專利名稱：松針紅斑病pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種松針紅斑病PCR檢測(cè)方法，屬于農(nóng)林業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
松針紅斑病也稱松穴褥盤孢菌(Dothistroma)枯針病，是世界流行病害，在中國(guó) 屬重要的森林檢疫病害。其病原菌最初來自美洲。目前松針紅斑病已被當(dāng)成南半球及一些 國(guó)家人工林中最具危害的病害。美國(guó)1964年首次報(bào)道這種真菌導(dǎo)致過早落葉造成其東部 大平原黃松栽植失敗，經(jīng)濟(jì)損失重大。據(jù)報(bào)道該病害在加拿大、新西蘭、智利、英國(guó)、肯尼亞、 坦桑尼亞和烏干達(dá)等45個(gè)國(guó)家使60多個(gè)松樹種、變種和雜交種受害。該病害導(dǎo)致受害樹 木生長(zhǎng)遲緩，發(fā)病嚴(yán)重可致樹木死亡。我國(guó)1980年首次在東北林業(yè)大學(xué)涼水實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)中的樟子松幼苗、人工幼林和天 然林中發(fā)現(xiàn)該病害。被感染的松樹主要有樟子松、紅松、赤松、偃松及紅皮云杉等。據(jù)調(diào)查黑 龍江省大、小興安嶺地區(qū)、內(nèi)蒙古，吉林及云南等地都有過發(fā)生的報(bào)道，嚴(yán)重地區(qū)發(fā)病率達(dá) 100%。松針紅斑病菌的寄主范圍廣、適生范圍大、危害嚴(yán)重、難以根除、易于人為傳播，是危 險(xiǎn)性很大的林業(yè)檢疫有害生物，并且有擴(kuò)散蔓延趨勢(shì)，對(duì)我國(guó)的松樹資源構(gòu)成很大的威脅。該病害的國(guó)內(nèi)外一直采用傳統(tǒng)的形態(tài)與危害癥狀的鑒定，但該病害的發(fā)生由于地 域廣，受環(huán)境因素的影響該病原菌的形態(tài)變化比較大，危害癥狀出現(xiàn)比較慢，造成早期鑒定 困難。核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS是由GOnZalea1990年提出后逐步發(fā)展起來的全新 的分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，ITS區(qū)段既具保守性，又在科、屬、種水平上均有特異性序列，通過對(duì) ITS區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，來診斷和檢測(cè)植物病原菌，尤其是對(duì)植物病原真菌的分子檢測(cè)已越 來越被廣泛應(yīng)用。2003年楊佩文等應(yīng)用真菌核糖體基因ITS區(qū)段通用引物ITSl和ITS4，對(duì) 十字花科蔬菜根腫病菌(Plasmodiophora brassicae) rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序分析和特異 引物的設(shè)計(jì)，獲得根腫菌一特異性分子片段并對(duì)不同寄主植物進(jìn)行了檢測(cè)。張薇等對(duì)分離 自蘇南丘陵地區(qū)的苜蓿菌核病菌株NJl的rDNA，利用ITS區(qū)段通用引物ITS4和ITS5進(jìn)行 PCR，經(jīng)同源性比較，并結(jié)合病原菌致病性測(cè)定和形態(tài)學(xué)特征觀察，將發(fā)病癥狀較相似、形態(tài) 學(xué)上不容易區(qū)分且均能夠侵染豆科植物造成菌核病的S. trifoliorum, S. sclerotiorum和 S. minor 3種病原菌區(qū)分開，，并將其鑒定為三葉草核盤菌(Sclerolinia trifoliorum)。由 于這種方法快速、準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便，已成為研究病原真菌系統(tǒng)進(jìn)化和病害診斷的強(qiáng)有力輔助工 具，也越來越受到植物病理學(xué)家們的重視。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中松針紅斑病生物學(xué)檢測(cè)所需要周期長(zhǎng)，一般需要 30-50天，早期鑒定困難的問題，提供一種松針紅斑病的PCR檢測(cè)方法，對(duì)松針紅斑病進(jìn)行 PCR擴(kuò)增檢測(cè)，該方法用時(shí)短、準(zhǔn)確率高、靈敏性高。上述的目的通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)包括如下步驟取1 μ L松針紅斑病DNA溶液， 加入反應(yīng)液Taq聚合酶lyL、10XPCR Buffer5 μ L、dNTP 4 μ L、上游引物1 μ L、下游引物 1 μ L、無菌去離子水36. 