專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于操縱蜜蜂行為和生理學(xué)的穩(wěn)定的合成幼蜂信息素的制作方法用于操縱蜜蜂行為和生理學(xué)的穩(wěn)定的合成幼蜂信息素發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及穩(wěn)定的蜜蜂信息素和穩(wěn)定蜜蜂幼蜂信息素的方法，由此能夠產(chǎn)生和持續(xù)應(yīng)用基于信息素的商品。穩(wěn)定的信息素可以用于操縱工蜂行為并且改善其性能，導(dǎo)致蜂房的火力總體增加。受到應(yīng)用于惰性物質(zhì)的穩(wěn)定信息素影響的具體行為包括首次覓食的年齡，為覓食者的職蟲(chóng)的比例，花粉對(duì)花蜜覓食者的定額，各蜜蜂的花粉荷載，目標(biāo)作物的傳粉效率，增補(bǔ)食品成分和抗生素的消耗，職蟲(chóng)的飼養(yǎng)和蜂群的習(xí)性。穩(wěn)定的信息素還可以用于影響咽下食物腺體的發(fā)育和該腺體產(chǎn)生蛋白質(zhì)。穩(wěn)定的覓食信息素還可以與蜜蜂王后下頜腺信息素聯(lián)用，特別是影響目標(biāo)作物植物的傳粉。
背景技術(shù)：
：Pankiw等(1998)測(cè)試并且驗(yàn)證了蜜蜂幼蟲(chóng)產(chǎn)生刺激覓食的信息素的推定(Filmer1932:Free1967)，他們發(fā)現(xiàn)在使用2，000個(gè)蜜蜂幼蟲(chóng)的己烷提取物提供具有l(wèi)，OOO個(gè)幼蟲(chóng)的蜂群體時(shí)，花粉覓食者的數(shù)量增加了2.5倍。在不使用幼蟲(chóng)的蜂群體中，提取物取代了幼蟲(chóng)作為信息素來(lái)源。Pankiw和Page(2001)以及Page和Pankiw(2002)測(cè)試了包括如下百分比的脂肪酸酯類(lèi)的合成信息素?fù)胶衔?LeConte等，1990):亞油酸乙酯1%，亞麻酸乙酯13%，油酸乙酯8%，棕櫚酸乙酯3%，硬脂酸乙酯7%，亞油酸甲酯2%,亞麻酸曱酯21%,油酸曱酯25°/。，棕櫚酸甲酯3%和硬脂酸甲酯17°/。。該摻合物減少了工蜂中對(duì)蔗糖的感覺(jué)神經(jīng)反應(yīng)閾值。具有低蔗糖反應(yīng)閾值的工蜂最可能覓食花粉，而具有高反應(yīng)閾值的那些最可能覓食花蜜(Pankiw和Page2000;Pankiw2003;Pankiw等，2004a)。在置于蜂群體中心1小時(shí)內(nèi)，幼蟲(chóng)提取物或合成幼蜂信息素?fù)胶衔锸剐尤使麍@中蜂群體花粉與非花粉覓食者之比增加。Pankiw和Page(2001)提示"幼蜂信息素調(diào)節(jié)前覓食者中的反應(yīng)閾值，使它們對(duì)花粉覓食者敏感并且釋放覓食花粉行為，，。Pankiw等(2004b)揭示出每日達(dá)到2，000幼蟲(chóng)當(dāng)量(1.12mg)的合成幼蜂信息素的蜜蜂蜂群體，持續(xù)28天。除增加花粉覓食者外，幼蜂信息素還顯著增加返回到蜂房中的花粉荷載的重量。信息素-處理的蜂群體中飼養(yǎng)了明顯更多的幼蜂且從該幼蜂中出現(xiàn)的成年蜜蜂增加。在2，000個(gè)幼蟲(chóng)當(dāng)量的生物現(xiàn)實(shí)劑量下，幼蜂信息素補(bǔ)充了工蜂以便在早于對(duì)照蜂群的年齡下成為莧食者(Pankiw等，2004a);在6,200個(gè)幼蟲(chóng)等量劑量下，幼蜂信息素延緩了職蟲(chóng)成為覓食者的補(bǔ)充(LeConte等，2000)。盡管接觸幼蜂信息素一般降低了首次覓食的年齡，但是在在其咽下腺體中具有極高蛋白質(zhì)含量的專(zhuān)門(mén)組工蜂中延緩了覓食的開(kāi)始(Pankiw等，2004a)。這種高蛋白質(zhì)水平表示與對(duì)照蜂群體相比幼蜂飼養(yǎng)行為的可能性和相應(yīng)對(duì)幼蟲(chóng)飼喂幼蟲(chóng)的較高蛋白質(zhì)質(zhì)量增加。Pankiw(2004b)發(fā)現(xiàn)在接觸2，000個(gè)幼蟲(chóng)當(dāng)量的合成幼蜂信息素1小時(shí)內(nèi)花粉覓食者蔚非花粉覓食者之比增加。來(lái)自信息素-處理的風(fēng)蜂群體的覓食者恢復(fù)的花粉荷載重于來(lái)自對(duì)照風(fēng)插盤(pán)的覓食者，并且這種花粉43%以上可能來(lái)源于這些蜂群體置于其中確保傳粉的目標(biāo)作物?？