組織移植的體積減少可能是由于移植的成熟脂肪細胞的細胞凋亡，這是因為移植的成熟脂肪細胞對局部缺血和較低的血管再造率的耐受性較低。脂肪切除術(shù)或吸脂操作提供脂肪移植的另一途徑。已經(jīng)將通過吸脂作用分離的成熟脂肪細胞的單細胞混懸液與支架結(jié)合并移植以填充軟組織缺損。然而，體積減少仍然是個問題，這可能是因為成熟脂肪細胞的85％的細胞質(zhì)是脂質(zhì)，這導(dǎo)致對血管生成的巨大需求。在大多數(shù)嚴(yán)重的病例中，來自吸脂抽吸物的脂肪移植物伴隨著非最理想的血液供給和移植物的壞死。由吸脂作用造成的機械應(yīng)激會造成高達90％植入的脂肪細胞的損害。另一復(fù)雜因素是成熟脂肪細胞是完全分化的并且不再增殖，這導(dǎo)致脂肪移植物中的生脂細胞的不足。
與成熟脂肪細胞相比，優(yōu)選通過切除或吸脂操作可以從動物或人類脂肪組織分離的前脂肪細胞(pre-adipocytes)，這是因為前脂肪細胞被認(rèn)為能夠通過用于回輸?shù)捏w外處理(ex vivo)增殖至某一程度，并且與成熟脂肪細胞相比，其低氧環(huán)境更耐受。然而，在切除和/或吸脂操作期間可能損傷某些前脂肪細胞。已經(jīng)將諸如3T3-L1和3T3-F442A等若干前脂肪細胞細胞株用于在諸如PGA網(wǎng)等的生物材料中工程化脂肪組織。雖然這些生脂細胞系對于體外研究來說十分有價值，但是它們是永生的并且因此對于體內(nèi)前脂肪細胞的工程化來說，它們不如原代前脂肪細胞那么有價值。例如，接種在多孔PLA支架中的前脂肪細胞在體內(nèi)產(chǎn)生脂肪組織。被肽連接的藻酸鹽移植物支持接種的綿羊前脂肪細胞的附著和增殖以及脂肪組織的形成。向人類和鼠類外源性輸送的bFGF據(jù)報道可以在膠原或Matrigel支架中促進連續(xù)的生脂分化和脂肪組織的形成。
間充質(zhì)干細胞(MSCs)來自胚胎干細胞并分化為形成全部結(jié)締組織的細胞系，該結(jié)締組織例如脂肪組織、軟骨、骨、骨骼肌以及間質(zhì)纖維組織?？梢詮墓撬?、脂肪組織、乳牙和骨骼肌中分離MSCs。除了其多潛能的性質(zhì)以外，MSCs可以自我更新并且復(fù)制許多代而不喪失其干細胞特性(stemness)。MSCs是首先被分離并鑒別為附著在細胞培養(yǎng)Petri培養(yǎng)皿上的成纖維細胞樣的細胞。在人類中，通常從髂嵴上骨髓中抽吸MSCs，然而通常從脛骨和股骨的中段骨干中抽吸鼠類的MSCs。根據(jù)以曝光的各種已確立的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，例如生脂的、軟骨形成的、成骨的、生肌的等，MSCs分化進入確定的途徑并且開始表達相應(yīng)細胞系的基因和蛋白質(zhì)標(biāo)志物特征。
間充質(zhì)干細胞(MSCs)是生脂細胞和脂肪細胞的祖細胞。末期的脂肪細胞既不復(fù)制也不進一步分化。因此，在其它因素之中，脂肪細胞形成細胞的缺少造成了當(dāng)前軟組織移植操作后的體積減少。據(jù)報道，人間充質(zhì)干細胞(hMSCs)可以在Petri培養(yǎng)皿的單層培養(yǎng)物中分化為生脂細胞。已經(jīng)描繪了在體外人MSCs脂肪形成期間所表達的大量的基因。
通常需要支架材料提供對工程化移植物中組織形成細胞的最初的粘著和支撐。對于努力之成功，為特殊的組織工程應(yīng)用選擇合適的支架是重要的。組織的發(fā)育取決于結(jié)構(gòu)環(huán)境、細胞-生物材料相互作用以及支架中結(jié)合的潛在生物信號。
基于細胞的脂肪組織工程的先前的工作主要使用多孔支架。然而，脂肪組織工程中多孔支架的常見缺點是與侵入宿主細胞產(chǎn)生的酶潛在相關(guān)的成熟前的再吸收和/或多孔支架的降解。包括膠原、彈力蛋白、透明質(zhì)酸、瓊脂糖、藻酸鹽、殼聚糖和聚乙二醇水凝膠在內(nèi)的水凝膠涵蓋支架的大部分。PEG水凝膠被用于包囊包括軟骨細胞和成骨細胞在內(nèi)的多種類型的細胞。據(jù)報道，PEGDA水凝膠的流變學(xué)和恢復(fù)性質(zhì)具有可與人類腹部脂肪組織可比擬的若干參數(shù)。
重建和整形外科關(guān)注于特殊的形狀和尺寸。假定如果實現(xiàn)了從干細胞成功地得到工程化的組織腎臟，只要工程化的腎臟在體內(nèi)功能正常，那么就不再需要與患者正常腎臟相同的精確的形狀。相反地，必須恢復(fù)如

圖1A和B所示的軟組織缺損以使其具有除了生理功能以外，還必須具有原始的形狀和尺寸。隨著時間的流逝體積減少可以高達60％。事實上，在外科文獻中的軟組織重建的其它并發(fā)癥中，軟組織移植物的“術(shù)后體積減少”是主要問題。
雖然諸如瘢痕化或非最理想的組織整合可能造成體積減少，但是推測主要問題是缺少能夠1)持續(xù)合成脂肪和纖維基質(zhì)以維持體積，以及2)自我復(fù)制以補充脂肪和纖維基質(zhì)形成細胞的供給的結(jié)合的細胞。諸如脂肪細胞的末期細胞不能滿足這些需求。
在組織工程中應(yīng)用生物材料的主要障礙是非最理想的組織向內(nèi)生長和較弱的血管化作用。已經(jīng)用于體內(nèi)的生物材料的成功歸因于替代的諸如軟骨和皮膚等宿主組織的無血管性質(zhì)。天然軟骨和皮膚很大程度上無血管并在缺少血管化作用中營養(yǎng)素的擴散十分稀少。然而，對于尺寸大于幾毫米的工程化的組織或器官體內(nèi)組織形成細胞的存活通常是很弱的，然而，需要更大質(zhì)量的組織形成細胞以工程化大多數(shù)組織和器官。因此，需要新生血管形成以促進組織形成細胞工程化的組織和器官的存活。
血管被認(rèn)為實質(zhì)上是通過兩種性質(zhì)不同的生物學(xué)過程形成的，血管發(fā)生(vasculogenesis)和血管生成(angiogenesis)。血管發(fā)生是由內(nèi)皮祖細胞形成毛細血管的過程。血管生成，即由已經(jīng)存在的血管來形成新的血管，對于組織發(fā)育和創(chuàng)傷愈合是重要的和必須的過程。血管生成是通過兩個機理潛在地進行的套迭和萌發(fā)。當(dāng)間充質(zhì)細胞柱遷移至已經(jīng)存在的血管中時，發(fā)生套迭血管生成。這種類型的血管生成引起局部血管網(wǎng)絡(luò)的重塑。另一方面，萌發(fā)血管生成指由存在的血管結(jié)構(gòu)形成新的血管。雖然在出生以后已經(jīng)觀察到了血管發(fā)生，但是血管生成是引起成體新血管形成的通常過程。血管生成和血管發(fā)生涉及需要大量信號處理的事件的復(fù)雜級聯(lián)反應(yīng)并且涉及多重細胞系。雖然天然組織的血管形成過程日益清晰，但是對于工程化組織的新血管發(fā)生的理解還是處于初期。
組織工程主要使用兩種方法誘導(dǎo)血管形成激發(fā)內(nèi)源性生成血管的應(yīng)答以及工程化模仿天然血管網(wǎng)絡(luò)的生物材料中的物理結(jié)構(gòu)。可以通過大量的諸如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、肝細胞生長因子(HGF)和成纖維細胞生長因子(FGF)等生成血管的分子激發(fā)靜止的內(nèi)皮細胞以便轉(zhuǎn)變?yōu)樯裳艿膬?nèi)皮細胞。除了其生成血管的活性以外，證明bFGF可以激發(fā)成骨細胞的增殖，使得bFGF對于骨組織工程變得尤其重要。
通過光刻法摹制組織工程材料中的微通道來模擬毛細血管。雖然以前在促進大量生物相容的聚合物材料中的血管生成進行了不懈的努力，但是體內(nèi)非多孔水凝膠中的新血管形成仍然是組織工程應(yīng)用的挑戰(zhàn)。
聚乙二醇(PEG)是用于組織工程中的大量水凝膠聚合物之一。PEG是無毒的和水溶性的不被免疫系統(tǒng)識別的聚合物。食品及藥物管理局(FDA)已經(jīng)批準(zhǔn)PEG在人類中進行生物應(yīng)用。PEG的優(yōu)點是對于工程化組織和器官所必須的對給定形狀和尺寸的成型性?？梢允褂霉庖l(fā)劑來生產(chǎn)PEG水凝膠，所述光引發(fā)劑導(dǎo)致線形PEG連接的丙烯酸酯低聚物結(jié)點的交聯(lián)。然而，PEG是稠密的水凝膠并且具有緩慢的降解速率，根據(jù)特定組織工程的應(yīng)用，上述特點既可以被視為優(yōu)點也可以被視為缺點。對于藥物輸送，PEG緩慢的降解速率有助于進行包被的細胞因子的控制釋放。可以通過改變分子量和PEG水凝膠的濃度來改變細胞因子的擴散速率。作為組織工程的支架，可以根據(jù)PEG的交聯(lián)、濃度和共聚作用來改變PEG的降解速率。例如，通過與聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)的共聚來改變PEG的降解速率。然而，對于體內(nèi)組織工程來說與PEG廣泛使用相關(guān)的有待解決的問題是在PEG水凝膠中宿主組織向內(nèi)生長和血管化作用的緩慢的和最小的量。
