專利名稱：：蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病pcr快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病，簡(jiǎn)稱歐幼病(Europeanfoulbrood，EFB)是蜜蜂幼蟲(chóng)期的一種接觸性傳染病，主要感染2日齡以下的小幼蟲(chóng)，但是病程延長(zhǎng)時(shí)封蓋幼蟲(chóng)也有死亡的，在這種情況下容易與美腐病棍淆。它的病原菌不形成芽孢，較易治愈。歐幼病，廣泛發(fā)生于各養(yǎng)蜂國(guó)，屬于世界性病害。該病于1885年首次報(bào)道，目前廣泛發(fā)生于世界幾乎所有的養(yǎng)蜂生產(chǎn)國(guó)。我國(guó)于20世紀(jì)50年代初在廣東省首次發(fā)現(xiàn)，60年代初南方諸省相繼出現(xiàn)病害，隨后蔓延全國(guó)。該病不僅西方蜜蜂感染，東方蜜蜂尤其是中蜂也易感染，且感染后發(fā)病比西方蜜蜂嚴(yán)重得多。EFB—般只感染小于2日齡的幼蟲(chóng)，通常病蟲(chóng)在4-5日齡死亡?；疾『?，蟲(chóng)體變色，失去肥胖體態(tài)。從珍珠般白色變?yōu)榈S色、黃色、淺褐色，甚至黑褐色。剛變褐色時(shí)，通過(guò)表皮清晰可見(jiàn)幼蟲(chóng)的氣管系統(tǒng)。隨著變色，幼蟲(chóng)塌陷，似乎被扭曲，最后在巢房底部腐爛，干枯，成為粘性、易清除的鱗片。蟲(chóng)體腐爛時(shí)有難聞的酸臭味。致病菌為蜂房蜜蜂球菌(Melissococcuspluton，M.pluton)，為蜜蜂球菌屬，該菌單個(gè)的形態(tài)為披針形，直徑0.5l.Oym，革蘭氏染色陽(yáng)性，常結(jié)成鏈狀或成簇排列。主要侵害12日齡的蜜蜂幼蟲(chóng)，使幼蟲(chóng)在34日齡未卦蓋時(shí)大量死亡，成為蜜蜂的主要病害之一。歐洲幼蟲(chóng)腐臭病的早期檢查有助于防止疾病的蔓延。面對(duì)國(guó)際嚴(yán)峻形勢(shì)，根據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織對(duì)動(dòng)物重大傳染病檢疫技術(shù)的有關(guān)規(guī)定，結(jié)合我國(guó)實(shí)際情況研究制訂符合國(guó)際規(guī)則的蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病檢疫規(guī)程已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。關(guān)于蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭的診斷方法，國(guó)內(nèi)還主要根據(jù)臨床證狀來(lái)進(jìn)行診斷，診斷水平還比較低。目前國(guó)內(nèi)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1687-2005蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病診斷方法主要基于蜂房蜜蜂球菌的形態(tài)學(xué)觀察來(lái)進(jìn)行診斷，該標(biāo)準(zhǔn)是將臨床上疑似蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病的幼蟲(chóng)或死亡的幼蟲(chóng)進(jìn)行染色直接鏡檢初步診斷為蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病，然后經(jīng)分離培養(yǎng)后染色鏡檢，在普通光學(xué)顯微鏡下，蜂房蜜蜂球菌呈單個(gè)或成串或頭尾相間成對(duì)或成短鏈狀或成簇排列的短披針型球菌，大小為0.5mmX10mm即可判定為蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病。該方法主要依靠形態(tài)學(xué)檢查，費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，判斷易受主觀因素影響。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是建立PCR檢測(cè)方法，為蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病診斷、防治、檢疫以及蜂產(chǎn)品病原污染檢測(cè)提供快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病PCR快速檢測(cè)方法。