人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物及其凍干粉和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物及其凍干粉和應(yīng)用，該人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物是取傳代培養(yǎng)的P3～P30代人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，利用細(xì)胞生長(zhǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞80%融合時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，先用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞三次，然后加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，收集無血清培養(yǎng)液，而未被收集的細(xì)胞利用消化液消化后，超聲破碎儀破碎細(xì)胞，離心后收集上清；將收集的無血清培養(yǎng)液和收集的上清混合后，過濾，收集過濾液對(duì)其濃縮，再除菌處理后制備而得。本發(fā)明的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物及其凍干粉具有多種生物學(xué)活性，可用于制備傷口愈合藥物或細(xì)胞修復(fù)藥物等生物醫(yī)藥產(chǎn)品，還可用于制備美白產(chǎn)品或皮膚抗皺產(chǎn)品等精細(xì)化工產(chǎn)品。
【專利說明】人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物及其凍干粉和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及干細(xì)胞在生物醫(yī)藥或醫(yī)學(xué)美容中使用的技術(shù)，尤其涉及人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在生物醫(yī)藥或醫(yī)學(xué)美容中的使用。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪組織來源廣泛、取材容易、細(xì)胞分離效率高、給患者帶來的創(chuàng)傷較少、并且不涉及倫理問題，因此日益受到廣泛重視。
[0003]人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞是脂肪組織中的一類多能性干細(xì)胞，其能夠分泌多種生物活性物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、多肽及細(xì)胞因子等，比如干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等，這些細(xì)胞生長(zhǎng)因子能夠控制或者維持受傷組織細(xì)胞，引導(dǎo)其自身修復(fù)。除此之外，人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞中還含有多種膜蛋白質(zhì)及生物活性因子等多種成分，這些成分相互協(xié)調(diào)相互補(bǔ)充，具有復(fù)雜的生理作用，能夠?qū)υS多組織器官產(chǎn)生影響，因此具有比較好的抗光老化、抗氧化、抗皺、美白肌膚、傷口愈合、細(xì)胞修復(fù)等功效。
[0004]目前，雖然已有研究利用特定的誘導(dǎo)條件體外誘導(dǎo)干細(xì)胞分泌上清用于醫(yī)療、化妝品等方面，但是這種條件培養(yǎng)基是應(yīng)用特定的細(xì)胞因子誘導(dǎo)干細(xì)胞分泌某些特定的因子從而達(dá)到療效，細(xì)胞因子本身價(jià)格昂貴，使得干細(xì)胞的應(yīng)用成本異常增高。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有多種生物學(xué)活性，可用于生物醫(yī)藥、精細(xì)化工領(lǐng)域的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物在制備傷口愈合藥物或細(xì)胞修復(fù)藥物等生物醫(yī)藥產(chǎn)品，或在制備美白產(chǎn)品或皮膚抗皺產(chǎn)品等精細(xì)化工產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物的凍干粉。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉的制備方法。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物的凍干粉在制備傷口愈合藥物或細(xì)胞修復(fù)藥物等生物醫(yī)藥產(chǎn)品，或在制備美白產(chǎn)品或皮膚抗皺產(chǎn)品等精細(xì)化工產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實(shí)現(xiàn)的:
人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物，該提取物是由如下方法制備而得:
步驟1.將人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)原代分離培養(yǎng)后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取傳代培養(yǎng)的P3~P30代人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，利用細(xì)胞生長(zhǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞80%融合時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，先用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞三次，然后加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，收集無血清培養(yǎng)液，而未被收集的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)處理；步驟2.將步驟I未被收集的細(xì)胞利用消化液消化后，超聲破碎儀破碎細(xì)胞，離心后收集上清； 步驟3、