概述來自生物相容支架中的成體間充質(zhì)干細胞的生物工程化的軟組織具有預(yù)設(shè)的三維結(jié)構(gòu)；即形狀和大小或尺寸。可以從成體間充質(zhì)干細胞制備任何形狀或大小的生物工程化的軟組織構(gòu)成物并且容易在體外(in vitro)、用于體內(nèi)回輸?shù)捏w外處理(ex vivo)和體內(nèi)(in vivo)制造。這些植入物可用于由于美學(xué)、疾病、先天性畸形或創(chuàng)傷而需要整形手術(shù)的患者。
含有多種添加物的水凝膠中的間充質(zhì)干細胞提供具有降低的體積減少的植入物、細胞退化的低速率和對預(yù)設(shè)的形狀和尺寸的成型性。
通過在生物相容的支架中的成體間充質(zhì)干細胞提供在體內(nèi)或用于體內(nèi)回輸?shù)伢w外(ex vivo)制備具有預(yù)定(或預(yù)設(shè))形狀和尺寸的生物工程化的軟組織的方法和組合物。根據(jù)該方法，提供分散在預(yù)設(shè)三維結(jié)構(gòu)的生物相容支架中的間充質(zhì)干細胞(MSCs)。通過將MSCs與生脂誘導(dǎo)添加物和/或成纖維細胞生長因子bFGF接觸來誘導(dǎo)這些細胞分化為脂肪和成纖維細胞組織形成細胞。將所述接觸時間段維持至足以至少使某些成體間充質(zhì)干細胞分化為具有預(yù)定三維結(jié)構(gòu)的軟組織，所述結(jié)構(gòu)由需要重建或修復(fù)的性質(zhì)決定。構(gòu)成物是通過標(biāo)準(zhǔn)的外科操作植入需要所述構(gòu)成物的受者中的軟組織。在形成的軟組織中存在脂肪細胞和成纖維細胞以及小至無法覺察量的干細胞。
由諸如聚合的聚乙二醇雙丙烯酸酯等水凝膠聚合物來構(gòu)造生物相容的支架。所述生物相容的支架以及因此使用該支架制備的工程化的軟組織具有預(yù)設(shè)的三維結(jié)構(gòu)?？梢栽趯SCs分散至生物相容的支架前體以前或者以后形成水凝膠聚合物，以便使所述聚合物包裹住MSCs。例如通過生物相容的支架前體的光聚合作用來形成所述水凝膠聚合物。
對于脂肪組織工程應(yīng)用的支架來說PEG水凝膠是有利的。PEG是親水的、生物相容的并且降解緩慢，這對工程化的脂肪組織的體積維持來說是有用的。
因為組織形成細胞來自患者自身的骨髓或與其匹配的其他來源，所以可以防止構(gòu)成物的免疫排斥。軟組織與患者自身組織生物學(xué)驅(qū)動的愈合過程整合?？梢允褂矛F(xiàn)代整形外科手術(shù)方法來緩解獨立的單位審批的需求。此外，使用成體干細胞(而非胚胎干細胞)以便最小化倫理組織。
改良標(biāo)準(zhǔn)細胞培養(yǎng)操作以便指導(dǎo)大量組織工程實驗室制造生物工程化的軟組織。
本文所描述的材料和方法表示使血管組織在體內(nèi)向內(nèi)生長入非多孔生物相容的水凝膠中的物理和化學(xué)方法罕見的組合。由PEG水凝膠中內(nèi)皮樣細胞內(nèi)襯的血管樣結(jié)構(gòu)含有紅細胞并且對抗VEGF和WGA抗體呈陽性染色，這表明在浸潤的宿主組織中存在內(nèi)皮細胞。結(jié)合在工程化的大通道中由內(nèi)皮樣細胞內(nèi)襯的腔中所含有的紅細胞形態(tài)學(xué)，在當(dāng)前的研究中，組織向內(nèi)生長可能是血管組織。表明，單獨或以組合使用的大于先前使用的微通道的物理大通道及化學(xué)刺激劑、堿性成纖維細胞生長因子，促進了體內(nèi)PEG水凝膠中血管組織向內(nèi)生長。然而，在大通道和bFGF的效果之間存在重要的不同。與被負(fù)載有bFGF的不含大通道的PEG的宿主血管組織的隨機浸潤相比，血管和顆粒組織向內(nèi)生長入負(fù)載有bFGF的PEG的大通道的腔中，而不浸潤PEG的其它部分。因此，組織工程應(yīng)用所不期望的由PEG水凝膠中bFGF誘導(dǎo)的明顯隨機的宿主組織侵入的能力迫使由工程化的大通道引導(dǎo)的血管組織向內(nèi)生長。該定向的血管組織向內(nèi)生長在需要血管生成的通用組織工程應(yīng)用中是重要的。雖然不含bFGF的大通道的PEG誘導(dǎo)血管組織在通道中向內(nèi)生長，但是浸潤入大通道的、負(fù)載有bFGF的PEG中血管組織體積的量比不含bFGF的大通道的PEG中血管組織體積的量要大的多。
附圖簡要說明圖1是系列的4張照片(A-D)，其顯示了在免疫缺陷小鼠的背部皮下植入4周后的組織工程化的脂肪組織構(gòu)成物以及對照構(gòu)成物的大體外觀(A)在構(gòu)成物裝配期間用于負(fù)載聚合物/細胞混懸液的塑形模型；(B)包被生脂處理的hMSCs的組織工程化脂肪組織構(gòu)成物，所述構(gòu)成物被保持原始模型的形狀和尺寸；(C)包被未處理的hMSCs的采集的對照構(gòu)成物；(D)不含包被細胞的采集的對照構(gòu)成物。注意到所有構(gòu)成物與原始模型之間的尺寸相似性并且注意到組織工程化的構(gòu)成物(B)和對照構(gòu)成物(C和D)之間的對比。
圖2是系列的4張照片(A-D)，其顯示了在單層培養(yǎng)和水凝膠構(gòu)成物中用于體內(nèi)回輸?shù)捏w外(ex vivo)維持的人間充質(zhì)干細胞(hMSCs)所產(chǎn)生的脂肪形成；(A)在生脂培養(yǎng)基中維持4周的hMSCs單層培養(yǎng)物的油紅O陽性染色；(B)與(A)相應(yīng)的對照單層培養(yǎng)物，當(dāng)使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基保持4周時，對油紅O染色其表現(xiàn)出陰性反應(yīng)；(C)在水凝膠構(gòu)成物的有代表性的顯微照片中，由油紅O陽性染色所表明的脂肪沉著體，所述水凝膠構(gòu)成物包被生脂處理的hMSCs并在生脂培養(yǎng)基中由用于體內(nèi)回輸?shù)捏w外保持4周；(D)與(C)相應(yīng)的對照的顯微照片，其對油紅O無反應(yīng)。
圖3是系列的4張照片(A-D)，其通過組織化學(xué)染色和RT-PCR顯示了由維持在體內(nèi)的組織工程化構(gòu)成物中的hMSCs所形成的脂肪；(A)在組織工程化水凝膠構(gòu)成物中油紅O的陽性染色，所述構(gòu)成物包被生脂處理的hMSCs并被移植入免疫缺陷小鼠的背部皮下4周；(B)對照水凝膠構(gòu)成物的有代表性的顯微照片顯示對油紅O染色呈陰性反應(yīng)為證據(jù)的無脂肪沉著，所述水凝膠構(gòu)成物包被未處理的hMSCs并被移植入免疫缺陷小鼠的背部皮下4周；(C)沒有包被細胞的對照水凝膠構(gòu)成物的有代表性的顯微照片顯示了對油紅O的陰性反應(yīng)以及與環(huán)繞構(gòu)成物的纖維囊之間的完整的邊界，并且不存在宿主細胞對所述構(gòu)成物的侵入；(D)RT-PCR分析顯示在免疫缺陷小鼠的背部皮下植入4周后采集的構(gòu)成物中脂肪細胞特異性基因(PPAR-γ2)相對于看家基因(GAPDH)的表達，所述構(gòu)成物包被了生脂處理的hMSCs(+脂肪)或未處理的hMSCs(-脂肪)。
圖4.體內(nèi)植入后PEG水凝膠中和對照組中hMSC衍生的脂肪組織的采集。A無細胞的PEG水凝膠(箭頭之間)。B包被hMSCs的PEG水凝膠(無生脂分化)(箭頭之間)。C包被hMSC衍生的生脂細胞的PEG水凝膠中的工程化的脂肪組織(箭頭之間)，其顯示了對周圍宿主組織的附著性并且維持了原始9mm的直徑(高于A和B的放大率)。
圖5.工程化脂肪組織和對照的脂肪組織的形狀、尺寸和光不透明度(A)用作一般的形狀和尺寸模型的Eppendorf管(直徑為9mm)的塑料帽；(B)采集的不含細胞的PEG水凝膠是相當(dāng)透明的；(C)包被hMSCs(無生脂分化)的PEG水凝膠顯示一定程度的光不透明性；(D)包被hMSC衍生的生脂細胞的PEG水凝膠顯示基本的光不透明性并且保持了預(yù)定的形狀和尺寸。
圖6.體內(nèi)采集的使用hMSCs接種的膠原海綿和對照組的形狀和尺寸，其顯示了原始形狀和尺寸的喪失。(A)被修剪為約4×4×4mm立方體的無菌膠原海綿；(B)采集的不含細胞的使用hMSCs接種的膠原海綿以及體內(nèi)植入4周后hMSC衍生的脂肪細胞(從左側(cè)連續(xù))，其顯示了尺寸的嚴(yán)重減少和形狀的嚴(yán)重改變。