本發(fā)明步驟是a、采用CTAB法或者試劑盒法獲得歐洲幼蟲(chóng)腐臭病DNA;b、歐洲幼蟲(chóng)腐臭病DNA的濃度和純度的測(cè)定取5iiLDNA溶液加雙蒸水稀釋至lmL，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)260和A280，使A260與A280比值在1.72.0之間；c、引物EFB1:5，-CTTTGAACGCCTTAGAGA—3'EFB2:5'-ATCATCTGTCCCACCTTA-3'EFB3:5'-TTAACCTCGCGGTCTTGCGTCTCTC-3';d、采用半巢式PCR擴(kuò)增方法，根據(jù)蜂房蜜蜂球菌16SrRNA基因，設(shè)計(jì)引物EFBl和EFB2進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，所得PCR理論擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小為486bp，此步擴(kuò)增結(jié)果可以對(duì)蜂房蜜蜂球菌與其它雜菌進(jìn)行區(qū)分，但卻無(wú)法對(duì)與蜂房蜜蜂球菌親源關(guān)系較近的糞腸球菌進(jìn)行區(qū)分；進(jìn)而再以所得擴(kuò)增產(chǎn)物為模板設(shè)計(jì)第三條引物EFB3，其位置處于EFB1和EFB2引物中間，以EFB1和EFB3為弓|物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，理論擴(kuò)增片斷大小為276bp，可以特異性對(duì)與蜂房蜜蜂球菌親源關(guān)系較近的腸球菌進(jìn)行有效區(qū)分；最終通過(guò)半巢式PCR擴(kuò)增方法對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)及蜂產(chǎn)品中的蜂房蜜蜂球菌進(jìn)行特異性檢測(cè)。本發(fā)明試劑盒成份如下組分?jǐn)?shù)量10xBuffer1支(lmL)dNTPsMixture(各2.5mmol/L)1支(0.2mL)EFB1(20nmol/L)1支(,l)EFB2(20nmol/L)1支(lOOul)EFB3(20nmol/L)1支(腳l)ExTaq酶(5U爾D1支(300U)TemplateDNA1支(lmL)DEPCH201支(lmL)本發(fā)明具有快速、敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于快速診斷歐洲蜂幼蟲(chóng)腐臭，尤其對(duì)多種病原引起的混合感染的鑒別診斷更為有效。本標(biāo)準(zhǔn)的建立的PCR檢測(cè)方法，為我國(guó)歐洲蜂幼蟲(chóng)腐臭診斷、防治、檢疫以及蜂產(chǎn)品病原污染檢測(cè)提供快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，以期達(dá)到有效控制蜜蜂疾病，提高蜂產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。圖1是本發(fā)明16SrRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖中1:100bpDNALadderMarker;2:蜂房蜜蜂球菌；3:空白對(duì)照；4:微孢子蟲(chóng)病原；5:蜜蜂幼蟲(chóng)芽孢桿菌；6:蜜蜂敗血桿菌；7:糞腸球菌圖2是本發(fā)明蜂房蜜蜂球菌結(jié)果；圖中1:100bpDNALadderMarker;2:空白對(duì)照；3:糞腸球菌；4:蜂房蜜蜂球菌。圖3是本發(fā)明酶切鑒定結(jié)果；圖中1:100bpDNALadderMarker;2:蜂房蜜蜂球菌；3:糞腸球菌。圖4是本發(fā)明敏感性檢測(cè)結(jié)果；圖中1:100bpDNALadderMarker;2:10—1;3:10—2;4:10—3;5:10—4;6:10—5;7:lO—68:空白對(duì)照。圖5是本發(fā)明PCR敏感性檢測(cè)結(jié)果；圖中1:100bpDNALadderMarker;2:IO1;3:IO2;4:IO3;5:IO4;6:IO5;7:IO6;8:IO79:IO810:IO911:陰性對(duì)照。具體實(shí)施例方式本發(fā)明具體步驟是a、采用CTAB法或者試劑盒法獲得歐洲幼蟲(chóng)腐臭病DNA;b、歐洲幼蟲(chóng)腐臭病DNA的濃度和純度的測(cè)定取5yLDNA溶液加雙蒸水稀釋至lmL，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)260和A280，使A260與A280比值在1.72.0之間；c、引物EFB1:5'-CTTTGAACGCCTTAGAGA-3'EFB2:5'-ATCATCTGTCCCACCTTA-3'EFB3:5'—TTAACCTCGCGGTCTTGCGTCTCTC—3';d、采用半巢式PCR擴(kuò)增方法，根據(jù)蜂房蜜蜂球菌16SrRNA基因，設(shè)計(jì)引物EFBl和EFB2進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，所得PCR理論擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小為486bp，此步擴(kuò)增結(jié)果可以對(duì)蜂房蜜蜂球菌與其它雜菌進(jìn)行區(qū)分，但卻無(wú)法對(duì)與蜂房蜜蜂球菌親源關(guān)系較近的糞腸球菌進(jìn)行區(qū)分；進(jìn)而再以所得擴(kuò)增產(chǎn)物為模板設(shè)計(jì)第三條引物EFB3，其位置處于EFB1和EFB2引物中間，以EFB1和EFB3為弓|物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，理論擴(kuò)增片斷大小為276bp，可以特異性對(duì)與蜂房蜜蜂球菌親源關(guān)系較近的腸球菌進(jìn)行有效區(qū)分；最終通過(guò)半巢式PCR擴(kuò)增方法對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)及蜂產(chǎn)品中的蜂房蜜蜂球菌進(jìn)行特異性檢測(cè)。