梢蕴皆L和傳粉的花多于花粉覓食者的花蜜覓食者在其體上具有多于來(lái)自未處理的對(duì)照風(fēng)蜂群體的花蜜覓食者的花粉粒。這些非花粉覓食者具有的花粉可能有54%以上來(lái)源于非來(lái)自對(duì)照蜂群體的花蜜覓食者具有的花粉的目標(biāo)作物。通過(guò)增加花粉覓食者和非花粉覓食者的活動(dòng)，幼蜂信息素具有顯著增加用于對(duì)目標(biāo)作傳粉的蜂群體有效性的潛能。養(yǎng)蜂人通常在冬季或春季早期提供蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑以便促進(jìn)蜂群體生長(zhǎng)(Herbert1992)。通常將抗生素與蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑作為對(duì)細(xì)菌性疾病的預(yù)防劑。因?yàn)楫a(chǎn)生信息素的幼蟲(chóng)在冬季晚期和春季早期不存在或水平最低，在蜂群體中施用幼蜂信息素抗御刺激蛋白質(zhì)和抗生素食物補(bǔ)充劑的消耗以及咽下腺體發(fā)育和蛋白質(zhì)生物合成。Page和Pankiw(2002)教導(dǎo)了"合成幼蜂信息素易于氧化并且必須儲(chǔ)存在低氧條件下，優(yōu)選在-20"C下并且最優(yōu)選在-70。C下，條件是將其儲(chǔ)存任意長(zhǎng)的時(shí)間期限"。甚至冷凍也不可能穩(wěn)定信息素。例如，蜜蜂幼蟲(chóng)的粗提取物在實(shí)驗(yàn)室冷藏箱內(nèi)僅3個(gè)月后就失去了所有的信息素活性(T.Pankiw，TexasA&MUniversity,未公布的觀察結(jié)果)。因此，盡管是在冷凍條件下，但是摻入天然或合成信息素的任何商品幾乎不具有貯存期限。由于認(rèn)為合成信息素存在不穩(wěn)定性，所以研究人員通常每天提供其通常在玻璃平板上使用新鮮信息素的實(shí)驗(yàn)蜜蜂(Pankiw等，1998;Pankiw和Page2001;Page和PanHw2002;Pankiw和Rubink2002;Pankiw等，2004b)。在操作應(yīng)用中，每日施用信息素不切實(shí)際和昂貴并且不會(huì)消除對(duì)儲(chǔ)存過(guò)程中冷凍的需求。發(fā)明概述本發(fā)明涉及穩(wěn)定蜜蜂幼蜂信息素的方法，所述的幼蜂信息素由由成分組成兩種或更多種長(zhǎng)鏈羧酸，例如C16-C2G長(zhǎng)度的羧酸或其曱酯類(lèi)或乙酯類(lèi)，特別是長(zhǎng)鏈羧酸或其甲酯類(lèi)或乙酯類(lèi)，特別是亞油酸乙酯，亞麻酸乙酯，油酸乙酯，棕櫚酸乙酯，硬脂酸乙酯，亞油酸曱酯，亞麻酸甲酯，油酸曱酯，棕櫚酸甲酯和硬脂酸曱酯中的兩種或更多種，該方法通過(guò)將抗氧化劑摻入信息素來(lái)進(jìn)行。所述的抗氧化劑可以為食品級(jí)抗氧化劑。特別地，所述的食品級(jí)抗氧化劑可以選自(但不限于)丁羥茴醚，丁羥甲苯，叔丁基氫醌，聚丙二醇，檸檬酸和維生素E及其衍生物(生育酚類(lèi))或所述抗氧化劑中兩種或更多種的任意組合。在該方法中，所述的抗氧化劑通過(guò)抑制亞油酸甲酯，亞麻酸曱酯，亞油酸乙酯，亞麻酸乙酯，油酸甲酯和油酸乙酯分解起作用。本發(fā)明在另一個(gè)方面中涉及用于對(duì)蜜蜂或蜜蜂群體施用的組合物，它由亞油酸乙酯，亞麻酸乙酯，油酸乙酯，棕櫚酸乙酯，硬脂酸乙酯，亞油酸甲酯，亞麻酸曱酯，油酸曱酯，棕櫚酸曱酯，硬脂酸甲酯中的兩種或更多種和選自(但不限于)丁羥茴醚，丁羥甲苯，叔丁基氫醌，聚丙二醇，檸檬酸和維生素E及其衍生物(生育酚類(lèi))的一種或6多種食品級(jí)抗氧化劑組成。組合物中成分的重量比可以為亞油酸乙酯(O.1-50%)，亞麻酸乙酯(1.3-50%),油酸乙酯(0.8-50%)，棕櫚酸乙酯(O.3-50%)，硬脂酸乙酯(0.7-50%),亞油酸甲酯(0.2-50%),亞麻酸甲酯(0.2-50%)，油酸曱酯(0.3-50%)，棕櫚酸曱酯(0.3-50%)，硬脂酸甲酯(1.7-50%)和抗氧化劑(0.001-50%)。可以將如所述的組合物對(duì)蜜蜂，蜜蜂群體或惰性物質(zhì)中的傳粉單元施用，所述的惰性物質(zhì)選自石蠟，植物蠟，蜂蠟，二氧化硅，氧化鋁，纖維素，改性纖維素(紙和紙制品)，干燥的植物組織，木材或合成聚合物。