圖7.體內(nèi)植入4周后采集的PEG的和膠原移植物的支架直徑的量變(×100％±S.D.)。hMSCs人間充質(zhì)干細胞?；疑闹狈綀D表示PEG移植物，而空白的直方圖表示膠原移植物。不含細胞的PEG構(gòu)成物(N＝6)、包被hMSCs的PEG水凝膠構(gòu)成物(N＝6)、或包被hMSCs衍生的脂肪細胞(N＝6)維持了將近100％的支架原始直徑。相反地，不含接種細胞的膠原海綿損(N＝4)損失了65.0％±5.0的原始直徑，而由hMSCs接種的膠原海綿(N＝4)和hMSC衍生的脂肪細胞(N＝6)分別損失31.7％±5.8和31.7％±5.4的原始直徑。**P＜0.01。
圖8.體內(nèi)植入4周后工程化脂肪組織和對照脂肪組織的H&E和油紅O染色(A)；hMSCs人間充質(zhì)干細胞；(B)無細胞的PEG水凝膠，其既沒有顯示定居細胞也沒有顯示出脂質(zhì)空泡；(C)包被hMSCs但不進行生脂分化的PEG水凝膠，其顯示了豐富的細胞；(D)hMSC PEG水凝膠的油紅O染色，其顯示沒有脂質(zhì)空泡；(E)包被hMSC衍生的生脂細胞的PEG水凝膠，其顯示了在間隙小島間豐富的定居細胞；(F)包被hMSC衍生的生脂細胞的PEG水凝膠的油紅O染色，其顯示了在與脂肪細胞相似的扁平細胞間豐富的脂質(zhì)空泡。10×放大。
圖9顯示了負(fù)載有堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的PEG水凝膠圓柱體和人皮膚成纖維細胞(hDFs)包被的示意圖。
圖10是負(fù)載有bFGF的PEG水凝膠的體內(nèi)植入和大通道的建立的示意圖。
圖11顯示了包被在PEG水凝膠中的bFGF的體內(nèi)釋放。
圖12顯示了體內(nèi)植入樣品的采集(A)不含細胞、bFGF和通道的PEG水凝膠，其顯示了缺乏肉眼可見的宿主組織侵入；(B)帶有3個大通道(每個直徑為1mm)的PEG水凝膠，其顯示了在建立的大通道的3個腔中宿主組織的向內(nèi)生長；(C)負(fù)載有bFGF但是不含大通道的PEG水凝膠；(D)含有bFGF和大通道的PEG水凝膠，其顯示了通常的紅色并且在建立的大通道的3個腔中3個宿主組織的向內(nèi)生長。
圖13顯示了體內(nèi)采集的使用不同物理和化學(xué)條件處理的PEG水凝膠的高倍放大圖，即帶有或不帶有大通道的bFGF，這些圖顯示了血管樣結(jié)構(gòu)的形成。
圖14顯示了基于抗VEGF抗體在采集的既不含bFGF也不含大通道的PRG水凝膠圓柱體的有代表性的切片上的陰性免疫印跡。
圖15顯示了帶有來自Triticum vulgaris的凝集素(小麥胚凝集素)(WGA)的侵入宿主組織的大片的陽性染色。
公開的詳細說明軟組織是重建和增大外科手術(shù)中需要恢復(fù)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。當(dāng)前用于軟組織重建和/或增強的材料具有如下缺點，例如非最理想的體積保持、供體部位的發(fā)病率以及低生物相容性?？梢酝ㄟ^采集患者的一茶匙容量的成體干細胞、擴增該成體干細胞、并使該成體干細胞分化為生脂細胞并將所述生脂細胞包被入合適的生物相容的聚合物材料中從而工程化生物活性軟組織。最終的結(jié)果是如同針狀大小的最小的供體部位創(chuàng)傷、免疫相容性以及長期的體積維持，所述免疫相容性是因為使用的是患者自身的干細胞，所述長期的體積維持是因為干細胞能夠補充維持工程化脂肪組織的預(yù)定形狀和尺寸的生脂細胞。在整形和重建外科操作中可以實現(xiàn)干細胞衍生的軟組織移植。
由成體間充質(zhì)干細胞(MSCs)在預(yù)定三維構(gòu)型的生物相容支架中制備軟組織的從頭合成(De novo)提供用于軟組織的修復(fù)、增大或重建的構(gòu)成物。成體MSCs能夠分化為所有形成包括軟骨組織、骨組織和脂肪組織在內(nèi)的結(jié)締組織的細胞系?？梢酝ㄟ^最低限度地侵入操作由骨髓或身體的其它結(jié)締組織來源中得到MSCs，該MSCs在培養(yǎng)中是可以高度擴增的并且暴露在已經(jīng)建立的生脂誘導(dǎo)添加物后，易于被誘導(dǎo)分化為脂肪組織形成細胞(Pittenger et al.，Caplan，2003)。此外，出于程序和倫理原因，使用成體MSCs也比使用胚胎干細胞或分化的脂肪細胞更為有利。
成體間充質(zhì)干細胞來自骨髓細胞。至少某些間充質(zhì)干細胞分化為脂肪細胞，以便最初存在兩種細胞類型的混合物，隨著時間的推移，基本上只存在脂肪細胞，而只存在小到不能檢測到量的干細胞。由干細胞在體內(nèi)制造肪組織或由干細胞通過用于體內(nèi)回輸?shù)捏w外處理制備脂肪組織。
將MSCs置于用于脂肪組織工程化的支架材料中。可以在支架制備之后，將MSCs置于該支架中，例如干細胞由宿主機體擴散至制備好的支架中的情況。將MSCs與支架前體混合，然后在MSCs周圍構(gòu)建支架，借此至少將某些細胞俘獲在支架網(wǎng)絡(luò)之中。所述支架是生物相容的，其支撐組織的形成并且具有足以使新形成的組織與周圍宿主組織成功整合的能力。
示例性的宿主動物包括諸如大鼠、小鼠和家兔等實驗室動物，諸如狗或貓等伴侶動物，諸如馬(馬科動物)、牛(牛族動物)、綿羊(綿羊科動物)或山羊(山羊科動物)等家畜，諸如猴子、猿(黑猩猩、猩猩或大猩猩)或人等靈長類的動物。
合適的生物相容支架包括水凝膠聚合物構(gòu)成物或聚合的、輻射聚合單體或其它合適的構(gòu)成物。水凝膠聚合物提供具有模仿機體內(nèi)環(huán)境細胞外基質(zhì)的組織形成細胞。水凝膠聚合物是親水的、吸收或吸附(sorb)大量水或生物液體，而同時維持其不同的三維結(jié)構(gòu)的三維網(wǎng)絡(luò)。諸如藻酸鹽、珊瑚、瓊脂糖、纖維蛋白、膠原、骨、軟骨、羥磷灰石、磷酸鈣、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)或其共聚物(PLGA)、殼聚糖等水凝膠聚合物以及諸如聚乙二醇雙丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯及其混合物等基于聚乙二醇的聚合物(基于標(biāo)記的聚合物)均是合適的。通過聚乙二醇雙丙烯酸酯單體[MW 3400；Shearwater Polymers，Huntsville，AL]的聚合形成支架。聚乙二醇雙丙烯酸酯或聚乙二醇二甲基丙烯酸酯的分子量分別為約1000至約100,000道爾頓和約2000至約5000道爾頓。支架的物理形式例如固體、液體、凝膠、網(wǎng)狀、粉末、海綿狀或糊狀。
基于聚乙二醇的水凝膠聚合物對于組織工程應(yīng)用具有某些優(yōu)點，因為其已被證明的生物相容性及其已經(jīng)表明的支持MSCs生長以及向諸如骨的多細胞系分化的能力。此外，有可能皮下最低限度地侵入操作(注射)給予細胞-聚合物體系以及這些水凝膠具有經(jīng)歷諸如光聚合作用的經(jīng)皮輻射誘發(fā)的聚合作用的能力。在植入宿主動物以后，可以使用對宿主動物無害的X-或γ-輻射的劑量以引發(fā)聚合作用。
生物相容的支架中的來自成體間充質(zhì)干細胞的生物工程化的脂肪組織優(yōu)選具有預(yù)定的三維構(gòu)型即形狀和尺寸。通過聚合(形成)模型中生物相容的支架或通過用于體內(nèi)回輸?shù)捏w外處理(宿主機體之外)的其它形式來得到該構(gòu)型。可以通過宿主機體中的體內(nèi)部位的尺寸和形狀來確定生物相容支架的三維構(gòu)型，其中所述生物相容的支架是在該宿主機體內(nèi)制備的。
制造脂肪組織的生脂構(gòu)成物包括生物相容的支架和來自骨髓的成體間充質(zhì)干細胞。該構(gòu)成物包括分散在所述支架中生脂劑。該生脂劑可以是吡格列酮(proglitazone)、β家族生長因子、前列腺素、環(huán)格列酮、地塞米松或上述的混合物。
組合物包括生物相容的支架和來自人骨髓的成人間充質(zhì)干細胞，其中所述支架由水合的諸如聚乙二醇雙丙烯酸酯的水凝膠聚合物，并且所述組合物還包括生脂劑、營養(yǎng)介質(zhì)、任選的生長因子和至少一種抗生素。示例性生脂劑、營養(yǎng)素和抗生素包括兩性霉素B、環(huán)格列酮、生物素、地塞米松、慶大霉素、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和L-甲狀腺素。
體內(nèi)生產(chǎn)生物工程化的軟組織的方法包括向宿主動物植入包含生物相容支架的組合物，該生物相容支架含有成體間充質(zhì)干細胞和生脂培養(yǎng)基。在含有細胞和諸如聚乙二醇雙丙烯酸酯的單體前體并且還含有兩性霉素B、環(huán)格列酮、生物素、地塞米松、慶大霉素、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和L-甲狀腺素的混合物聚合后，通過俘獲將成體間充質(zhì)干細胞附著于支架中。聚合形成的生物相容支架包括聚合的水合水凝膠聚合物。