病料和菌種蜂房蜜蜂球菌NCDO2443標(biāo)準(zhǔn)株由福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)院提供，患蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病料由中國(guó)農(nóng)科院蜂病研究所提供；微孢子蟲(chóng)病原、蜜蜂幼蟲(chóng)芽孢桿菌、蜜蜂敗血桿菌、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)本局技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室保存。試劑及培養(yǎng)基細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒(MiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionKit,Ver.2.0)、TaqHSDNA聚合酶、dNTP(各2.5mmol/L)、10Xbuffer緩沖液、6XLoadingbuffer,100bpDNALadderMarker，Hinfl限制性內(nèi)切酶等購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，PCR引物由大連寶生物工程有限公司合成。培養(yǎng)基配制酵母浸出液10g，半胱氨酸2g，葡萄糖10g，可溶性淀粉10g，lMKH2P04P朋.6lOOmL，加入瓊脂2g，加蒸餾水lOOOmL，115。C滅菌20min。CTAB沉淀液稱取5.OgCTAB，2.3376g氯化鈉，加水溶解定溶至1L，分裝后高壓滅菌備用。實(shí)驗(yàn)儀器高速冷凍離心機(jī)(SIGMA3K30，德國(guó)西格馬公司)，核酸蛋白分析儀(GeneSpecV，HitachiNaKainstrumentsCo.，Ltd.日本)，PCR擴(kuò)增儀(BiometraTgradient-96，德國(guó)Biometra公司)，電泳儀(SAVANTPS500A美國(guó))，凝膠成像系統(tǒng)(KodakEDAS290，美國(guó)柯達(dá)公司)，C02培養(yǎng)箱(ThermoLifeScience)，生化恒溫培養(yǎng)箱，微量移液器(0.1誦BI0HIT芬蘭)、恒溫水浴鍋等。蜜蜂樣品(包括幼蟲(chóng)和成蟲(chóng))DNA的提取及純化—、CTAB法稱取約200mg用研缽磨碎的樣品轉(zhuǎn)入2mL的離心管中。加入1.3mLDNA抽提緩沖液，渦旋震蕩30s后，顛倒混合5min(注意不要使樣品結(jié)塊)，65。C水浴30min。室溫10000g離心10min，取上層溶液800iiL，加入5iiLRNaseA(10yg/mL)，37。C保溫30min。加入等體積的三氯甲烷異戊醇(24:l，v/v)，顛倒混勻lmin，室溫lOOOOg離心lOmin，取上清液600iiL，加入2倍體積的CTAB沉淀液，混勻，室溫放置30min。室溫8000g離心10min，棄上清液。加入800iiL氯化鈉(NaCl)(1.2mol/L)溶解沉淀，待沉淀溶解后室溫放置5min，加入等體積三氯甲烷異戊醇(24:1，v/v)，顛倒混勻。室溫10000g離心10min，取上清液600iiL，移入1.5mL的E卯endorf管中，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置30min。4°C，5000g離心10min，棄上清液。70%冷乙醇200yL洗滌沉淀兩次，100%冷乙醇200yL洗滌沉淀一次，自然干燥10min。加入50iiLTE緩沖液(pH8.0)，溶解DNA沉淀。-2(TC長(zhǎng)期保存。二、試劑盒法可根據(jù)需要選用相應(yīng)的商品化試劑盒，使用時(shí)按操作說(shuō)明書(shū)提取DNA。DNA濃度和純度的測(cè)定取5iiLDNA溶液加雙蒸水稀釋至lmL，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)260和A280。DNA的濃度按下述公式計(jì)算c=AXNX50/1000公式中c——DNA濃度，單位為微克每微升(yg/yL);A——260nm處的吸光值；N——核酸稀釋倍數(shù)。