將步驟I收集的無血清培養(yǎng)液和步驟2收集的上清混合后，過濾，收集過濾液對(duì)其濃縮，所得濃縮液再進(jìn)行除菌處理后，則制備得到所需人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物。
[0011]上述步驟I中，所述將人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)原代分離培養(yǎng)中，原代分離方法和培養(yǎng)方法采用本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作即可。
[0012]上述步驟I中，所述細(xì)胞生長(zhǎng)液是指含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，并且該培養(yǎng)液中還含有抗細(xì)菌抗生素；所述抗細(xì)菌抗生素為青霉素和鏈霉素兩種，其中青霉素在細(xì)胞生長(zhǎng)液中的終濃度為200 U/ml，鏈霉素在細(xì)胞生長(zhǎng)液中的終濃度為250 U/ml ;所述含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液為向市售的基礎(chǔ)DMEM/F12培養(yǎng)液中加入終濃度為10%的胎牛血清，并加入終濃度為200 U/ml的青霉素和終濃度為250 U/ml的鏈霉素即為本發(fā)明的細(xì)胞生長(zhǎng)液。
[0013]上述步驟I中，所述磷酸鹽緩沖液為pH值為7.0~7.2的PBS溶液。
[0014]上述步驟I中，所述細(xì)胞在無血清培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，這里的無血清培養(yǎng)液為市售產(chǎn)品。
[0015]上述步驟I中，具體操作時(shí)，將傳代培養(yǎng)的不同代細(xì)胞分別進(jìn)行處理，如:將P3代的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞利用細(xì)胞生長(zhǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞80%融合時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，先用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞三次，然后將細(xì)胞加入到無血清培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，收集得到P3的無血清培養(yǎng)液；將P4代的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞利用細(xì)胞生長(zhǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞80%融合時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，先用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞三次，然后將細(xì)胞加入到無血清培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，收集得到P4代的無血清培養(yǎng)液等等；然后將P3~P30代人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分別得到的無血清培養(yǎng)液收集合并后，則得到實(shí)施例1收集的無血清培養(yǎng)液；同時(shí)，將P3~P30代人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分別得到的未被收集的細(xì)胞收集合并后，一起進(jìn)行后續(xù)處理。
[0016]上述步驟2中，所述消化液為0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液，該混合消化液先經(jīng)0.22Mm的濾膜過濾除菌后才能用于本發(fā)明；所述0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液為本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)常用的一種消化液，其配制方法按照教科書上給出的配制方法，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明；如可采用如下方法配制:取0.25g胰蛋白酶粉、20mgEDTA粉末和100ml 0.01mol/L的PBS，先用少量PBS溶解胰蛋白酶粉，然后將EDTA粉末和其余的PBS加入混合后，置于37°C水浴中，待徹底溶解液體呈透明為止，用G5抽濾，分裝置于4°C冰箱中保存即可。
[0017]上述步驟2中，所述超聲破碎儀破碎細(xì)胞，其破碎條件為4°C、400W、超聲3s、間隔6s, 99個(gè)循環(huán)。
[0018]上述步驟2中，所述離心為17000g、30min。
[0019]上述步驟3中，所述將步驟I收集的無血清培養(yǎng)液和步驟2收集的上清混合，這里步驟I收集的無血清培養(yǎng)液和步驟2收集的上清的混合比例為1: 1，體積比。
[0020]上述步驟3中，所述過濾是采用孔徑為0.45Mm的濾膜過濾。
[0021]上述步驟3中，所述濃縮是采用截留分子量為3KD的過濾膜進(jìn)行濃縮脫鹽。
[0022]上述步驟3中，所述濃縮是指濃縮至原體積的1/10，也就是說，將過濾液濃縮后得到濃縮液，所述濃縮液的體積是過濾液的1/10。
[0023]上述步驟3中，所述將濃縮液進(jìn)行除菌處理，這里的除菌處理是將濃縮液采用無菌的0.22Mm濾膜過濾除菌。
[0024]上述制備的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，其具有很多種生物學(xué)活性，可用于制備傷口愈合藥物或細(xì)胞修復(fù)藥物等生物醫(yī)藥產(chǎn)品，還可用于制備美白產(chǎn)品或皮膚抗皺產(chǎn)品等精細(xì)化工產(chǎn)品。