所述的方法和組合物可以用于增加工蜂之間花粉與非花粉覓食者之比，或用于降低或延緩工蜂首次覓食的年齡，或可以用于增加返回到覓食花粉的工蜂群體中的花粉荷載重量，或用于增加非覓食花粉工蜂體攜帶的花粉粒數(shù)量，或用于增加接近放置蜜蜂群體或傳粉單元或其內(nèi)的目標(biāo)作物的傳粉，或用于刺激工蜂幼蜂食物咽下腺發(fā)育和腺體蛋白質(zhì)產(chǎn)生，或用于刺激蜜蜂消耗食物蛋白或其它食物成分和抗生素^卜充劑。在該方法中，將所述的組合物連續(xù)施用于蜜蜂群體約2周或2周以上期限可以用于增加所述蜂群體內(nèi)飼養(yǎng)的蜜蜂數(shù)量或用于抑制蜜蜂從蜂群體中逃逸(分蜂)。在該方法中，可以將所述的組合物與施用于蜜蜂，蜜蜂群體或傳粉單元或需要增強(qiáng)傳粉的開(kāi)花植物的合成蜜蜂王后下頜腺信息素一起施用于蜜蜂，蜜蜂群體或傳粉單元。附圖圖1例證了與在20'C下接觸2周后的額外相同未穩(wěn)定制品相比，在室溫(約20°C)下接觸空氣后0時(shí)和2周時(shí)使用抗氧化劑穩(wěn)定劑配制的油酸甲酯(1)，亞油酸甲酯(2)和亞麻酸曱酯(3)摻合物的氣相色譜描記圖。圖2例證了與在20C下接觸2周后的額外相同未穩(wěn)定制品相比，在室溫(約2ox:)下接觸空氣后0時(shí)和2周時(shí)使用抗氧化劑穩(wěn)定劑叔丁基氫醌配制的油酸乙酯(1)，亞油酸乙酯(2)和亞麻酸乙酯(3)摻合物的氣相色鐠描記圖。圖3例證了與在2ox:下接觸20周后的額外相同未穩(wěn)定制品相比，在室溫(約20。C)下接觸空氣后20周后使用抗氧化劑穩(wěn)定劑叔丁基氫醌配制的油酸乙酯(1)，亞油酸乙酯(2)和亞麻酸乙S旨(3)摻合物的氣相色鐠描記圖。圖4例證了與在20X:下接觸72周后的額外相同未穩(wěn)定制品相比，在室溫(約20C)下接觸空氣后72周后使用抗氧化劑穩(wěn)定劑叔丁基氫醌配制的油酸乙酯(l),亞油酸乙酯(2)，亞麻酸乙酯(3)，棕櫚酸乙酯(4)和硬脂酸乙酯(5)摻合物的氣相色譜描記圖。發(fā)明詳述蜜蜂覓食信息素易于氧化并且在室溫下不穩(wěn)定，快速失活并且如果將其長(zhǎng)期儲(chǔ)存，那么必須保存在低氧條件下且優(yōu)選保存在極低溫度，例如-70X:下。在正常條件下，任何基于信息素的產(chǎn)品幾乎均沒(méi)有貯存期限并且缺乏商業(yè)活力。因此，處在研究中使用信息素外，信息素?zé)o法在商業(yè)上應(yīng)用。我們發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)將抗氧化劑，特別是食品級(jí)抗氧化劑摻入信息素將蜜蜂幼蜂信息素穩(wěn)定較長(zhǎng)時(shí)間期限?？梢詫⒎€(wěn)定的幼蜂信息素制品遞送至惰性物質(zhì)上的蜂房。如果單獨(dú)使用或與蜜蜂王后下頜腺信息素一起使用，那么幼蜂信息素可以改善工蜂的性能并且增強(qiáng)蜂房的總體活力。本發(fā)明在一般意義上涉及使用一種或多種可接受的抗氧化劑，尤其是一種或多種食品級(jí)抗氧化劑，包括(但不限于)丁羥茴醚，丁羥甲苯，叔丁基氫醌，聚丙二醇，檸檬酸和維生素E及其衍生物穩(wěn)定蜜蜂幼蜂信息素的方法?？梢砸赃B續(xù)方式將包括抗氧化劑的IO種成分信息素制品遞送至惰性物質(zhì)上的蜂房。通過(guò)使用抗氧化劑穩(wěn)定劑叔丁基氫醌，我們發(fā)現(xiàn)明顯不穩(wěn)定的信息素成分，特別是亞油酸曱酯，亞麻酸甲酯，亞油酸乙酯和亞麻酸乙酯，而且包括油酸甲酯和油酸乙酯保持72個(gè)月完整。我們還發(fā)現(xiàn)使用叔丁基氫醌穩(wěn)定的制品保持了231天的生物活性，而未穩(wěn)定的制刑在123天后幾乎失去了所有生物活性。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的幼蜂信息素增加工蜂中的覓食花粉并且刺激花粉食物消耗。最后，我們發(fā)現(xiàn)使用工業(yè)級(jí)成分的穩(wěn)定的幼蜂信息素制劑與試劑級(jí)制品具有相同的生物作用，其中該組合物與使用試劑級(jí)成分獲得的天然組合物稍有不同。這類(lèi)耐久性和堅(jiān)固性能夠研發(fā)和持續(xù)利用基于使用食品級(jí)抗氧化劑穩(wěn)定的幼蜂信息素的商品。本發(fā)明還涉及組合物，其中將由棕櫚酸曱酯，棕櫚酸乙酯，硬脂酸甲酯，硬脂酸乙酯，油酸甲酯，油酸乙酯，亞油酸甲酯，亞油酸乙酯，亞麻酸甲酯和亞麻酸乙酯中的兩種或更多種組成的IO種信息素成分以有效量與食品級(jí)抗氧化劑，包括(但不限于)丁羥茴醚，丁羥甲苯，叔丁基氫醌，聚丙二醇，檸檬酸和維生素E及其衍生物一起配制。