25 μ L進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；然后取8 μ LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在1. 0 %瓊 脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電壓50-100V，30分鐘后在紫外光下檢測(cè)結(jié)果如果存在分子量約為 ISObp的DNA條帶，則證明所檢病原為松針紅斑病病原菌。所述的松針紅斑病PCR檢測(cè)方法，所述的Taq聚合酶的濃度為5U/y L，所述的 10XPCR Buffer 中 Tris-HCL 為 lOOmM，KCL 為 500mM，MgCL2 為 15mM，dNTP 為 2. 5mM，上游 引物為20 μ M，下游引物為20 μ Μ，所述的上游引物序列為5，CGACCTCCAACCCTT 3’，所述的 下游引物序列為5，CGCTGCGTTCTTCAT 3，。所述的松針紅斑病PCR檢測(cè)方法，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ； 94°C變性Imin ；54°C退火Imin ；72°C延伸Imin ；29個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min。本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明設(shè)計(jì)出一對(duì)檢測(cè)松針紅斑病的特異性引物primer ffl/primer W2，利 用特異性引物及PCR過程快速、準(zhǔn)確檢測(cè)松針紅斑病，要求提取發(fā)病組織DNA濃度僅達(dá)到 0. 68fg/y L以上既可檢測(cè)出，檢測(cè)過程只需要簡(jiǎn)便的PCR和瓊脂糖電泳操作，擴(kuò)增產(chǎn)物帶 型清晰，結(jié)果穩(wěn)定，說明primerWl/primerW2引物具有很高的特異性，在實(shí)際應(yīng)用中僅根據(jù) 擴(kuò)增產(chǎn)物的有無便可對(duì)目標(biāo)病害進(jìn)行檢測(cè)，為該病害的早期診斷和防治提供科學(xué)依據(jù)。目 前國(guó)內(nèi)未見有針對(duì)松針紅斑病進(jìn)行PCR方法檢測(cè)與早期診斷的研究報(bào)道。2、松針紅斑病易與松針褐斑病(Lecanosticta acicola)、環(huán)境脅迫危害、根腐病 等引起的危害混淆。目前對(duì)松針紅斑病的鑒定主要還是依據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法，該病原菌 在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，早基癥狀不明顯時(shí)鑒定困難，存在費(fèi)時(shí)、近似種難以區(qū)分等諸多 弊端，不適合快速鑒定的要求。而核糖體DNA(rDNA)的編碼區(qū)序列具有保守性，分析真菌核 糖體基因是進(jìn)行真菌分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育的有效方法。近年來，利用PCR擴(kuò)增病原菌核糖 體ITSGnternal transcribedspacer)基因區(qū)段進(jìn)行種類鑒定、檢測(cè)及病害診斷技術(shù)得到 了快速發(fā)展。由于這種方法快速、準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便，因而，越來越受到植物病理學(xué)家們的重視。本 發(fā)明設(shè)計(jì)而成的一對(duì)特異性引物，首次將PCR技術(shù)用于松針紅斑病的分子檢測(cè)與預(yù)警，成 功擴(kuò)增出預(yù)期的片段。不僅能對(duì)病原菌的純培養(yǎng)物進(jìn)行分類鑒定和病菌監(jiān)測(cè)，而且對(duì)病原 菌所致的真菌病害的病組織檢測(cè)也能達(dá)到很好的效果。這為開展松針紅斑病分子監(jiān)測(cè)與疫 病的快速診斷技術(shù)術(shù)奠定了基礎(chǔ)，對(duì)植物病害的防治具有一定意義。本發(fā)明對(duì)準(zhǔn)確鑒定和 快速檢測(cè)檢疫性松針紅斑病是很重要的突破。


圖1是樟子松紅斑病PCR引物檢測(cè)結(jié)果電泳圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 樟子松紅斑病(Dothistromapini)PCR 檢測(cè)(1)材料取樣取樟子松松針紅斑病針葉，自來水沖洗干凈后剪取發(fā)病部位組織0. 1-0. 2g。(2)提取發(fā)病松針組織總DNA (采用TIANGEN公司的快捷型植物基因組DNA提取試劑盒對(duì)DNA抽提)
加液氮充分研磨帶病斑松針，加入400 μ L緩沖液FPl和6 μ L的foise A(IOmg/ μ L)，旋渦振蕩lmin，室溫放置IOmin ；加130 μ L緩沖液FP2，充分混勻，旋渦振蕩lmin，12，OOOrmp離心5min，將上清轉(zhuǎn)