[0025]本發(fā)明的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物雖然具有多種生物學(xué)活性，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，但是其生物學(xué)活性受各種外界條件限制，保存起來不方便，因此本發(fā)明還提供人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物的凍干粉，該凍干粉就是將本發(fā)明的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物經(jīng)本領(lǐng)域常用的凍干粉制備方法制備的凍干粉；凍干粉是在無菌環(huán)境下將藥液冷凍成固態(tài)，抽真空將水分升華干燥而成的無菌粉，凍干粉的制備方法是本領(lǐng)域比較成熟的技術(shù)，本發(fā)明采用任何一種凍干粉的制備方法，都可以得到所需的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉。
[0026]為了取得更好的醫(yī)藥學(xué)效果，本發(fā)明還特別針對(duì)上述人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物的特點(diǎn)，研發(fā)了人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉的制備方法，該制備方法包括如下步驟:
向人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物中加入賦形劑和水，混合后過濾除菌，然后進(jìn)行凍干處理，則制備得到所需人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉。
[0027]上述凍干粉的制備方法中，所述賦形劑采用甘露醇、海藻糖或蔗糖中的任意一種。
[0028]上述凍干粉的制備方法中，所述賦形劑的用量:賦形劑占人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物總重量的5~10%。
[0029]上述凍干粉的制備方法中，所述水采用超純水。
[0030]上述凍干粉的制備方法中，加入超純水至最終體積為100ml。
[0031]上述凍干粉的制備方法中，所述凍干處理是指凍干溫度為-20~_35°C、真空度為50~200Pa，凍干48小時(shí)。
[0032]本發(fā)明的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉同樣具有多種生物學(xué)活性，可用于制備傷口愈合藥物或細(xì)胞修復(fù)藥物等生物醫(yī)藥產(chǎn)品，還可用于制備美白產(chǎn)品或皮膚抗皺產(chǎn)品等精細(xì)化工產(chǎn)品。
[0033]本發(fā)明的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉制備方法簡(jiǎn)單，易于保存和運(yùn)輸。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的流式細(xì)胞檢測(cè)圖；
圖2為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉對(duì)HDF細(xì)胞生長(zhǎng)的影響結(jié)果柱狀圖；
圖3為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉對(duì)細(xì)胞內(nèi)SOD酶活性的影響結(jié)果柱狀圖；圖中，I為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉2(^g/ml組；2為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉lOPg/ml組；3為模型組；4為陽(yáng)性對(duì)照組；5為陰性對(duì)照組；其中:**P ^ 0.01,氺P ^ 0.05 ；
圖4為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的小鼠血漿中SOD酶活性的檢測(cè)結(jié)果柱狀圖；
圖中，I為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉2(^g/ml組；2為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉lOPg/ml組；3為模型組；4為陽(yáng)性對(duì)照組；5為陰性對(duì)照組；其中:**P ^ 0.01,氺P ^ 0.05 ；
圖5為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的小鼠血漿中GPx活性的檢測(cè)結(jié)果柱狀圖；
圖中，I為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉2(^g/ml組；2為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉lOPg/ml組；3為模型組；4為陽(yáng)性對(duì)照組；5為陰性對(duì)照組；其中:**P ^ 0.01,氺P ^ 0.05 ；
圖6為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的小鼠血漿中MDA含量的檢測(cè)結(jié)果柱狀圖。
[0035]圖中，I為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉2(^g/ml組；2為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉lOPg/ml組；3為模型組；4為陽(yáng)性對(duì)照組；5為陰性對(duì)照組；其中:**P ^ 0.01, *P = 0.05。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何限定。 [0037]實(shí)施例1人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離、培養(yǎng)及鑒定
1、人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離和培養(yǎng)