可以將這些組合物遞送至惰性物質(zhì)上的蜜蜂蜂房?jī)?nèi)的蜜蜂，所述的惰性物質(zhì)包括(但不限于)石蠟，植物蠟，蜂蠟，二氧化硅，氧化鋁，纖維素，改性纖維素(紙和紙制品)，干燥的植物組織，木材或合成聚合物。這些組合物可以用于操縱工蜂的行為，包括(但不限于)增加花粉與非花粉覓食者之比，降低首次覓食的年齡，誘導(dǎo)覓食行為，刺激花粉釆集和將花粉轉(zhuǎn)運(yùn)回蜂房，刺激補(bǔ)充食物成分和抗生素消耗，抑制分蜂和改善目標(biāo)作物傳粉。穩(wěn)定的信息素組合物還可以用于刺激咽下食物腺體發(fā)育和產(chǎn)生蛋白質(zhì)。穩(wěn)定的幼蜂信息素組合物與蜜蜂往后下頜腺信息素聯(lián)合應(yīng)用可以用于改善蜂房?jī)?nèi)的條件并且增強(qiáng)目標(biāo)作物的傳粉。實(shí)施例1制品由于污染蜂蜜的可能性，所以?xún)H將食品級(jí)抗氧化劑視為可能的穩(wěn)定劑。使用叔丁基氫醌作為測(cè)試穩(wěn)定劑配制如下比例(重量/重量百分比)和如下用量的幼蜂信息素棕櫚酸甲酯3%(0.0225g)，棕櫚酸乙酯3%(0.0225g)，硬脂酸甲酯17%(0.1275g),油酸曱酯924.95%(0.1871g)，硬脂酸乙酯7%(0.0525g)，油酸乙酯8%(0.0600g)，亞油酸曱酯2%(0.0150g)，亞油酸乙酯1%(0.0075g),亞麻酸甲酯21%(0.1575g),亞麻酸乙酯13°/。(0.0975g)和叔丁基氫醌0.05%(0.0004g)。在約20。C下以上述次序使用磁攪拌器混合成分并且摻合至均勻，產(chǎn)生O.75g產(chǎn)品。實(shí)施例2化學(xué)穩(wěn)定性進(jìn)行短期和長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究，其中按照與實(shí)施例l近似相同比例混合可能不穩(wěn)定的幼蜂信息素成分的簡(jiǎn)化摻合物。對(duì)油酸曱酯，亞油酸甲酯和亞麻酸曱酯和油酸乙酯，亞油酸乙酯和亞麻酸乙酯的摻合物進(jìn)行2周期限的短期評(píng)價(jià)，它們各自包含和不包含叔丁基氫醌。照2周實(shí)驗(yàn)所述，使用相同的摻合物進(jìn)行20周測(cè)試，但72-周測(cè)試向其相應(yīng)摻合物中添加了適當(dāng)比例的棕櫚酸曱酯和棕櫚酸乙酯和硬脂酸甲酯和硬脂酸乙酯。將約250mg摻合物放入安裝了具有1mm直徑孔的擴(kuò)散插入螺旋帽(AgilentTechnologies)的4mL(15x45mm)塑料瓶(ChromatographicSpecialties)中，以使空氣在樣品上循環(huán)。將所有摻合物連續(xù)保存在30X:的恒溫下。為了通過(guò)毛細(xì)管氣相色i普法進(jìn)行分析，將約lmg摻合物溶于lmL乙醚并且分析1pL每種提取物的等分部分。在0時(shí)并且在30'C下接觸空氣指定期限后，使用安裝了火焰離子化檢測(cè)器和30m長(zhǎng)BPX-70毛細(xì)管柱(J&WScientific)的HewlettPackardHP5890氣相色鐠儀進(jìn)行分析。注射器和檢測(cè)器溫度分別為260。C和285°C。溫度程序?yàn)橐?。C/分鐘從80。C24分鐘升至200。C且然后以20。C/分鐘3分鐘升至260°C。對(duì)甲酯類(lèi)和乙酯類(lèi)給出2周結(jié)果(圖1和2)，而僅對(duì)乙酯類(lèi)給出長(zhǎng)期20-周和72-周結(jié)果(圖3和4)。對(duì)甲酯類(lèi)的長(zhǎng)期結(jié)果實(shí)際上與乙酯類(lèi)的那些結(jié)果相同。2周后，使用叔丁基氫醌穩(wěn)定的摻合物中的甲酯類(lèi)的比例組成與在0時(shí)未穩(wěn)定的摻合物中相同(圖1)。然而，在未穩(wěn)定的摻合物中，210周后，亞油酸曱酯的量下降了85°/。并且亞麻酸甲酯的量減少了90%。由于其它成分分解，所以油酸甲酯的比例組成從占總摻合物的48%升至82%。使用乙酯類(lèi)在2周后獲得了類(lèi)似的結(jié)果。亞油酸乙酯的量下降了74%，并且亞麻酸乙酯的量減少了94%，而油酸乙酯從占總摻合物的40%升至66%(圖2)。這些結(jié)果表明亞油酸甲酯和亞油酸乙酯和亞麻酸甲酯和亞麻酸乙酯在室溫下快速分解并且在2-4周后可能導(dǎo)致整個(gè)信息素?fù)胶衔锏纳锘钚酝耆笔?。