當(dāng)A260/A280比值在1.72.0之間時(shí)，適用于PCR擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)與合成采用半巢式PCR擴(kuò)增方法，根據(jù)蜂房蜜蜂球菌16SrRNA基因，設(shè)計(jì)引物EFBl和EFB2進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，所得PCR理論擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小為486bp，此步擴(kuò)增結(jié)果可以對(duì)蜂房蜜蜂球菌與其它雜菌進(jìn)行區(qū)分，但卻無(wú)法對(duì)與蜂房蜜蜂球菌親源關(guān)系較近的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)進(jìn)行區(qū)分(此步糞腸球菌PCR擴(kuò)增片斷大小也為486bp);進(jìn)而再以所得擴(kuò)增產(chǎn)物為模板設(shè)計(jì)第三條引物(EFB3，其位置處于EFB1和EFB2引物中間)，以EFB1和EFB3為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，理論擴(kuò)增片斷大小為276bp，可以特異性對(duì)與蜂房蜜蜂球菌親源關(guān)系較近的腸球菌(沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物)進(jìn)6行有效區(qū)分。最終通過(guò)半巢式PCR擴(kuò)增方法對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)及蜂產(chǎn)品中的蜂房蜜蜂球菌進(jìn)行特異性檢測(cè)。表7-l蜂房蜜蜂球菌PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>PCR檢測(cè)PCR反應(yīng)液須在冰盒中進(jìn)行配制，配液順序?yàn)槿ルx子水(ddH20)、10Xbuffer、dNTP、引物、Taq酶、樣品DNA。以提取的蜂球囊菌DNA為模板，每次反應(yīng)均設(shè)陰性對(duì)照。反應(yīng)體系如下表表7-2反應(yīng)體系參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>應(yīng)用德國(guó)Biometra公司的BiometraTgradient-96梯度PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，其反應(yīng)步驟包括預(yù)變性、變性、退火、延伸，具體參數(shù)如表7-3表7-3循環(huán)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>第一輪PCR檢測(cè)特異性試驗(yàn)以微孢子蟲(chóng)病原、蜜蜂幼蟲(chóng)芽孢桿菌、蜜蜂敗血桿菌為特異性試驗(yàn)對(duì)照，以之前一檢測(cè)過(guò)的蜂房蜜蜂球菌DNA作為陽(yáng)性樣品，并設(shè)ddH20作為陰性對(duì)照，在之前已建立的最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)體系下進(jìn)行PCR反應(yīng)，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后分析結(jié)果并拍照。第二輪PCR檢測(cè)特異性試驗(yàn)以第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，用EFB2和EFB3為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，蜂房蜜蜂球菌理論擴(kuò)增片斷大小為276bp，屎腸球菌無(wú)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，從而達(dá)到有效鑒別的目的。第一輪PCR產(chǎn)物的酶切鑒定針對(duì)第一輪PCR無(wú)法對(duì)蜂房蜜蜂球菌與糞腸球菌進(jìn)行鑒別的問(wèn)題，通過(guò)對(duì)兩株菌的PCR產(chǎn)物序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)的分析，表明可以使用Hinfl限制性酶進(jìn)行酶切鑒別，蜂房蜜蜂球菌第一輪PCR產(chǎn)物經(jīng)Hinfl酶切后理論片段大小為340bp和146bp，而糞腸球菌第一輪PCR產(chǎn)物經(jīng)Hinfl酶切后理論片段大小為254bp、146bp和86bp三段，因此，可以也通過(guò)酶切的方法對(duì)這兩種菌第一輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行有效的鑒別。PCR檢測(cè)敏感性試驗(yàn)在已確定陽(yáng)性的幼蟲(chóng)芽胞桿菌懸液用生理鹽水作1(^、1(f、l(f、l(^、10s、10e倍稀釋，每個(gè)稀釋度的菌液各取lmL分別用來(lái)進(jìn)行平板計(jì)數(shù)和提取DNA。采用傾注法倒平板，在3rC正常大氣條件下培養(yǎng)。