其它的步驟包括收集成體間充質(zhì)干細胞、將該細胞與生脂培養(yǎng)基接觸以及將該接觸維持足夠的時間以誘導(dǎo)分化為脂肪細胞、向生物相容支架上負(fù)載該脂肪細胞以及將負(fù)載有脂肪細胞的所述支架植入宿主動物中。
通過用于體內(nèi)回輸?shù)捏w外處理產(chǎn)生生物工程化的軟組織的方法包括向生物相容的支架中附著成體間充質(zhì)干細胞，其中通過在該支架中俘獲所述細胞來影響該支架、水凝膠基質(zhì)，該支架還含有生脂劑、營養(yǎng)培養(yǎng)基和至少一種抗生素。所述支架包括聚合的水合聚乙二醇雙丙烯酸酯基質(zhì)，該聚乙二醇雙丙烯酸酯含有所述生脂劑、營養(yǎng)培養(yǎng)基和至少一種抗生素，所述抗生素包括兩性霉素B、環(huán)格列酮、生物素、地塞米松、慶大霉素、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和L-甲狀腺素。
將商業(yè)上可以得到的來自匿名成人供體的人間充質(zhì)干細胞分化為生脂細胞。將hMSC衍生的脂肪細胞包被在PEG水凝膠中并且將其植入免疫缺陷小鼠背部通過外科手術(shù)所形成的皮下口袋中。體內(nèi)植入4周后，收集干細胞衍生的脂肪組織植入物。圖4顯示PEG水凝膠支架的修補過程。如圖1D所示的那樣，包被hMSC衍生的脂肪細胞的PEG水凝膠顏色較深并且良好地附在該宿主皮下組織上(圖5)。圖6顯示了體內(nèi)植入后PEG脂肪組織植入物的形狀、尺寸和不同的光不透明性。包被hMSC衍生的脂肪細胞的PEG水凝膠構(gòu)成物不但維持了原始的形狀和尺寸，還顯示了相當(dāng)程度的光不透明性(圖6)，這表明在hMSC衍生的生脂PEG構(gòu)成物中形成了大量的生物結(jié)構(gòu)。與PEG水凝膠構(gòu)成物相反，同樣是體內(nèi)植入4周后膠原海綿喪失了其原始的形狀和尺寸。如圖7所示，無論是無細胞的、使用hMSCs接種的或hMSC衍生的脂肪細胞，全部的膠原海綿均喪失了其原始形狀并且大量萎縮(圖7C)。hMSC衍生的生脂PEG和膠原構(gòu)成物的脂質(zhì)積蓄的組織學(xué)標(biāo)記，即油紅O染色表現(xiàn)出陽性染色。然而，H&E染色沒有顯示宿主細胞侵入PEG構(gòu)成物，這表明所有產(chǎn)生的脂肪組織均來自植入的人MSC衍生的生脂細胞。相比之下，可能存在宿主小鼠細胞侵入膠原海綿，導(dǎo)致宿主細胞有可能在膠原構(gòu)成物中產(chǎn)生脂肪形成(圖8)。
人間充質(zhì)干細胞不但在Petri培養(yǎng)皿的單層培養(yǎng)中，而且在3D水凝膠和動物模型體內(nèi)易于分化為軟組織的成分。易于從需要外科修復(fù)的軟組織缺損的患者中分離人MSCs，以便可以得到自體細胞療法以防止免疫排異的問題。PEG水凝膠中的hMSC衍生的軟組織植入物能夠在皮下植入4周后，維持其幾乎100％的預(yù)定的形狀和尺寸。
對于包括脂肪組織工程化在內(nèi)的工程化組織，血管生成仍然是個挑戰(zhàn)。雖然進行了獨立的嘗試，但是需要在工程化的軟組織植入物中誘導(dǎo)控制的血管生成。來自前脂肪細胞系的脂肪墊中的血管生成是來自宿主的，而非來自前脂肪細胞，這表明需要刺激宿主血管生成。雖然脂肪組織是軟組織的主要成分，但是軟組織是由脂肪組織和其它成分組成的。例如，在工程化的軟組織植入物中需要宿主纖維組織。誘導(dǎo)骨組織工程化的血管生成的一些方法可以用于工程化脂肪組織中的血管生成。
增大是包括軟組織工程化在內(nèi)的普通的組織工程的挑戰(zhàn)。本公開的工程化的軟組織植入物的直徑高達9mm并且對某些面部軟組織缺陷以及其它小的軟組織缺陷來說是充分的。然而，乳房切除術(shù)和大面積創(chuàng)傷后的軟組織缺陷要求多倍的增大。諸如大量運送、營養(yǎng)物的擴散、血管生成以及神經(jīng)分布的問題是工程化軟組織的增大的所面對的日益增加的挑戰(zhàn)。
實施例實施例1脂肪組織工程的用于體內(nèi)回輸?shù)捏w外培養(yǎng)和體內(nèi)植入物A.人MSCs的分離和培養(yǎng)從來自22歲健康男性供體髂嵴的全骨髓抽吸物中分離人MSCs(hMSCs)(AllCells，LLC.，Berkely，CA)。簡而言之，通過向全骨髓樣品中加入RosetteSep間充質(zhì)富集混合物(StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，Canada)來富集細胞。然后使用兩倍體積的含有2％胎牛血清(FBS)(Atlanta Biologicals，Inc.，Norcross，GA)和1mM乙二胺四乙酸(EDTA)(Sigma，St.Louis，MO)的磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋細胞。
在Ficoll-Paque(Stemcell Technologies，Inc.，Vancouver，Canada)墊層頂部加上稀釋的樣品并以300xg離心分離25分鐘。從ficoll-Paque等離子界面移除富集的細胞，使用含有2％FBS和1mM EDTA的PBS洗滌細胞，并在完全培養(yǎng)基中再次混懸細胞MesenCult的hMSCs基礎(chǔ)培養(yǎng)基(StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，Canada)，10％人間充質(zhì)干細胞刺激添加物(StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，Canada)以及1％抗生素-抗真菌素(Gibco，Carlsbad，CA)。對細胞計數(shù)，并將其接種于100mm培養(yǎng)皿中10ml的完全培養(yǎng)基中，并在37℃下95％空氣/5％CO2中維持。24小時后，丟棄非粘附細胞；使用PBS洗滌粘附細胞兩次并且在每3-4天更換使用新鮮培養(yǎng)基的條件下維持10-14天。當(dāng)形成大的集落(通常10-14天)時并且在融合以前，使用0.25％胰蛋白酶和1mM EDTA在37℃下對原代hMSCs進行胰蛋白酶化5分鐘，計數(shù)，再次接種于100-mm的培養(yǎng)皿中。僅使用第一代的hMSCs。
B.使用生脂添加物對hMSCs進行處理對于包被研究，在基礎(chǔ)或生脂培養(yǎng)基中獨立地培養(yǎng)1周第一代hMSCs?；A(chǔ)培養(yǎng)基由MesenCult的人間充質(zhì)干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，Canada)、10％人間充質(zhì)干細胞刺激添加物(StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，Canada)以及1％抗生素-抗真菌素(Gibco，Carlsbad，CA)組成。生脂培養(yǎng)基由MesenCult的人間充質(zhì)干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，Canada)、10％人生脂刺激添加物(StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，Canada)以及1％抗生素-抗真菌素(Gibco，Carlsbad，CA)組成。在37℃下95％空氣/5％CO2中維持培養(yǎng)并且每3-4天更換培養(yǎng)基。
為了表明單層培養(yǎng)中的生脂過程，在基礎(chǔ)或生脂培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)4周第一代hMSCs并且使用油紅O染色(Sigma，St.Louis，MO)。將培養(yǎng)物進行表明在培養(yǎng)物中脂肪的沉著的陽性油紅O染色對比。
C.水凝膠/光引發(fā)劑溶液的制備和構(gòu)成物的制造為了制備水凝膠溶液，將聚(乙二醇)雙丙烯酸酯(PEGDA)(MW3400；Shearwater Polymers，Huntsville，AL)溶于含有100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(Gibco，Carlsbad，CA)的無菌PBS中以形成10％w/v的終溶液。向PEGDA溶液中加入光引發(fā)劑2-羥基-1-[4-(羥基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮(Ciba，Tarrytown，NY)以使最終的光引發(fā)劑濃度為0.5％w/v。