結(jié)果還表明如不進(jìn)行穩(wěn)定，那么任何幼蜂信息素產(chǎn)品的貯存期限均可能是不可接受的短暫。在20。C下20和72周后，在穩(wěn)定的摻合物中油酸乙酯，亞油酸乙酯和亞麻酸乙酯的比例組成(分別為圖3和4)基本上保持與2周接觸后穩(wěn)定的摻合物相同(圖2)。相反，在20周后，盡管完全不存在其它兩種主要成分，但是在未穩(wěn)定的摻合物中無(wú)亞油酸乙酯和亞麻酸乙酯保留，且油酸乙酯的量?jī)H從占總摻合物的37%適度升至43%(圖3)。這表明亞油酸乙酯和亞麻酸乙酯在20周接觸后完全分解并且還提示油酸乙酯部分分解。正如根據(jù)圖3中的結(jié)果預(yù)計(jì)的，在接觸室溫72周后無(wú)亞油酸乙酯或亞麻酸乙酯保留，表明這兩種信息素成分完全分解(圖4)。棕櫚酸乙酯和硬脂酸乙酯的百分比組成分別從8%和23%升至20%和57°/。，提示72周后無(wú)分解。然而，油酸乙酯的百分比從24%下降至10°/。。這種下降與20周后的結(jié)果共同證實(shí)油酸乙酯在未穩(wěn)定的制品中緩慢分解。這些結(jié)果表明使用叔丁基氫醌穩(wěn)定幼蜂信息素在1年以上未導(dǎo)致任何不穩(wěn)定的信息素成分分解。即使在72周后也缺乏分解的輕度指示(圖4)提示穩(wěn)定的信息素制品的貯存期限至少為2年。這是證明商品研發(fā)的足夠長(zhǎng)的期限。實(shí)施例3通過(guò)蔗糖反應(yīng)閾值測(cè)定的穩(wěn)定的幼蜂信息素的壽命在將1滴蔗糖溶液施用于觸角時(shí)蜜蜂通過(guò)伸展吻突作出反射性反應(yīng)。這稱(chēng)作對(duì)蔗糖的吻突伸展反應(yīng)閾值(PER-RT)測(cè)定法。該測(cè)定法由0.1，0.3，1,3，IO和30。/。(wt/vol)的蔗糖濃度系列組成，相當(dāng)于-l，-0.5，0,0.5，l和l.5的對(duì)數(shù)系列。使每只蜜蜂的觸角于1滴蔗糖接觸一次。將導(dǎo)致吻突伸展的最低濃度解釋為各蔗糖反應(yīng)閾值的估計(jì)值(Page等，1998;Pankiw和Page1999)。將來(lái)自使用遞增濃度蔗糖的PER測(cè)定的結(jié)果轉(zhuǎn)化成蔗糖得分。PER得分與各蜜蜂的反應(yīng)閾值直接相關(guān)，因?yàn)榇蟛糠置鄯湓陂_(kāi)始的反應(yīng)后持續(xù)對(duì)所有增加濃度的蔗糖起反應(yīng)。PER得分為6(其中每只蜜蜂在PER測(cè)定中從0，1°/。蔗糖開(kāi)始對(duì)所有6種蔗糖濃度起反應(yīng))代表反應(yīng)閾值低于得分為1(其中每只蜜蜂僅對(duì)30°/。蔗糖起反應(yīng))300倍。每只蜜蜂的反應(yīng)閾值(RT)為進(jìn)入與莧食行為(Pankiw和Page2000)和年齡(Pankiw和Page1999;Pankiw2003)相關(guān)的感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)的"窗口"并且受到幼蜂信息素調(diào)節(jié)(Pankiw和Page2001，2003)。我們使用針對(duì)蔗糖的PER-RT測(cè)定法作為評(píng)價(jià)在室溫下儲(chǔ)存不同期限的穩(wěn)定幼蜂信息素的生物活性的一種方法。來(lái)自至少6個(gè)不相關(guān)的"野生型"來(lái)源的蜜蜂在維持在33'C和55%RH下的孵育箱內(nèi)從其幼蜂中形成3h。將300只新形成的蜜蜂隨機(jī)放入有機(jī)玻璃金屬絲網(wǎng)籠(14.6x10x7.7cm)。給籠子提供30%蔗糖溶液，可隨意飲水并且在上述孵育箱條件下伺養(yǎng)。隨機(jī)選擇各個(gè)籠子用于下列處理1)在室溫下儲(chǔ)存的未穩(wěn)定的幼蜂信息素，2)使用叔丁基氫醌穩(wěn)定并且儲(chǔ)存在室溫下的幼蜂信息素，3)新鮮制備的未穩(wěn)定的幼蜂信息素和4)不使用信息素的對(duì)照品。制備的信息素的組成為亞油酸乙酯1%，亞麻酸乙酯13%,油酸乙酯8%，棕櫚酸乙酯3%，硬脂酸乙酯7%，亞油酸甲酯，2%，亞麻酸甲酯21°/。，油酸甲酯25%,棕櫚酸甲酯3%和硬脂酸甲酯17%。信息素-處理的籠子接受300個(gè)幼蟲(chóng)當(dāng)量(LEq)/天(1:1的幼蜂信息素與蜜蜂之比)。用異丙醇配制信息素，使得以約15^L溶液遞送300LEq。對(duì)照籠子每日接受等體積的異丙醇。每日在蒸發(fā)異丙醇后在玻璃平板(7x8cm)上遞送相應(yīng)的處理。