將通過脂肪抽吸術(shù)獲取的人體腹部皮下脂肪組織抽提液(術(shù)前己排除內(nèi)分泌疾病及傳染病)800g離心，用PBS緩沖液沖洗，浸泡，再800gX4min洗滌3次；剔除肉眼可見的血管及結(jié)蹄組織，用眼科剪將其充分剪碎后放入50ml離心管，加入2倍體積0.2%膠原酶、I倍體積1%BSA和雙抗，混勻，封口，放入搖床中37°C消化45min，至糊狀為止；
加入等體積的含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的低糖DMEM終止消化，1800r/min離心IOmin,離心后分為3層，上層為油脂及未消化完全的脂肪組織，中層為上清液，下層為脂肪干細(xì)胞和紅細(xì)胞等混合細(xì)胞的沉淀；
棄上層和中層，下層加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，70Mm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，將濾過后的濾液調(diào)整細(xì)胞濃度為5 X IO5單核細(xì)胞/mL接種于T-25cm2培養(yǎng)瓶中，37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)，48h后換液，加入脂肪干細(xì)胞完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
[0038]2、人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定
采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定，結(jié)果如圖1所示，細(xì)胞中CD29、⑶44、⑶90呈陽(yáng)性表達(dá)，⑶49d、⑶71呈弱陽(yáng)性，而⑶34、⑶45呈陰性表達(dá)，因此可判定為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0039]實(shí)施例2人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物
本實(shí)施例的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物，該提取物是由如下方法制備而得:
步驟1.將經(jīng)過鑒定的傳代培養(yǎng)的P3~P30代人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，利用細(xì)胞生長(zhǎng)液(所述細(xì)胞生長(zhǎng)液是向市售的基礎(chǔ)DMEM/F12培養(yǎng)液中加入終濃度為10%的胎牛血清以及終濃度為200 U/ml的青霉素和終濃度為250 U/ml的鏈霉素制備而得)培養(yǎng)至細(xì)胞80%融合時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，先用磷酸鹽緩沖液(所述磷酸鹽緩沖液為PH值為7.0~7.2的PBS溶液)洗滌細(xì)胞三次，然后加入市售的無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，收集P3~P30代各代人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分別得到的無血清培養(yǎng)液并合并，而未被收集的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)處理；
步驟2.將步驟I未被收集的細(xì)胞利用消化液(所述消化液為0.25%胰蛋白酶-0.0296EDTA混合消化液，且該混合消化液經(jīng)0.22Mffl的濾膜過濾除菌)消化后，加入步驟I用的細(xì)胞生長(zhǎng)液終止消化，4°C、3000g、離心5min ;PBS洗滌細(xì)胞3次，并重懸細(xì)胞，放于冰上利用超聲破碎儀破碎細(xì)胞，破碎條件為400W、超聲3s、間隔6s，99個(gè)循環(huán)；待液體變澄清后，4°C、17000g、離心30min收集上清，將P3~P30代各代人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分別得到的上清收集并合并；步驟3、
將步驟I收集的無血清培養(yǎng)液和步驟2收集的上清以1:1的體積比混合后，利用
0.45Mffl濾器過濾溶液，收集過濾液并將該過濾液濃縮至原體積的十分之一，所得濃縮液用無菌的0.22ΜΠ1濾膜過濾除菌，則制備得到本實(shí)施例的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物溶液。
[0040]實(shí)施例3人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉
采用BCA法對(duì)實(shí)施例2制備的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物溶液進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，酶標(biāo)儀測(cè)定A570的吸光度，得到實(shí)施例2制備的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物溶液的蛋白濃度，然后根據(jù)該蛋白濃度，按照需凍干溶液的最終質(zhì)量加入賦形劑甘露醇(甘露醇占人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物總重量的5%)和50~60°C的超純水混勻，并調(diào)節(jié)至蛋白終濃度為50.0±0.5μδ/πι1,過濾除菌，然后凍干處理，凍干溫度為-20~-35°C，真空度為50~200Pa，凍干時(shí)間48小時(shí)，則制得所需的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉；凍干粉按照Iml量/支分裝。
[0041]人脂肪間充質(zhì) 干細(xì)胞提取物凍干粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)如下所示:
(I)外觀
觀察人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉產(chǎn)品為白色、粉末狀。按標(biāo)示量用Iml超純水溶解后為澄清、透明的淡紅色溶液。