在基礎(chǔ)或生脂培養(yǎng)基中維持1周，在73℃下使用0.25％胰蛋白酶和1mM EDTA對第一代hMSCs進行胰蛋白酶化5分鐘，計數(shù)，分別再次混懸于密度為5/106細胞/ml的PEGDA聚合物/光引發(fā)劑溶液中。為了制備每一構(gòu)成物，將150μl等份的細胞/聚合物/光引發(fā)劑混懸液負(fù)載入直徑為9mm的塑形嵌入物中(1.5ml微量離心管帽)(FisherScientific，Hampton，NH)。負(fù)載后，將攜帶細胞/聚合物/光引發(fā)劑混懸液的塑形嵌入物暴露在長波365nm強度約為4mW/cm2的紫外線燈(Glowmark，Upper Saddle River，NJ)下5分鐘。然后將光聚合的構(gòu)成物從塑形嵌入物中取出，使用無菌PBS洗滌兩次，并轉(zhuǎn)移至含有相應(yīng)基礎(chǔ)或生脂培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板中(Fisher Scientific，Hampton，NH)。
D.構(gòu)成物的用于體內(nèi)回輸?shù)捏w外培養(yǎng)和體內(nèi)植入對于用于體內(nèi)回輸?shù)捏w外培養(yǎng)研究，將包被hMSC衍生的生脂細胞的水凝膠構(gòu)成物(N＝12)維持在生脂培養(yǎng)基中(本發(fā)明所描述的)，而將包被未處理的hMSCs水凝膠構(gòu)成物(N＝12)維持在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(本發(fā)明所描述的)。在37℃下95％空氣/5％CO2中維持全部培養(yǎng)物4周，每3-4天更換使用新鮮培養(yǎng)基。
對于體內(nèi)研究，從模型中取出包被生脂處理的hMSCs的聚合水凝膠構(gòu)成物(N＝8)、包被生脂處理的hMSCs的構(gòu)成物(N＝4)和不含細胞的對照構(gòu)成物(N＝4)，并使用無菌PBS洗滌兩次。將全部構(gòu)成物植入重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠的背部的皮下口袋中(4個構(gòu)成物/小鼠)(Harlan，Indianapolis，IN)，所述皮下口袋是通過腹膜內(nèi)注射100mg/kg氯胺酮和5mg/kg甲苯噻嗪的常規(guī)麻醉并使用鈍性解剖制成的。
E.細胞生存力分析根據(jù)廠商所建議的實驗方案，使用存活的/死亡的生存力/細胞毒性試劑盒(Molecular Probes，L-3224，Eugene，OR)評價用于體內(nèi)回輸?shù)捏w外維持4周的構(gòu)成物中的細胞生存力。鈣黃綠素(熒光染料)通過細胞膜擴散并與細胞內(nèi)酯酶反應(yīng)以產(chǎn)生綠色熒光，而乙啡啶同型二聚體僅通過損壞的細胞膜擴散并與核酸結(jié)合以產(chǎn)生紅色熒光。細胞標(biāo)記以后，在配置有長通二元發(fā)射熒光過濾器(Chroma，Rockingham，VT)的倒置光學(xué)顯微鏡(Leica Microsystems，Wetzler，Germany)下觀察樣品。
F.組織學(xué)在4周的用于體內(nèi)回輸?shù)捏w外維持以及SCID小鼠的背部的體內(nèi)培養(yǎng)后，將構(gòu)成物包埋在最適切割溫度(OCT)的組織冷凍混合液中(IMEB，Chicago，IL)并且使用標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)技術(shù)將其切割為10μm的切片。使用油紅O(Sigma，St.Louis，MO)對切片染色，加上甘油明膠(Sigma，St.Louis，MO)，并在光學(xué)顯微鏡(Leica Microsystems，Weltzer，Germany)下觀察。
G.RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用RNeasy Purification Reagent(Qiagen；Valencia，CA)從體內(nèi)收集的構(gòu)成物中提取總RNA。在來自RNeasy試劑盒的含有200μ的RLT緩沖液的1.5ml微量離心管中將所述構(gòu)成物勻漿(pelled pestle mixer；Kimble/Kontes，Vineland，NJ)。然后，加入400μl的緩沖液，然后使用QUIshredder(Qiagen，Valencia，CA)柱進一步勻漿。使用六核苷酸和superscript擴增系統(tǒng)(Gibco，Carlsbad，CA)進行逆轉(zhuǎn)錄(RT)。使用ExTaq DNA Polymerase Premix(Takara Bio，Otsu，Shiga，Japan)在58℃的退火溫度下，在50μl的體系中將1μl份的所得cDNA進行30個循環(huán)的擴增。使用PPAR-γ2的特異性人引物進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，有義鏈5′-GCTGTTATGGGTGAAACTCTG-3′(SEQ ID NO1)，反義鏈5′-ATAAGGTGGAGATGCAGGCTC-3′(SEQ ID NO.2)，以及看家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，有義鏈5′-CCCATGTTCGTCA-TGGGTGT-3′(SEQ ID NO3)，反義鏈5′-TGGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3′(SEQ ID NO.4)。PCR進行30-35個循環(huán)，每一循環(huán)由在95℃下變性30秒，在55-60℃下退火30秒并在72℃下延伸1分鐘，以及在完成最后一個循環(huán)后，保持另外的10分鐘組成。為了排除基因組DNA的污染的可能性，還將PCR應(yīng)用于沒有RT的反應(yīng)。在1％瓊脂糖凝膠中對擴增的互補DNA進行電泳，染色，并在紫外線下拍照。
H.組織工程化的脂肪組織構(gòu)成物的大體檢查體內(nèi)植入和用于體內(nèi)回輸?shù)捏w外維持4周后，構(gòu)成物(包被hMSC衍生的生脂細胞)和對照構(gòu)成物(包被未處理的hMSCs或不含細胞)保持了其原始塑形模型(圖1A)的物理形狀和尺寸。物理加工后，構(gòu)成物是堅硬的、有彈性的并且不屈服于某一限定程度。與采集自體內(nèi)移植的含有使用基本培養(yǎng)基處理的hMSCs的透明構(gòu)成物(圖1C)和采集的不含包被細胞的對照構(gòu)成物(圖1D)相反，組織工程化的生脂構(gòu)成物(圖1B)呈淡黃色并且不透光。
I.由用于體內(nèi)回輸?shù)捏w外維持的單層培養(yǎng)物中和水凝膠構(gòu)成物中的hMSCs產(chǎn)生的脂肪形成使用生脂培養(yǎng)基維持4周的人MSC單層培養(yǎng)通過呈現(xiàn)紅色表示對油紅O染色顯示陽性反應(yīng)(圖2A)，與之相比的是，在基本培養(yǎng)基(并且不存在生脂培養(yǎng)基)的單層中培養(yǎng)的hMSCs的油紅O染色沒有顯示反應(yīng)。油紅O是深紅色的脂肪染色劑(脂肪可溶性染料)，主要用于顯示冰凍切片中的甘油三酯(Lillie，Conn′s Biological Stains，9th Ed.Baltimore Williams&Wilkins co.，1977)。類似地，在基于PEG的水凝膠中用于體內(nèi)回輸?shù)捏w外維持4周后，包被生脂處理的hMSCs的水凝膠構(gòu)成物使用油紅O顯示陽性染色，與之相比的是，在基于PEG的水凝膠中，包被的非生脂處理的hMSCs對油紅O染色沒有顯示反應(yīng)(圖2C和2D)。
J.體內(nèi)組織工程化的生脂構(gòu)成物組織學(xué)和RT-PCR分析顯示了在SCID小鼠背部中體內(nèi)培養(yǎng)4周后，包被生脂處理的hMSCs的水凝膠構(gòu)成物中脂肪組織的從頭生成(圖3)。相對于包被未處理的hMSCs的對照構(gòu)成物(圖3B)和不含包被細胞的對照構(gòu)成物(圖3C)生脂構(gòu)成物對油紅O染色顯示陽性(圖3A)。此外，不含包被細胞的對照構(gòu)成物沒有顯示宿主細胞侵入的信號并且顯示了水凝膠構(gòu)成物的完整邊界(圖3C)。在包被生脂處理的hMSCs的脂肪組織構(gòu)成物中，脂肪細胞特異性PPAR-γ2基因呈陽性表達(圖3D)。在一定溫度下和光量控制的房間內(nèi)(23-25℃，14小時光照/天)飼養(yǎng)所述小鼠，并對其每天喂食標(biāo)準(zhǔn)量的食物和水。
實施例2在非多孔生物材料中工程化軟組織向內(nèi)生長和血管生成A.PEG水凝膠的制備將聚(乙二醇)雙丙烯酸酯(1g)(Sheanvater Huntsville，AL，USA)溶于6.6mL含有133單位/mL青霉素和133mg/mL鏈霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的PBS中以達到最終濃度為6.6％w/v。