將蜜蜂如上述銅養(yǎng)6天且然后如上所述測(cè)試其蔗糖反應(yīng)闊值。在制備未穩(wěn)定和穩(wěn)定的幼蜂信息素制品后48，123和231天時(shí)實(shí)施該方案。在處理之間，4吏用Kruskal-Wal1is和Mann—WhitneyU檢驗(yàn)比較得分。穩(wěn)定的幼蜂信息素表現(xiàn)出與新鮮配制的幼蜂信息素?zé)o差別的生物活性(表1)。接觸穩(wěn)定幼蜂信息素的蜜蜂始終表現(xiàn)出高于對(duì)照籠子中未接觸蜜蜂至少1.75倍的蔗糖反應(yīng)閾值。另外，接觸未穩(wěn)定幼蜂信息素的在室溫下儲(chǔ)存48，123和231天的蜜蜂的蔗糖反應(yīng)性與未基礎(chǔ)信息素的蜜蜂的蔗糖反應(yīng)性無(wú)顯著性差異。這些結(jié)果表明穩(wěn)定的幼蜂信息素在室溫下儲(chǔ)存時(shí)表現(xiàn)出長(zhǎng)期生物活性。這種生物活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上與使用新鮮配制的幼蜂信息素誘導(dǎo)的生物活性相同。這些結(jié)果還表明向IO種信息素成分中添加叔丁基氫醌對(duì)信息素的生物活性無(wú)影響。表1.儲(chǔ)存在室溫下的未穩(wěn)定和穩(wěn)定的幼蜂信息素與新鮮配制的幼蜂信息素作為保持在無(wú)信息素對(duì)照環(huán)境中的蜜蜂的蔗糖反應(yīng)性百分比的生物活性。低于各值的概率表示蔗糖反應(yīng)性與無(wú)信息素的對(duì)照環(huán)境中蜜蜂的蔗糖反應(yīng)性類(lèi)似。在室溫下的天未穩(wěn)定的幼蜂穩(wěn)定的幼蜂信新鮮配制的未穩(wěn)數(shù)信息素％息素％定的幼蜂信息素4817.088.178.7(p>0.05)(p<0.01)(p<0.001)1236.875.668.5(p>0,05)(p<0.001)(p<0,001)2313.789.791.0(p>0.05)(p<0.0001)(p<0.0001)實(shí)施例4由試劑級(jí)和工業(yè)級(jí)脂肪酸酯類(lèi)配制的幼蜂信息素釋放蜜蜂花粉覓食所有在先的幼蜂信息素制品均由大于99%純度的由Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)提供的試劑級(jí)化合物組成。試劑級(jí)化合物最常用作化學(xué)鑒定中，用于化學(xué)合成或任意其它純度必不可少的應(yīng)用中的標(biāo)準(zhǔn)品。然而，純度的量與化合物的成本成正比。降低幼蜂13信息素的成本的一種方式在于使用較低純度工業(yè)級(jí)成分配制它。盡管使用工業(yè)級(jí)成分使得成本顯著下降，但是需要權(quán)衡。工業(yè)級(jí)成分衍生自含脂肪酸摻合物的天然來(lái)源，但它們并非天然幼蜂信息素的確切比例。我們推斷接觸由試劑級(jí)或工業(yè)級(jí)成分配制的幼蜂信息素的蜜蜂對(duì)花粉的覓食水平高于不接觸信息素的蜜蜂。本實(shí)驗(yàn)在2005年6月7日重復(fù)6次。隨機(jī)選擇典型蜜蜂蜂群體接受如下處理之一1)對(duì)照組，空白玻璃平板，2)使用叔丁基氫醌穩(wěn)定的試劑級(jí)幼蜂信息素，或3)類(lèi)似穩(wěn)定的工業(yè)級(jí)幼蜂信息素。使用叔丁基氫醌按照表2中指定的比例配制信息素?fù)胶衔?。將總?jì)1.I2mg總酯類(lèi)施用于玻璃平板(20cmx10cm)并且將平板放入蜂群體的幼蜂群體區(qū)域中心。1小時(shí)后，我們進(jìn)行5分鐘返回花粉和非花粉覓食者的進(jìn)入計(jì)數(shù)?？捎^察到花粉覓食者非常明顯，因?yàn)樵诜Q(chēng)作冬孢的后足專(zhuān)門(mén)區(qū)域上的體外攜帶有花粉。在作物中內(nèi)部攜帶有液體載荷，諸如花蜜和水，但未明顯觀察到。當(dāng)載荷的類(lèi)型，存在或不存在未明顯觀察到時(shí)，將這類(lèi)返回的蜜蜂歸類(lèi)為非花粉覓食者。觀察者使用手提式計(jì)數(shù)器，一只手用于花粉覓食者，而一只手用于非花粉覓食者。每小時(shí)由兩個(gè)不同的人對(duì)每一蜂群體測(cè)定兩次，共2小時(shí)，每個(gè)蜂群體總計(jì)45分鐘計(jì)數(shù)。進(jìn)行計(jì)數(shù)的人對(duì)處理方式并不了解。使用列聯(lián)表分析分析計(jì)數(shù)的數(shù)據(jù)。