然后用IS0標(biāo)準(zhǔn)方法估計(jì)菌落總數(shù)，菌落數(shù)在300以上的平板應(yīng)排除，將各稀釋濃度平板所對(duì)應(yīng)提取的DNA用作模板，在最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)體系下進(jìn)行PCR檢測(cè)并觀察結(jié)果。蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病半巢式PCR檢測(cè)方法的建立與標(biāo)準(zhǔn)化第一輪PCR檢測(cè)的特異性試驗(yàn)結(jié)果用所設(shè)計(jì)的引物EFB1和EFB2對(duì)蜂房蜜蜂球菌16SrRNA基因進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖l所示。特異性的擴(kuò)增片段在400bp與500bp之間，約為485bp。從圖1可以看出通過(guò)第一輪PCR擴(kuò)增，蜂房蜜蜂球菌和糞腸球菌在約486bp處均擴(kuò)增出特異性條帶，如圖1中第2和第7泳道；而在微孢子蟲(chóng)病原、蜜蜂幼蟲(chóng)芽孢桿菌、蜜蜂敗血桿菌未見(jiàn)特異性擴(kuò)增條帶，表明可以通過(guò)第一輪PCR檢測(cè)達(dá)到與上述三種蜜蜂病原體鑒別診斷的目的。對(duì)于糞腸球菌還需通過(guò)后續(xù)試驗(yàn)方法進(jìn)一步鑒定。第二輪PCR檢測(cè)的特異性試驗(yàn)結(jié)果以第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，用EFB2和EFB3為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示，蜂房蜜蜂球菌可見(jiàn)大小為276bp特異性條帶，而屎腸球菌無(wú)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，從而達(dá)到有效鑒別的目的。第一輪PCR產(chǎn)物的酶切鑒定用Hinfl酶對(duì)蜂房蜜蜂球菌與糞腸球菌第一輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒別，結(jié)果如圖3所示，蜂房蜜蜂球菌第一輪PCR產(chǎn)物經(jīng)Hinfl酶切后理論片段大小為340bp和146bp，而糞腸球菌第一輪PCR產(chǎn)物經(jīng)Hinfl酶切后理論片段大小為254bp、146bp和86bp三段，因此，可以也通過(guò)酶切的方法對(duì)這兩種菌第一輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行有效的鑒別。PCR檢測(cè)敏感性試驗(yàn)結(jié)果在優(yōu)化好的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。從圖4可以看出7號(hào)(106模板稀釋度)隱約擴(kuò)出電泳條帶，8號(hào)(107模板稀釋度)則無(wú)電泳條帶。因此，所建立的PCR方法檢測(cè)的靈敏性可達(dá)106的模板稀釋度，相當(dāng)于最低可以檢出7CFU/ml，所以該P(yáng)CR方法的檢測(cè)敏感度為7CFU/ml。PCR敏感性檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。通過(guò)將蜂房蜜蜂球菌(M.pluton)菌液依次作10倍連續(xù)梯度稀釋，進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)，方法檢測(cè)限靈敏度可達(dá)到約20fg蜂房蜜蜂球菌(M.pluton)DNA，結(jié)果見(jiàn)圖5。根據(jù)Genebank網(wǎng)站公布的蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病16SrRNA基因序列設(shè)計(jì)引物EFBl和EFB2進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出486bp特異性片段，與微孢子蟲(chóng)病原、蜜蜂幼蟲(chóng)芽孢桿菌、蜂房蜜蜂球菌、蜜蜂敗血桿菌無(wú)交叉反應(yīng)，但與糞腸球菌有交叉反應(yīng)，以EFB1和EFB3為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，可與糞腸球菌鑒別，對(duì)第一輪PCR產(chǎn)物用Hinfl限制性酶進(jìn)行酶切可可與糞腸球菌鑒別。最終達(dá)到通過(guò)半巢式PCR擴(kuò)增方法對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)及蜂產(chǎn)品中的蜂房蜜蜂球菌進(jìn)行特異性檢測(cè)的目的。優(yōu)化出的蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病半巢式PCR方法反應(yīng)體系。本發(fā)明建立的半巢式PCR檢測(cè)方法，5h內(nèi)即可報(bào)告檢測(cè)結(jié)果，特異性較好，敏感性較好，靈敏度可達(dá)到約20fg蜂房蜜蜂球菌(M.pluton)DNA。