將紫外線光引發(fā)劑2-羥基-1-[4-(羥基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮(Irgacure)(Ciba，Tarrytown，NY，USA)溶于100％乙醇中達到50mg/mL的濃度。通過向6.6mL PEG溶液中加入100μL光引發(fā)劑/乙醇溶液制備最終的PEG單位儲液。
B.bFGF體內(nèi)釋放譜根據(jù)制造者的指導(dǎo)方針，使用含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS重新配制濃度為25μg/mL的堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)人重組體(Sigma，St.Louis，MI，USA)。使用含有BSA的PBS進一步將該溶液稀釋為0.4 μg/mL的終濃度。向含有200μL PEG儲液的無菌小管中加入總量為100μL的0.4μg/mL bFGF溶液。使用微量移液器將該混合物混合5次以確?；靹颍缓蠓譃?5μL等份，并轉(zhuǎn)移至Eppendorf帽的圓柱狀模型中。使用365nm UV對這些圓柱狀模型進行5分鐘的光聚合(Glo-Mark，Upper Saddle River，NJ，USA)。將單獨的小管中的負(fù)載有bFGF的PEG水凝膠圓柱體置于37℃的水浴中1、3、7、14、21和28天(每一時間點N＝4)以測定bFGF的釋放動力學(xué)，每一所述試管中有1mL含有0.1％BSA的PBS。在每一時間點，使用人bFGF免疫分析來分析每一檢測小管的上清液(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)(Alhadlaq et al.，2004；Moioli et al.，2005)。
C.從PEG水凝膠中釋放的bFGF的生物活性使用本發(fā)明所述的方法重新配制堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)人重組體(Sigma，St.Louis，MI，USA)。向含有400μL PEG儲液的無菌檢測小管中加入總量為200μL 4μg/mL bFGF溶液。使用微量移液器將該混合物混合5次以確?；靹颍缓蠓譃?5μL等份，并轉(zhuǎn)移至Eppendorf帽的圓柱狀模型中。使用365 nm UV對這些圓柱狀模型進行5分鐘的光聚合(Glo-Mark，Upper Saddle River，NJ，USA)。使用200mL含有0.1％BSA的PBS來代替bFGF溶液以制備不含bFGF的PEG水凝膠。
將人皮膚成纖維細胞(hDFs)(Cambrex，Walkersville，MD，USA)接種于密度為20,000細胞/孔的4mL含有10％胎牛血清和1％青霉素和鏈霉素的改良的Eagle培養(yǎng)基中(完全DMEM)。在下列4個條件下孵育粘附細胞(每組N＝6)1)含有0.1％BSA的PBS的空白液體(圖9A)，2)負(fù)載有含有0.1％BSA的PBS的空白PEG水凝膠(圖9A)，3)含有6.25ng/mL bFGF而不含PEG水凝膠的bFGF溶液(圖9B)，4)含有0.1μgbFGF的負(fù)載有bFGF的PEG水凝膠(圖9B)。對于組4，在37℃下5％CO2中使用transwell嵌入物(Becton Dickinson Labware，F(xiàn)ranklinLakes，NJ)在DMEM中孵育hDFs 1周，所述transwell嵌入物被置于每一細胞培養(yǎng)孔中(0.4μm的孔徑)(圖9C)。在DMEM培養(yǎng)基中將transwell嵌入物置于比hDFs單層培養(yǎng)物高0.9mm的位置處，因此將全部細胞暴露于釋放的bFGF而不直接與負(fù)載有bFGF的PEG圓柱體接觸(圖9C)。在每一上述4種條件下孵育1周后，通過使用500μL 0.1％TritonX溶液(Sigma，St.Louis，MI，USA)進行處理來收集bFGFs，使用無菌一次性的細胞起子(Fisherbrand，Pittsburgh，PA)來刮除細胞，收集在組織培養(yǎng)管中，使用聲波降解法(Sonica Dismembrator Mode 100，F(xiàn)isher，piitsburgh，PA，USA)在冰上進行裂解并均漿。然后將hDF裂解物收集在離心管中并在-80℃儲藏。根據(jù)現(xiàn)有方法(Fluorescent DNAQuantitation kit，Bio-Rad，Hercules，CA)(Alhadlaq et al.，2004；Moioli etal.，2005)使用與雙鏈DNA結(jié)合的Hoechst 33258的熒光定量分析測定DNA的含量。
D.負(fù)載有bFGF的PEG水凝膠的體內(nèi)植入向200μL的PEG溶液中加入總量為100μL的1μg/μL bFGF溶液，然后溫和混合，再使用微量移液器向Eppendorf帽的圓柱體模型中加入75μL等份。使用365nm的UV對所得的PEG圓柱體進行5分鐘的光聚合(Glo-Mark，Upper Saddle River，NJ，USA)。通過使用無菌毛細管引入3個刺穿在每一PEG水凝膠圓柱體中建立總計為3個的大通道(圖10B和D)。制備以下的PEG水凝膠用于體內(nèi)植入(每組N＝4)1)空白(不含bFGF也沒有大通道)(圖10A)，2)負(fù)載有bFGF但沒有大通道(圖10B)，3)具有大通道但不含bFGF(圖10C)，4)負(fù)載有bFGF并且具有大通道(圖10D)。
通過腹腔內(nèi)注射氯胺酮(100mg/kg體重)和甲苯噻嗪(4mg/kg體重)將雄性重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠(系C.B17；4-5周齡)麻醉(Alhadlaq et al.，2004)。將小鼠背部的毛剪掉并將小鼠置于俯臥位，然后使用10％聚乙烯吡咯酮碘和70％乙醇進行消毒。沿著背部的上中矢線做1cm長的線性切口，然后通過鈍性解剖形成皮下小袋。每一SCID小鼠接受4個PEG水凝膠植入物空白PEG水凝膠、負(fù)載有bFGF但不含大通道的PEG水凝膠、不含bFGF但具有大通道的PEG以及含有bFGF和大通道的PEG。使用可吸收的純(plain)腸4-0線封閉切口。將全部PEG水凝膠圓柱體植入體內(nèi)4周。公共動物管理委員會同意本動物實驗方案。
E.體內(nèi)水凝膠樣品的收集，組織學(xué)、免疫組織化學(xué)和數(shù)據(jù)分析在SCID小鼠背部皮下植入4周后，收集PEG水凝膠圓柱體。使用CO2窒息后，在SCID小鼠背部無菌地形成切口。在小心地去除周圍的纖維囊后，從宿主中分離PEG水凝膠圓柱體，使用PBS洗滌所述PEG水凝膠圓柱體，將所述PEG水凝膠圓柱體固定于10％福爾馬林中至少24小時。然后將PEG樣品包埋在石蠟中并制作5μm厚的橫斷面切片(大通道的橫向，參看圖10B和10D)。使用蘇木精和伊紅對石蠟切片染色。
對鄰近H&E染色切片的連續(xù)切片進行脫石蠟，在PBS中洗滌，并在室溫下使用牛睪丸透明質(zhì)酸酶(1600U/ml)的含150mM氯化鈉的乙酸鈉緩沖液，pH 5.5，消化30分鐘。按照以前的方法進行免疫組織化學(xué)操作(Mao et al.，1998；Alhadlaq and Mao，2005)。簡而言之，室溫下使用5％牛血清白蛋白(BSA)處理切片20分鐘以阻斷非特異性反應(yīng)。使用下列抗體抗血管內(nèi)皮生長因子(抗VEGF)(ABcam，Cambridge，MA USA)和含有和不含有抑制劑乙酰基甲氧芐二胺(Sigma，St.Louis，MI，USA)的生物素標(biāo)記的來自Triticum vulgaris的凝集素(小麥胚凝集素)(WGA)。WGA與富含D-GlcNAc和NeuAc的血管內(nèi)皮細胞的碳水化合物族結(jié)合(Jinga et al.，2000；Izumi et al.，2003)。在潮濕箱中使用初級抗體孵育過夜后，使用PBS洗滌切片并使用IgG抗小鼠二抗(1∶500；Antibodies，Davis，CA)孵育30分鐘。然后在潮濕箱中使用抗生蛋白鏈菌素-HRP軛合物孵育切片30分鐘。在PBS中洗滌后，使用二抗重復(fù)雙重連接操作。使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液對載玻片顯影并使用Mayer蘇木精復(fù)染3至5分鐘。在梯度乙醇中將復(fù)染的載波片脫水并在二甲苯中清潔。對陰性對照進行除了省略初級抗體以外的相同的操作。