與不使用信息素的空白對(duì)照相比，工業(yè)級(jí)(義2=7.0，df-l，P<0.01)和試劑級(jí)(5C2=15.0，df-l，P<0.Q001)制品顯著誘導(dǎo)進(jìn)入蜂群體的較高的花粉與非花粉覓食者之比(表3)。試劑級(jí)制品釋放的花粉覓食者比例稍高于工業(yè)級(jí)制品(x2=3.9,df=1，P=0.048)。兩個(gè)相關(guān)發(fā)現(xiàn)來(lái)源于本研究。第一，兩個(gè)等級(jí)的穩(wěn)定的幼蜂信息素均能夠誘導(dǎo)覓食花粉增強(qiáng)。第二，工業(yè)級(jí)配制的幼蜂信息素增加的花粉覓食者比例超過(guò)了不使用信息素的對(duì)照處理約116°/。，僅低于由試劑級(jí)制品誘導(dǎo)的3.5%。因此，以?xún)H7%的試劑級(jí)制品的成本，工業(yè)級(jí)配制的使用叔丁基氫醌穩(wěn)定的幼蜂信息素看起來(lái)為有效和經(jīng)濟(jì)的富有活力產(chǎn)品。表2.試劑級(jí)和工業(yè)級(jí)幼蜂信息素制品<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>3.5分鐘內(nèi)進(jìn)入蜂群體的花粉與非花粉覓食者之比<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>1列聯(lián)表分析概率，其中檢驗(yàn)假設(shè)在于對(duì)照組與處理組之比相等。實(shí)施例5花粉食物消耗的剌激本實(shí)驗(yàn)從2004年3月1日到15日進(jìn)行。隨機(jī)選擇來(lái)自TexasA&MUniversity養(yǎng)蜂廠的12個(gè)典型蜂群體。通過(guò)使用分成正方形部分6.45cm2的格估計(jì)蜂群體測(cè)量值。將蜜蜂覆蓋的面積轉(zhuǎn)化成蜜蜂數(shù)量；約1.5只蜜蜂/cm2(Pankiw和Page2001;Pankiw和Rubink2002)。測(cè)定稱(chēng)作共同幼蜂的卵，幼蟲(chóng)和蛹占據(jù)的幼蜂面積。隨機(jī)選擇6個(gè)蜂群體每日接受3個(gè)幼蟲(chóng)當(dāng)量/蜜蜂/天(1.55pg/蜜蜂/天)的幼蜂信息素處理并且6個(gè)蜂群體接受空白玻璃平板。已知3個(gè)幼蟲(chóng)當(dāng)量/蜜蜂/天的劑量可增加大蜂群體中覓食花粉的量(Pankiw和Page2001)。給每個(gè)蜂群體供應(yīng)商購(gòu)花粉食物補(bǔ)充劑形狀如兩片刻痕蠟紙之間漢堡包樣小餡餅的450g幼蜂Builder(Dadant&Sons,Hamilton,IL)。將新鮮的小餡餅放置在上述消耗的餡餅上。對(duì)15天蜂群體而言每隔3天檢查一次小餡餅的消耗。給完全消耗上述小餡餅的蜂群體提供新的小餡餅。在7和15天時(shí)進(jìn)行蜂群體測(cè)定。所有蜂群體均接受新鮮花粉補(bǔ)充劑小餡餅，與第7天時(shí)所用的量無(wú)關(guān)。除去未消耗的舊小餡餅并且稱(chēng)重以便估計(jì)消耗量。方差分析用于比較信息素處理的和對(duì)照蜂群體。不必進(jìn)行協(xié)方差分析，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)蜜蜂的數(shù)量和幼蜂，花粉，蜂蜜和空單元格所用的幼蜂空間的量在處理組之間無(wú)顯著性差異(P〉0.0"。在第l和第2周中使用幼蜂信息素處理的蜂群體消耗的花粉補(bǔ)充劑明顯多于對(duì)照蜂群體(表4)。在第1周中處理之間的幼蜂面積無(wú)差異化,=0.3,P>0.05)。在第2周中，在幼蜂信息素處理組中幼蜂面積明顯較大(F:，u=10.6，P<0.01;表2)。這些結(jié)果表明穩(wěn)定的幼蜂信息素可以用于刺激食物消耗，導(dǎo)致幼蜂產(chǎn)生增加，由此可以導(dǎo)致蜂群體活力更強(qiáng)。還可以通過(guò)將食物補(bǔ)充劑或抗生素?fù)饺牖ǚ坌○W餅或其它食物來(lái)源來(lái)利用增加的食物消耗。16表4.接觸幼蜂信息素的蜜蜂蜂群體與未基礎(chǔ)的對(duì)照蜂群體之間花粉消耗和幼蜂面積的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>參考文獻(xiàn)美國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)Page,R.E.Jr.andT.Pankiw.2002.Syntheticbeepollenforagingpherorao加andusesthereof.U.S.Pal,No.2002/0182977Al.