EFB-EuropeanFoulbroodofHoneyBees，蜜蜂歐洲l幼蟲(chóng)腐臭病。M.pluton:Melissococcuspluton，蜂房蜜蜂球菌。DNA:deoxyribo皿leicacid，脫氧核糖核酸。PCR-polymerasechainreaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。Hemi-nestedPCR:半巢式PCR。bp:basepair，堿基對(duì)。16SrRNA:16SribosomalRNA，16S核糖體RNA基因。CTAB:Hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化銨。dATP:deoxyadenosinetriphosphate,脫氧腺苷三磷酸。dTTP:deoxythymidinetriphosphate,脫氧胸苷三磷酸。dCTP:deoxycytidinetriphosphate,脫氧胞苷三磷酸。dGTP;deoxyguanosinetriphosphate,脫氧鳥(niǎo)苷三磷酸。本發(fā)明試劑盒成份如下<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>原理以16SrRNA的編碼基因?yàn)橐锏陌氤彩絇CR技術(shù)來(lái)鑒定蜂房蜜蜂球菌(Melissococcuspluton，M.pluton)，根據(jù)Genebank網(wǎng)站公布的蜜蜂蜂房蜜蜂球菌保守序列，應(yīng)用DNAman軟件設(shè)計(jì)出一對(duì)引物EFB!、EFB2和EFB3，序列見(jiàn)附表1。通過(guò)半巢式PCR技術(shù)的改進(jìn)和引物的改良，達(dá)到在蜜蜂幼蟲(chóng)尚未發(fā)病的時(shí)候檢測(cè)出低含量的芽孢。設(shè)計(jì)引物EFB1和EFB2進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，所得PCR理論擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小為486bp，此步擴(kuò)增結(jié)果可以對(duì)蜂房蜜蜂球菌與其它雜菌進(jìn)行區(qū)分，但卻無(wú)法對(duì)與蜂房蜜蜂球菌親源關(guān)系較近的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)進(jìn)行區(qū)分(此步糞腸球菌PCR擴(kuò)增片斷大小也為486bp);進(jìn)而再以所得擴(kuò)增產(chǎn)物為模板設(shè)計(jì)第三條引物(EFB3，其位置處于EFB1和EFB2引物中間)，以EFB1和EFB3為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，理論擴(kuò)增片斷大小為276bp，可以特異性對(duì)與蜂房蜜蜂球菌親源關(guān)系較近的腸球菌(沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物)進(jìn)行有效區(qū)分。最終通過(guò)半巢式PCR擴(kuò)增方法對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)及蜂產(chǎn)品中的蜂房蜜蜂球菌進(jìn)行特異性檢測(cè)。規(guī)格[O川]50次。試劑盒組成-20°。以下保存，保存期6個(gè)月，可進(jìn)行50次檢測(cè)。適用儀器PCR儀。[one]樣品采集1.樣品的采集和前處理采樣過(guò)程中樣本間不得交叉污染，采樣及樣品前處理過(guò)程中須戴一次性手套。2.采樣工具棉拭子；剪刀、鑷子；E卯endorf管；研缽。以上取樣工具必須經(jīng)121°C±2°C，15min高壓滅菌并烘干。3.保存與運(yùn)送采集或處理的樣品在2°C『C條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h，長(zhǎng)期保存須在-7(TC以下，但應(yīng)避免反復(fù)凍融(凍融不超過(guò)三次)。樣品采集后，將采集的樣品密封并編號(hào)，采用保溫壺或泡沫箱加冰密封盡快運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。樣品提取蜂房蜜蜂球菌核酸提取，按TaKaRa細(xì)菌基因組小量提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法提取蜂房蜜蜂球菌DNA，_201:凍存或直接進(jìn)行PCR。試劑準(zhǔn)各、加樣和PCR擴(kuò)增1.加樣PCR反應(yīng)液須在冰盒中進(jìn)行配制，配液順序?yàn)槿ルx子水(ddH20)、10Xbuffer、dNTP、引物、Taq酶、樣品DNA。以提取的蜂球囊菌DNA為模板，每次反應(yīng)均設(shè)陰性對(duì)照。2.第一輪PCR擴(kuò)增設(shè)定好反應(yīng)參數(shù)95。C2min;95。C30s，61。C15s，72。C60s;40循環(huán)；72。C5min。3.第二輪PCR擴(kuò)增以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。