[0042](2) pH值的測(cè)定
采用精密PH計(jì)測(cè)定人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉的pH值。首先根據(jù)操作說明書利用標(biāo)準(zhǔn)液對(duì)PH計(jì)進(jìn)行校正，再對(duì)干細(xì)胞提取物凍干粉水溶液進(jìn)行測(cè)定。人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉水溶液的PH值在6.5~7.5之間。
[0043]實(shí)施例4人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉體外抗光老化試驗(yàn)
(I) MTT法測(cè)定人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響檢測(cè)樣品:實(shí)施例3制備的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉(蛋白含量為50.0±0.5μδ / 支)。
[0044]受試生物體:HDF細(xì)胞。
[0045]具體步驟如下所示:
(1)利用10%(v/v)FBS 的 DMEM/F12 培養(yǎng)基(青霉素 200 U/ml、鏈霉素 250 U/ml,pH7.2)培養(yǎng)HDF細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到100%融合時(shí)，利用細(xì)胞消化液消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為為I X 105cell/ml，接種至Ij 96孔板中，每孔100 μ 1，設(shè)定4個(gè)復(fù)孔，37°C、5%C02、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；
(2)24h后，棄去培養(yǎng)基，用含1%FBS的DMEM/F1培養(yǎng)基稀釋干細(xì)胞提取物至終濃度為400 μ g/ml、200μ g/ml、100 μ g/ml、50 μ g/ml、25 μ g/ml、12.5 μ g/ml、6.25 μ g/ml,每孔加入ΙΟΟμ 1，設(shè)定4個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入1%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基。37°C、5%C02、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；(3)48h后，加入20 μ I/孔的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，加入DMS0100 μ I/孔，避光震蕩15min，利用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為570nm、參考波長(zhǎng)為630nm處測(cè)定吸光度，并計(jì)算細(xì)胞存活率。
[0046]細(xì)胞存活率(％)=(實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值/對(duì)照組平均吸光度值)X 100%
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉在濃度=400 μ g/ml時(shí)對(duì)HDF
細(xì)胞無明顯的抑制作用，鏡下觀察細(xì)胞也無明顯的死亡等癥狀。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比較，其細(xì)胞存活率沒有明顯的差異，說明沒有出現(xiàn)顯著的細(xì)胞死亡，而當(dāng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉濃度=100 μ g/ml時(shí)能夠促進(jìn)HDF細(xì)胞的生長(zhǎng)。
[0047](2)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉對(duì)紫外損傷人真皮成纖維細(xì)胞的保護(hù)作用 檢測(cè)樣品:實(shí)施例3制備的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉(蛋白含量為
50.0±0.5μδ / 支)。
[0048]受試生物體:HDF細(xì)胞。
[0049]具體步驟如下所示:
(1)當(dāng)人真皮成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，用UVA紫外線照射細(xì)胞，每天照射2小時(shí)，共照射4天，陰性對(duì)照組用錫紙包住細(xì)胞培養(yǎng)瓶。在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始出現(xiàn)皺縮，個(gè)別細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)基中；第五天，加入人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉，蛋白終濃度分別為20 μ g/ml和10 μ g/ml，維生素C20 μ g/ml作為陽(yáng)性對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞；
(2)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉對(duì)細(xì)胞內(nèi)SOD酶活性的影響:胰酶消化后，細(xì)胞在1500g、4°C條件下離心lOmin。細(xì)胞沉淀懸浮在遇冷的緩沖液中(50mM的Tris - HCl,5mM EDTA和I mM DTT)進(jìn)行超聲，裂解液在10000g、4°C條件下離心lOmin，上清利用SOD檢測(cè)試劑盒根據(jù)其說明方法進(jìn)行分析。