其它公開(kāi)文獻(xiàn)Filmer,ItS.1932.Broodareaandcolonysizeasfactorsinactivityofpollinationunits.J.Econ.Entomol.25:336>343.Free,J.B.1967.Factorsdetermmingthecollectionofpollenbyhoneybeeforagers.Anhn，Behav.15:13"44.HerbertE.W.1992.Honeybeenutrition.Pp.197-233.In:Grah柳，J,M.(ed.).Thehiveandthehoneybee.Rev.Ed.Dadant&Sons,Hamilton,Illi加is.LeConte,Y.,G.Arnold,J.TrouillerandC.M助son.1990.Identificatioaofabroodpheromoneinhoneybees.Naturwissenschaften81:462-465.LeConte,Y.，A.Moh咖mcdiandG,E.RobinsoiL2000.Primereffectsofabroodpheromoneonhoneybeebehaviouraldevelopment.Proc.R.Soc.LondonB268:163-168.Page,RJE.,Jr,,J.ErberandM.K.Fon她.1998,Theeffectofgenotypeonresponsethresholdstosucrose幼dforagingbehaviorofhoneybeesme/i'j^raL.).J.Comp.Physiol.A182:鄉(xiāng)-500,Pankiw，T.2003.Directionalchangeinasuiteofforagingbehaviorsintropicalandtemperateevolvedhoneybees(々&;wW啡raL.).Behav.Ecol.Sociobiol.54:ASSAM.Pankiw,T.2004a.Cuedin:ho加ybeephcromonesasinformationflowandcollectivedecisionmaking.Apidologie35:217-226.Pankiw,T.2004b.Broodpheromoneregulatesforagingactivityofhoneybees(Hymenoptera:Apidae).J.Econ.Entomol.97:748-751.Pankiw,T.andR.E.Page,Jr.1999.Theeffectsofgenotype,age,scx，andcasteonresponsethresholdstosucroseandforagingbehaviorof"eybees(々&weW/waL.).J.Comp.Physiol.A185:207-213.Pankiw,T,andR.E.Page,Jr,2000.Responsethresholdstosucrosepredictforagingdivisionoflaborinhoneybees.Behav.Ecol.Sociobiol.47:265-267.Pankiw，T.幼dR.E.Page,Jr.2001.Broodpheromonemodulatessucroseresponsethresholdinhoneybeeswe肌/eraL.).Behav.Ecol.Sociobiol.49:206-213.Pankiw,T.andR.E.Page,Jr.2003.Effectofpheromones,hormonesandhandlingonsucroseresponsethresholdsofhoneybees(—iy;ne〃(/"eraJ.Comp.Physiol.A188:675-684.Pankiw,T.andW.L.Rubink.2002.Pollenforagingr鄰o加etobroodpheromonebyAftricanizedandEuropeanhoneybees(/(piswe//(/fera>.Ann.Entomol.Soc.AnL95:761-767,Pankiw，T.，R,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