設(shè)定好反應(yīng)參數(shù)95。C2min;95。C30s，56。C15s，72。C60s;40循環(huán)；72。C5min。結(jié)果判斷1.第一輪陽(yáng)性對(duì)照的特異性擴(kuò)增片段為486bp，陰性對(duì)照無(wú)特異性擴(kuò)增片段；第二輪陽(yáng)性對(duì)照的特異性擴(kuò)增片段為276bp，陰性對(duì)照無(wú)特異性擴(kuò)增片段；2.第一輪PCR擴(kuò)增，樣品出現(xiàn)特異性擴(kuò)增片段為486bp，表明樣品中可能存在蜂房蜜蜂球菌，同時(shí)陰性對(duì)照無(wú)特異性擴(kuò)增片段，初步判為陽(yáng)性；第二輪PCR擴(kuò)增，樣品出現(xiàn)特異性擴(kuò)增片段為276bp，表明樣品中存在蜂房蜜蜂球菌，同時(shí)陰性對(duì)照無(wú)特異性擴(kuò)增片段，判為陽(yáng)性；3.樣品無(wú)特異性擴(kuò)增片段，表明樣品中無(wú)蜂房蜜蜂球菌，陰性對(duì)照無(wú)特異性擴(kuò)增片段，判為陰性。保存條件及有效期-20°〇避光保存，有一效期為8個(gè)月。注意事項(xiàng)1.由于陽(yáng)性樣品中模板濃度相對(duì)較高，檢測(cè)過(guò)程中不得交叉污染。2.反應(yīng)液分裝時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，上機(jī)前檢杳各反應(yīng)管是否蓋緊，以免陽(yáng)性模板泄漏污染儀器。3.試劑盒中各溶液使用前應(yīng)充分融化，混勻冰低速離心。4.融化后的反應(yīng)液置于冰上，并盡量避免反復(fù)凍融。5.退火溫度可根據(jù)所用儀器選擇使用最低限量時(shí)間。PCR反應(yīng)引物及循環(huán)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>AGTCGGTGAGGTAACCTTAGGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGAT歐洲幼蟲(chóng)腐臭病EFB1和EFB3擴(kuò)增序列276bpCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAGAGAGACGCAAGACCGCGAGGTTAA試劑的配制Allmol/LTris-HCl緩沖液(pH8.0):稱取121.1g三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)，溶于800mL水中，攪拌，加入濃鹽酸42mL，冷卻至室溫，用稀鹽酸準(zhǔn)確調(diào)節(jié)pH至8.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。A20.5mol/LEDTA(pH8.0):在800mL水中加入186.lg乙二胺四乙酸二鈉(Na廠EDTA2H20)，用磁力攪拌器劇烈攪拌，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液PH值至8.0(約需20g氫氧化鈉顆粒)，然后加水定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。A3DNA抽提緩沖液lmol/LTris-HCl100mL0.5mol/LEDTA50mL十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)20.Og氯化鈉81.816g聚乙烯吡咯酮-40(PVP-40)20g加水定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。A4CTAB沉淀液CTAB5.0g氯化鈉2.3376g加水溶解定溶至1L，分裝后高壓滅菌備用。A51.2mol/L氯化鈉溶液氯化鈉70.128g加水溶解定溶至1L，分裝后高壓滅菌備用。A6TE緩沖液(Tris-HCl、EDTA緩沖液):lmol/LTris-HCl緩沖液(pH8.0)10mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)2mL加水定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。A750XTAE電泳緩沖液Tris484g冰醋酸114.2mL0.5mol/LEDTA200mL溶于水后，定溶至2L，分裝后高壓滅菌備用。