[0050]結(jié)果如圖3所示，人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉蛋白濃度無論是20μ g/ml，還是10 μ g/ml都不同程度地提高了細(xì)胞內(nèi)SOD酶的活性，從而減少因紫外線輻射誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧自由基對(duì)細(xì)胞的攻擊和損害，降低細(xì)胞的死亡率，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用，達(dá)到抗光老化的功效。
[0051]實(shí)施例5人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉對(duì)紫外線引起小鼠皮膚光老化的保護(hù)作用
一、實(shí)驗(yàn)方案
1、檢測(cè)樣品:實(shí)施例3制備的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉(蛋白含量為50.0±0.5μδ / 支)。
[0052]2、試驗(yàn)方法:
2.1動(dòng)物飼養(yǎng):4周齡SP F級(jí)雌性昆明小鼠(體重20±2g)，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，剔除小鼠背部毛，裸露皮膚棉結(jié)約2cm2，進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)過程中正常給水和飼料。
[0053]2.2實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理:小鼠分為五組，每組5只，分別進(jìn)行如下操作:
第I組:用生理鹽水溶解人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉，制備得到人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉濃度為2(^g/ml的溶液；將前述人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉濃度為2(^g/ml的溶液涂抹到小鼠上，涂抹量為Iml/只，I次/天(照射前)，然后紫外照射；第2組:用生理鹽水溶解人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉，制備得到人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉濃度為lOPg/ml的溶液；將前述人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉濃度為lOPg/ml的溶液涂抹到小鼠上，涂抹量為Iml/只，I次/天(照射前)，然后紫外照射；第3組:模型組，該組的小鼠不涂抹人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉，紫外照射；
第4組:陽(yáng)性對(duì)照組，用生理鹽水溶解維生素C (VitC)制備得到維生素濃度為2(^g/ml的溶液，將該溶液涂抹于小鼠上，涂抹量為Iml/只，I次/天(照射前)，然后紫外照射；第5組:陰性對(duì)照組，該組的小鼠什么也不涂抹，也不紫外照射。
[0054]紫外線照射的具體操作:對(duì)小鼠給藥Ih待藥物被吸收后進(jìn)行紫外照射，第一周每天照射lh，第二周每天照射2h，第三周每天照射3h，從第4周開始每天照射4h，總共照射42天；紫外線的強(qiáng)度為:UVA:0.25mJ/cm2/s, UVB:0.02mJ/cm2/s ;待照射完成后，將老鼠處死，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)；對(duì)老鼠進(jìn)行放血，血清在2500g、4°C條件下離心4min，取上清進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。
[0055]3、檢測(cè)項(xiàng)目: 血漿中SOD酶、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)及丙二醛(MDA)含量的測(cè)定:對(duì)小鼠進(jìn)行放血,在2500g、4°C條件下離心4min,收集上清；
SOD的活性，GPx的活性以及MDA的含量利用南京建成生物工程研究所提供的診斷試劑盒根據(jù)供應(yīng)商的說明書進(jìn)行測(cè)定分析。
[0056]皮膚組織切片HE染色，觀察皮膚結(jié)構(gòu)的變化:取小鼠背部剔除毛的皮膚，10%的甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色觀察。
[0057]4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
圖4為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的小鼠血漿中SOD酶活性的檢測(cè)結(jié)果柱狀圖，由圖4可以看出:模型組小鼠體內(nèi)的SOD酶活性7.26±2.24U/ml，而第I組小鼠體內(nèi)SOD酶活性為53.3±5.99U/ml，第2組小鼠體內(nèi)SOD酶活性為37.26±2.24U/ml ;干細(xì)胞提取物保護(hù)的小鼠體內(nèi)SOD酶活性雖然沒有恢復(fù)到正常對(duì)照組水平，但是與模型組和陽(yáng)性藥VitC組比較，均具有大幅度的提高，說明干細(xì)胞提取物能夠更加有效清除或者協(xié)助動(dòng)物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)清除體內(nèi)的氧自由基等有害物質(zhì)，從而使抗氧化平衡系統(tǒng)保持穩(wěn)定。
[0058]圖5是5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的小鼠血漿中GPx活性的檢測(cè)結(jié)果柱狀圖，從圖5可以看出，第I組小鼠和第2組小鼠的GPx活性都比模型組和陽(yáng)性藥VitC組要好，從而保護(hù)了小鼠皮膚；其中第I組和第2組受試小鼠血漿中GPx酶活性分別是=1125.33 + 104.47U/ml,811.27 ±125.88U/ml ;模型組小鼠血漿中 GPx 酶活性是 591.55 ±176.47U/ml。