通過手工描繪4倍放大的H&E染色切片上含有或不含有負(fù)載的bFGF的大通道PEG水凝膠中浸潤宿主組織的量，對工程化大通道中組織向內(nèi)生長的量進行定量化。使用Student t檢驗和ANOVA方差比較由計算機化的圖像分析產(chǎn)生的自動化面積值以確定有bFGF負(fù)載的大通道PEG水凝膠和無bFGF負(fù)載的大通道PEG水凝膠之間的組織向內(nèi)生長的量是否存在顯著差異。
F.體外bFGF釋放譜圖11A顯示了包被在PEG水凝膠中的bFGF的釋放譜。包被在PEG中的bFGF的當(dāng)前釋放動力學(xué)顯示，在第一個24小時中爆發(fā)釋放(約5.8％)，然后持續(xù)釋放直至測試的28天(圖11A)。到28天時從PEG水凝膠中總共釋放了15.3％的包被bFGF。
G.依賴PEG釋放的bFGF生物活性從PEG釋放包被的bFGF顯示出對單層培養(yǎng)中人皮膚成纖維細胞的顯著的作用。使用bFGF溶液處理的hDFs的DNA含量為69.8±5.6ng(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；N＝6；圖11B中左側(cè)實心直方圖)，明顯高于未暴露于bFGF的hDFs的DNA含量，后者的值為34.5±2.7ng(N＝6；圖11B中的‘空白的’或左側(cè)空白直方圖)。類似地，從PEG水凝膠釋放的使用bFGF處理的hDFs的DNA含量為52.6±3.7(N＝6；圖11B中右側(cè)實心直方圖)，明顯高于暴露于不含bFGF的PEG水凝膠的hDFs的DNA含量，后者的值為27.5±1.7 ng(N＝6；圖11B中的‘空白的’或右側(cè)空白直方圖)。有趣的是，在含有bFGF溶液的DMEM中培養(yǎng)的hDFs的DNA含量明顯高于在含有由PEG水凝膠釋放的bFGF的DMEM中培養(yǎng)的hDFs的DNA含量(P＝0.43)(圖11B中的兩個實心直方圖)。本文將討論由bFGF溶液和由PEG水凝膠釋放的bFGF所誘導(dǎo)的hDFs的DNA含量的差異。
H.體內(nèi)收集的含有大通道和/或bFGF的PEG水凝膠關(guān)于SCID小鼠背部的4周體內(nèi)植入，收集的既不含有大通道也不含有bFGF的PEG水凝膠圓柱體的H&E染色切片沒有顯示宿主組織的向內(nèi)生長(圖12A)。然而，不含bFGF的大通道PEG水凝膠顯示了宿主組織僅向大通道腔中的向內(nèi)生長，而沒有顯示向PEG其余部分的向內(nèi)生長(圖12B)。相反地，負(fù)載有bFGF而不含大通道的PEG水凝膠顯示了PEG水凝膠獨立區(qū)域中的宿主組織向內(nèi)生長的非常隨機的區(qū)域(圖12C)。最有趣的是，負(fù)載有bFGF并具有大通道的PEG水凝膠顯示宿主組織向大通道腔中的向內(nèi)生長，但是并不顯示向PEG其余部分的向內(nèi)生長(圖12D)。具有大通道并負(fù)載有bFGF的PEG水凝膠圓柱體顯示了比具有大通道但不含bFGF的PEG水凝膠圓柱體更加顯著的宿主組織向內(nèi)生長，前者的值為0.47±0.18mm2，后者的值為0.13±0.05mm2(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；P＜0.01；每組N＝4)，這表明與具有大通道但不含bFGF的PEG水凝膠相比，有更多的宿主組織向具有大通道和bFGF的PEG水凝膠中生長。
高倍放大使用不同物理和化學(xué)條件，即bFGF以及具有大通道或不具有大通道，處理的體內(nèi)收集的PEG水凝膠顯示形成了血管樣的結(jié)構(gòu)(圖13)。體內(nèi)采集的具有大通道但不含bFGF的PEG水凝膠在20倍的放大下顯示了廣泛分布的血管樣結(jié)構(gòu)(圖13A)。在60倍的放大下，內(nèi)皮細胞樣細胞明顯地內(nèi)襯于小血管樣結(jié)構(gòu)并且所述小血管樣結(jié)構(gòu)含有幾乎代表紅細胞的伊紅陽性細胞。相反地，負(fù)載有bFGF但不具有大通道的PEG水凝膠顯示了明顯隨機的廣泛的細胞浸潤，而PEG水凝膠的區(qū)域仍然存在(圖13C中的H)。圖13C中的多重泡沫樣結(jié)構(gòu)可能代表在被入侵的宿主細胞和組織中正經(jīng)歷降解的PEG水凝膠(參看圖13C中使用H標(biāo)記的大片PEG水凝膠)。在60倍放大下，具有細胞結(jié)構(gòu)的厚的膜樣結(jié)構(gòu)帶將PEG水凝膠與被入侵的宿主組織分開(圖13D)。特征性的是，具有大通道并負(fù)載有bFGF的PEG水凝膠顯示在如圖13E中箭頭所標(biāo)記明顯的血管樣結(jié)構(gòu)中強烈的宿主細胞侵入的例子。在60倍的放大下，標(biāo)記有箭頭的血管樣結(jié)構(gòu)顯示了由內(nèi)皮樣細胞形成的界限清楚的內(nèi)襯，并且所述血管樣結(jié)構(gòu)具有環(huán)形形狀，與紅細胞非常相似的無核細胞(圖13F)。
抗VEGF抗體在采集的既不含bFGF又不具有大通道的PEG水凝膠的有代表性的切片上顯示陰性免疫印跡(圖14A)。然而，具有大通道但是不含有bFGF的PEG水凝膠僅在大通道中顯示某些模糊的反應(yīng)，而在PEG的其余部分沒有反應(yīng)(圖14B)。相反地，負(fù)載有bFGF而不含有大通道的PEG水凝膠顯示出廣泛的抗VEGF免疫印跡，雖然還存在具有不存在組織向內(nèi)生長的明顯的水凝膠支架區(qū)域(圖14C)。具有大通道并且負(fù)載有bFGF的PEG水凝膠在大通道中而非PEG的其余部分顯示陽性的抗VEGF染色(圖14D)。
使用來自Triticurn vulgaris(小麥胚凝集素)(WGA)的凝集素對侵入宿主組織的大部分染色呈陽性(圖15)，所述凝集素是標(biāo)記血管內(nèi)皮細胞的抗體(Jinga et al.，2000；Izumi et al.，2003)。使用WGA抑制劑乙?；籽跗S二胺的染色證明了使用WGA的陽性染色。圖15A中的陽性WGA染色條帶代表由宿主組織形成的植入的不含有大通道也不含有bFGF的PEG水凝膠圓柱體的膜包圍。不僅在具有大通道但不含有bFGF的PEG水凝膠圓柱體中(圖15B)，而且在具有大通道并含有bFGF的PEG水凝膠圓柱體中(圖15D)均出現(xiàn)很深的WGA染色，這表明在被侵入的宿主血管組織和粒狀組織中存在內(nèi)皮細胞。相反地，負(fù)載有bFGF但不具有大通道的有代表性的PEG水凝膠圓柱體的WGA染色呈現(xiàn)較淺的顏色(圖15C)。
引用的文獻Alcantar，NA.，Aydil，ES.，Israelachvili，JN(2000)J Biomed MaterRes 51(3)343-351.
Alhadlaq A，Mao JJ(2003)J Dent Res 82951-956.
Alhadlaq A，Mao JJ(2004)Stem Cells and Development 13436-448.
Alhadlaq A，Tang M，Mao JJ(2005)Tissue Engineering 11556-566.
Alster et al.，Plast.Reconstr.Surg.(2000)，1052515-2525Atala A(1999)Urol Clin North Am 26157-168.
Atala，(1999)；Walgenbach et al.，(2001)，Anat.Rec.263372-378；Billings E，May，J(1989)Plast Reconstr Surg.83368-381.
Brey and Patrick，Jr.，(2000)IEEE Eng.Med.Biol.Mag.19122；Brey EM，Patrick，CW Jr(2000)IEEE Eng Med Biol Mag 5122-125.
Bryant，SJ，Anseth，KS(2003)J Biomed Mater Res 6470-79.
Burdick and Anseth，(2002)Biomaterials 2343 15；Butler et al.，(1998)Plast.Reconstr.Surg.102161；Caplan，(2003)Novartis Found.Symp.24917Caplan，A1(1991)J Orthop Res 9641.
Coleman SR(1995)Aesth Plast Surg 19421-429.
Coleman，(1995)Aesth.Plast.Surg.19421；Coppit GL，Lin DT，Bwkey BB(2004)Curr Opin Otolaryngol HeadNeck Surg 12281-287.
Davis RE，Guida RA，Cook TA(1995)Arch Otolavyngol Head NeckSurg12195-100.