序列表〈110〉吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心0184]〈120〉蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病PCR快速檢測(cè)方法0185]〈160>10186]〈210>10187]〈211>180188]<212>DNA0189]〈213〉Melissococcuspluton0190]〈400>10191]CTTTGAACGCCTTAGAGA0192]〈110>吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心0193]〈120〉蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病PCR快速檢測(cè)方法0194]〈160〉10195]〈210>20196]〈211>180197]〈212>DNA0198]<213>Melissococcuspluton:0199]〈400〉1:0200]CTTTGAACGCCTTAGAGA:0201]〈110〉吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心:0202]〈120〉蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病PCR快速檢測(cè)方法:0203]〈160>1:0204]<210>3:0205]〈211〉18:0206]〈212>DNA:0207]〈213>Melissococcuspluton:0208]〈400>1:0209]TTAACCTCGCGGTCTTGCGTCTCTC權(quán)利要求一種蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病PCR快速檢測(cè)方法，其特征在于a、采用CTAB法或者試劑盒法獲得歐洲幼蟲(chóng)腐臭病DNA；b、歐洲幼蟲(chóng)腐臭病DNA的濃度和純度的測(cè)定取5μLDNA溶液加雙蒸水稀釋至1mL，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)260和A280，使A260與A280比值在1.7～2.0之間；c、引物EFB15’-CTTTGAACGCCTTAGAGA-3’EFB25’-ATCATCTGTCCCACCTTA-3’EFB35’-TTAACCTCGCGGTCTTGCGTCTCTC-3’；d、采用半巢式PCR擴(kuò)增方法，根據(jù)蜂房蜜蜂球菌16SrRNA基因，設(shè)計(jì)引物EFB1和EFB2進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，所得PCR理論擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小為486bp，此步擴(kuò)增結(jié)果可以對(duì)蜂房蜜蜂球菌與其它雜菌進(jìn)行區(qū)分，但卻無(wú)法對(duì)與蜂房蜜蜂球菌親源關(guān)系較近的糞腸球菌進(jìn)行區(qū)分；進(jìn)而再以所得擴(kuò)增產(chǎn)物為模板設(shè)計(jì)第三條引物EFB3，其位置處于EFB1和EFB2引物中間，以EFB1和EFB3為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，理論擴(kuò)增片斷大小為276bp，可以特異性對(duì)與蜂房蜜蜂球菌親源關(guān)系較近的腸球菌進(jìn)行有效區(qū)分；最終通過(guò)半巢式PCR擴(kuò)增方法對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)及蜂產(chǎn)品中的蜂房蜜蜂球菌進(jìn)行特異性檢測(cè)。2.蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于其成份如下<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>全文摘要一種蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病PCR快速檢測(cè)方法，屬于生物領(lǐng)域。本發(fā)明目的是建立PCR檢測(cè)方法，為蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病診斷、防治、檢疫以及蜂產(chǎn)品病原污染檢測(cè)提供快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的蜜蜂歐洲幼蟲(chóng)腐臭病PCR快速檢測(cè)方法。本發(fā)明具有快速、敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于快速診斷歐洲蜂幼蟲(chóng)腐臭，尤其對(duì)多種病原引起的混合感染的鑒別診斷更為有效。本標(biāo)準(zhǔn)的建立的PCR檢測(cè)方法，為我國(guó)歐洲蜂幼蟲(chóng)腐臭診斷、防治、檢疫以及蜂產(chǎn)品病原污染檢測(cè)提供快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，以期達(dá)到有效控制蜜蜂疾病，提高蜂產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101792799SQ201010030840公開(kāi)日2010年8月4日申請(qǐng)日期2010年1月15日優(yōu)先權(quán)日2010年1月15日發(fā)明者劉金華,孟慶峰,宋戰(zhàn)昀,王振國(guó),石建平,羅雁非,肖成蕊,蔡陽(yáng)申請(qǐng)人:吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心