[0059]圖6是5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的小鼠血漿中MDA含量的檢測(cè)結(jié)果柱狀圖，從圖6可以看出，陰性對(duì)照組的MDA含量最低6.54±0.66nmol/ml，模型組的MDA含量最高25.92±1.16nmol/ml，人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物有效地降低了 MDA的含量，保持了體內(nèi)抗氧化平衡系統(tǒng)。
[0060]5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的小鼠皮膚組織的檢測(cè)結(jié)果如下所示:
第I組:皮膚結(jié)構(gòu)完整且清晰，和正常皮膚組織沒有明顯的差別，表皮及真皮層均未見明顯增厚，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象；
第2組:真皮內(nèi)的膠原纖維排列較為整齊，皮膚附件有少許的增生；
第3組(模型組):小鼠表皮厚度明顯增加，真皮厚度急劇減少，膠原纖維異常增長(zhǎng)且排列紊亂，皮膚附件也出現(xiàn)明顯的增生，呈現(xiàn)出皮膚初期老化的特征；第4組(陽(yáng)性對(duì)照組):表皮有一定的增生現(xiàn)象，皮膚深層膠原纖維排列較為松散；
第5組(陰性對(duì)照組):皮膚正常，沒有明顯的裂痕和增生現(xiàn)象，沒有初期老化的特征。
[0061]由于維生素C是已知的具有良好防曬效果的藥物，因此作為本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性藥，而最終結(jié)果表明本發(fā)明的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉的不同劑量組都有較好的對(duì)紫外線引起小鼠皮膚光老化的保護(hù)或修復(fù)作用，效果等同于或大于陽(yáng)性對(duì)照組。
[0062]實(shí)施例6人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉的毒性評(píng)價(jià)
本實(shí)施例的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉的毒性評(píng)價(jià)分為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉的小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)(一次限量法)、人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉的大鼠急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)(一次限量法)和人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉的家兔皮膚光毒性試驗(yàn)。
[0063]一、人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉的小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)(一次限量法) 樣品:實(shí)施例3制備的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉。
[0064]受試生物體:昆明小鼠。
[0065]試驗(yàn)方法:
前期體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉基本無毒，因此采用一次限量法證實(shí)其對(duì)生物體的安全性，即一次最大灌胃劑量采用其10倍實(shí)效標(biāo)示藥量(50.0±0.5Pg /支X 10支)的受試物對(duì)10只昆明小鼠(雌雄各半，體重為20.0g± 0.2g)進(jìn)行灌胃，觀察其毒性反應(yīng)，當(dāng)未引起動(dòng)物死亡，則不再進(jìn)行多個(gè)劑量的急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。
[0066]觀察期限:14天。
[0067]實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察:未觀察到試驗(yàn)動(dòng)物有任何不良反應(yīng)，亦沒有動(dòng)物死亡。
[0068]二、人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉的大鼠急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)(一次限量法) 樣品:實(shí)施例3制備的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉。
[0069]受試生物體:SD大鼠(廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。
[0070]試驗(yàn)方法:
前期體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉基本無毒，因此采用一次限量法進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)生物體的安全性，即用10只動(dòng)物(雌雄各半，體重為149.1±12.48)，皮膚涂抹200011^ /kg體重劑量的干細(xì)胞提取物水溶液，當(dāng)未引起動(dòng)物死亡，則不再進(jìn)行多個(gè)劑量的急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)。
[0071]觀察期限:14天。
[0072]觀察結(jié)果:未觀察到試驗(yàn)動(dòng)物有任何不良反應(yīng),亦沒有動(dòng)物死亡。
[0073]三、人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉的家兔皮膚光毒性試驗(yàn) 樣品:實(shí)施例3制備的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉。
[0074]受試生物體:成年白色家兔(廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)50只，雌性各半。
[0075]UV 光源:波長(zhǎng)為 320nm ~400nm 的 UVA。
[0076]照射時(shí)間:1.5h。
[0077]試驗(yàn)步驟:
進(jìn)行正式光毒試驗(yàn)前18~24h，將家兔脊柱兩側(cè)皮膚去毛，試驗(yàn)部位皮膚需完好，無損傷及異常；備4塊去毛區(qū)，每塊去毛面積約為2cmX 2cm，去毛皮的試驗(yàn)安排如表1所示；將動(dòng)物固定，根據(jù)下表，在動(dòng)物去毛區(qū)I和2分別涂敷Iml含l(^g/ml、2(^g/ml受試物水溶液；30min后，左側(cè)(去毛區(qū)I和3)用鋁箔復(fù)蓋，膠帶固定，右側(cè)用UVA進(jìn)行照射，結(jié)束后分別于
1、24、48和72h觀察皮膚反應(yīng)，根據(jù)皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分表判斷是否對(duì)皮膚有刺激反應(yīng)，結(jié)果如表2所示。
[0078]表1動(dòng)物去毛區(qū)的試驗(yàn)安排
【權(quán)利要求】
1.人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物，其特征在于該人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物是由如下方法制備而得: 步驟1.將人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)原代分離培養(yǎng)后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取傳代培養(yǎng)的P3~P30代人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，利用細(xì)胞生長(zhǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞80%融合時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，先用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞三次，然后加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，收集無血清培養(yǎng)液，而未被收集的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)處理； 步驟2.將步驟I未被收集的細(xì)胞利用消化液消化后，超聲破碎儀破碎細(xì)胞，離心后收集上清； 步驟3、 將步驟I收集的無血清培養(yǎng)液和步驟2收集的上清混合后，過濾，收集過濾液對(duì)其濃縮，所得濃縮液再進(jìn)行除菌處理后，則制備得到所需人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物，其特征在于所述步驟I中，細(xì)胞生長(zhǎng)液是指含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液中還含有終濃度為200 U/ml的青霉素和終濃度為250 U/ml的鏈霉素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物，其特征在于所述步驟2中，消化液為經(jīng)0.22Mm的濾膜過濾除菌的0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物，其特征在于所述步驟2中，超聲破碎儀破碎細(xì)胞的條件為4°C、400W、超聲3s、間隔6s，99個(gè)循環(huán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所 述人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物，其特征在于所述步驟3中，步驟I收集的無血清培養(yǎng)液和步驟2收集的上清的混合比例為1:1，體積比。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物，其特征在于所述步驟3中，過濾是采用孔徑為0.45ΜΠ1的濾膜過濾，濃縮是采用截留分子量為3KD的過濾膜濃縮至原體積的的1/10，除菌處理是采用無菌的0.22ΜΠ1濾膜過濾除菌。
7.權(quán)利要求1-6所述任一項(xiàng)的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物在制備傷口愈合藥物、細(xì)胞修復(fù)藥物、美白產(chǎn)品或皮膚抗皺產(chǎn)品中的應(yīng)用。
8.人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉，其特征在于該凍干粉是由權(quán)利要求1-6所述任一項(xiàng)的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物經(jīng)凍干處理制備而得。
9.權(quán)利要求8所述人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉的制備方法，其特征在于該制備方法包括如下步驟: 向人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物中加入賦形劑和水，混合后過濾除菌，然后進(jìn)行凍干處理，則制備得到人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉；所述賦形劑采用甘露醇、海藻糖或蔗糖中的任意一種，賦形劑占人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物總重量的5~10% ;所述凍干處理的凍干溫度為-20~-35°C、真空度為50~200Pa，凍干48小時(shí)。
10.權(quán)利要求8所述人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物凍干粉在制備傷口愈合藥物、細(xì)胞修復(fù)藥物、美白產(chǎn)品或皮膚抗皺產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K35/34GK103784474SQ201410037863
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月26日
【發(fā)明者】陳海佳, 王一飛, 舒輝萍, 劉秋英, 馬巖巖 申請(qǐng)人:廣州賽萊拉生物科技有限公司