Duranti et al.，(1998)Dermatol.Surg 241317；Elisseeff et al.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.963104；Eppley，(1999)Plast.Reconstr.Surg.1041761；Fischbach C，et al.(2004a)Exp Cell Res 30054-64.
Friedenstein，AJ，Petrakova，KV(1966)J Embry Exp Morp 16；381-390.
Fu et al.，2002 Biomaterials 234425；Garfein ES，Orgill DP，Pribaz JJ(2003)Clin Plast Surg 4485-98.
Garfein et al.，(2003)Clin.Plast.Surg.30485).
Gath et al.，(2002)Plast.Reconstr.Surg.109889.
Griffith LG，Naughton G(2002)Science 2951009-1014.
Halberstadt et al.，(2002)Tissue Eng.8(3)309-319.
Halberstadt，C，et al.(2002)Tissue Eng.8309-19.
Hart，(2003)Plast.Surg.Nurs.2355).
Hoffman，(2002)Adv.Drug Deliv.Rev.543Kaban LB，Padwa BL，Mulliken JB(1998)J Oral Maxillofac Surg56628-638.
Katz et al.，1999 Clin Plast.Surg.26587；Kim et al，(2003)Osteoarthritis Cartilage 11653；Kimura Y，Ozeki M，Inamoto T，Tabata Y(2003)Biomaterials 142513-21.
Kononas，TC，Bucky，LP，Hurley，C，Amy，JWJ(1993)PlastRecorzstr Surg 91763-768.
Kral et al，(1999)Plas.Reconstr.Surg 104(6)1732-1738；Langer RS，Vacanti JP(1 999)Sci Am28086-89.
Lee and Mooney，(2001)Chem.Rev.10 11869Lee et al.，in Lanza，et al.(Eds.)，Principles of Tissue Engineering，2ndEd.San DiegoAcademic Press，2000409-423；Lee KY，Halberstadt CR，Holder WD，Mooney DJ(2000)In R.P.Lanza，R.Langer，and J.Vacanti(Eds.)，Principles of Tissue Engineering，2nd Ed.San DiegoAcademic Press，2000.Pp.409-423.
Lorenz et al.，2000 Plast.Reconstr.Surg.1052467；Mao JJ(2005)Biol Cell 97289-301.
Marler et al.，2000，Plast.Reconstr.Surg.1052049-2058；Marler et al.，2000；Patrick，Jr.，2000，Surg.Oncol.19302-311；Marler JJ，et al.(2000)Plast Reconstr Surg 1052049-2057.
Martens，P，Bryant，SJ.，Anseth，KS(2003)Biomacromolecules2283-292.
Monahan R，et al.(2001)J Am Dent Assoc 1321402-1408.
Neels JG，Thinnes T，Loskutoff DJ(2004)FASEB J 18983-985.
Nguyen and West，(2002)Biomaterials 234307Oxley et al.，(1993)Biomaterials 141064；Patel PN，Smith CK，Patrick CW Jr(2005)J Biomed Mater Res A73A313-319.
Patrick CW Jr(2000).Semin Surg Oncol 3302-11.
Patrick CW Jr，Chauvin PB，Reece GP(1999)Tissue Eng 5139.
Patrick CW Jr，F(xiàn)riedrich J，Miller MJ(1998)Anal Quant CytolHistol 3199-206.
Patrick Jr.，(2000)Surg.Oncol.19302-311Patrick Jr.，F(xiàn)rontiers in Tissue Engineering，1stEd.，Oxford，ElsevierScience，1998369-382；Patrick，CW Jr.，Miller，MJ(2003)Clin Plast Surg 191-103.
Patrick，Jr.et al，(1999)Tissue Eng.5139；Patrick，Jr.，(2000)Surg.Oncol.19302-311；Patrick，Jr.，(2001)Anat.Rec.263361-366；Patrick，Jr.，F(xiàn)rontiers in Tissue Engineering，1stEd.，Oxford，Elsevier Science，1998369-382；Peterson SL，Moore EE(2003)Plast Reconstr Surg 1121371-1375Pittenger et al.，(1999)Science 284143-147；Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，Jaiswal RK，Douglas R，MoscaJD，Moorrnan MA，Poshusta and Anseth，(2001)Cells Tissues Organs169272；Rahaman MN，Mao JJ(2004)Biotechnol Bioeng(In press).
Roncevic R，Roncevic D(1999)J Craniofac Surg 10284-300.
Shin H，Temenoff JS，Bowden GC，Zygowakis K，F(xiàn)arach-CarsonMC，Yaszemski MJ，Mikos AG(2005)Biomaterials 263645-3654.
Simonetti DW，Craig S，Marshak DR(1999)Science 284143-147.
Smaehel J，Meyer V，Shutz K(1990)Eur J Plast Surg 13163-168.
Thaller SR，Zarem HA，Kawamoto HK(1987)Am J Surg154149-153.
Toriyama K，Kawaguchi N，Kitoh J，Tajima R，Inou K，Kitagawa Y，Torii S(2002)Tissue Eng 1157-65.
Tremain N，Korldto J，Ibberson D(2001)Stem Cells 19408-418.
von Heimbwg D，Zachariah S，Heschel I，Kuhling H，Schoof H，Hafemann B，Pallua N(2001).Biomaterials 22429-438.
Vural E(2004)Curr Oncol Rep 6133-140.
Walgenbach et al.，(2003)Clin.Plast.Surg.30485；Walgenbach et al.，(2001)，Anat.Rec.263372-378Williams et al.，(2003)Tissue Eng.9679Yaremchuk MJ(2003)Plast Reconstr Surg 1111818-1827.
Alhadlaq and Mao 2003.J.Dent.Res.82951.
權(quán)利要求
1.軟組織構(gòu)成物，其包含分散在非多孔生物相容支架中的成體間充質(zhì)干細胞。
2.如權(quán)利要求1所述的軟組織構(gòu)成物，其進一步的特征在于具有預(yù)定的三維形狀和尺寸。
3.如權(quán)利要求1所述的軟組織構(gòu)成物，其中所述支架是水凝膠聚合物。
4.如權(quán)利要求3所述的軟組織構(gòu)成物，其中所述水凝膠聚合物是聚乙二醇雙丙烯酸酯。
5.如權(quán)利要求1所述的軟組織構(gòu)成物，其包含脂肪組織和纖維組織。
6.如權(quán)利要求1所述的軟組織構(gòu)成物，其中所述成體間充質(zhì)干細胞來自骨髓細胞。
7.如權(quán)利要求1所述的軟組織構(gòu)成物，其中所述支架為選自固體、液體、凝膠、網(wǎng)狀、粉末、海綿狀和糊狀物理形式。
8.如權(quán)利要求1所述的軟組織構(gòu)成物，其中所述支架包括選自聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙二醇、聚乙二醇及其混合物的材料。
9.如權(quán)利要求1所述的軟組織構(gòu)成物，其中所述支架包括選自藻酸鹽、殼聚糖、珊瑚、瓊脂糖、纖維蛋白、膠原、骨、硅酮、軟骨、羥磷灰石、磷酸鈣及其混合物的天然材料。
10.如權(quán)利要求1所述的軟組織構(gòu)成物，其中所述生脂劑選自吡格列酮、β家族生長因子和前列腺素。
11.制備具有預(yù)定的三維形狀和尺寸的軟組織構(gòu)成物的方法，所述方法包括(a)提供分散在預(yù)定的三維形狀和尺寸的非多孔生物相容支架中的成體間充質(zhì)干細胞；(b)將所述成體間充質(zhì)干細胞與生脂誘導(dǎo)添加物接觸；(c)將負(fù)載有所述脂肪細胞的所述支架植入宿主。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述非多孔生物相容支架是水凝膠聚合物。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其還包括(c)將所述間充質(zhì)細胞與成纖維細胞生長因子接觸。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中在所述水凝膠聚合物形成之前，將所述間充質(zhì)干細胞分在生物相容支架前體中。
15.如權(quán)利要求15所述的方法，其還包括在植入宿主之后引發(fā)所述水凝膠的聚合。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，其中軟組織包含脂肪組織和纖維組織。
17.權(quán)利要求1所述的軟組織構(gòu)成物在宿主軟組織修復(fù)、增大或重建中的用途。
18.如權(quán)利要求17所述的用途，其中所述宿主是哺乳動物。
19.誘導(dǎo)軟組織植入物中血管生成的方法，所述方法包括(a)制備至少一個含有bFGF和成體間充質(zhì)干細胞的水凝膠圓柱體；以及(b)在宿主中植入至少一個水凝膠圓柱體以誘導(dǎo)血管生成。
20.組合物，其包含(a)生物相容支架，其中所述支架包含聚乙二醇雙丙烯酸酯、2-羥基-1-[4-(羥基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮、地塞米松、轉(zhuǎn)化生長因子β-1、營養(yǎng)培養(yǎng)基，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含β-甘油磷酸鹽和抗壞血酸-2-磷酸鹽、青霉素和鏈霉素；以及(b)來自人骨髓的成體間充質(zhì)干細胞。
全文摘要
本發(fā)明描述了由生物相容支架中的成體間充質(zhì)干細胞(MSC
文檔編號A61L27/18GK101084026SQ200580029268
公開日2007年12月5日 申請日期2005年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月30日
發(fā)明者毛劍 申請人:伊利諾伊州大學(xué)理事會