至新的離心管中；向上清液加入350 μ L異丙醇，12，OOOrmp離心2min，棄上清，保留沉淀；加500μ L70%乙醇，旋渦振蕩k，12，OOOrmp離心2min，棄上清，晾干至無酒精 味；加入40 μ L洗脫緩沖液，65°C水浴IOmin溶解DNA，用于PCR檢測(cè)。(3)松針紅斑病PCR檢測(cè)松針紅斑病的特異性引物上游5，CGACCTCCAACCCTT 3，(primer wl)下游5，CGCTGCGTTCTTCAT 3，(primer w2)反應(yīng)體系反應(yīng)總體積50 μ L 包括Taq 聚合酶(5U/μ L) 1 μ L，10 X PCR Buffer (Tris-HCL 為 IOOmM, KCL 為 500mM, MgCL2 為 15mM)5y L, dNTP (各 2. 5mM) 4 μ L ；上游弓丨物(20 μ Μ) 1 μ L ； 下游引物(20 μ Μ) 1 μ L ；模板DNAl μ L ；補(bǔ)無菌去離子水(ddH20) 36. 25 μ L。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；94°C變性Imin力4°C退火Imin ；72°C延伸 Imin ；29個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min ；PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳檢測(cè)取8 μ LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在1. O %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電 壓50-100V，30分鐘后在紫外光下檢測(cè)結(jié)果如果存在分子量約為ISObp的DNA條帶，則證 明所檢病害為松針紅斑病病原菌，而健康組織無此條帶，如圖1所示。
權(quán)利要求
1.一種松針紅斑病PCR檢測(cè)方法，其特征是該方法包括如下步驟取1 μ L松針紅斑 病DNA溶液，加入反應(yīng)液Taq聚合酶lyL、10XPCR Buffer5 μ L、dNTP 4 μ L、上游弓丨物1 μ L、 下游引物1 μ L、無菌去離子水36. 25 μ L進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；然后取8 μ LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在 1. 0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電壓50-100V，30分鐘后在紫外光下檢測(cè)結(jié)果存在分子量 約為ISObp的DNA條帶，則證明所檢病原為松針紅斑病病原菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的松針紅斑病PCR檢測(cè)方法，其特征是所述的Taq聚合酶 的濃度為 5U/ μ L，所述的 10XPCR Buffer 中 Tris-HCL 為 lOOmM，KCL 為 500mM，MgCL2 為15mM，dNTP為2. 5mM,上游引物為20 μ Μ,下游引物為20 μ Μ,所述的上游引物序列為 5，CGACCTCCAACCCTT 3，，所述的下游引物序列為 5，CGCTGCGTTCTTCAT 3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的松針紅斑病PCR檢測(cè)方法，其特征是所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng) 程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；94°C變性Imin ；54°C退火Imin ；72°C延伸Imin ；29個(gè)循環(huán)，最后 72°C 延伸 7min。
全文摘要
松針紅斑病PCR檢測(cè)方法。松針紅斑病一直采用傳統(tǒng)的形態(tài)與危害癥狀的鑒定，但該病害的發(fā)生由于地域廣，受環(huán)境因素的影響該病原菌的形態(tài)變化比較大，危害癥狀出現(xiàn)比較慢，造成早期鑒定困難。本發(fā)明的方法包括取1μL松針紅斑病DNA溶液，加入反應(yīng)液Taq聚合酶1μL、10×PCR Buffer5μL、dNTP 4μL、上游引物1μL、下游引物1μL、無菌去離子水36.25μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；然后取8μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在1.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電壓50-100V，30分鐘后在紫外光下檢測(cè)結(jié)果如果存在分子量約為180bp的DNA條帶，則證明所檢病原為松針紅斑病病原菌。本發(fā)明用于松針紅斑病的早期診斷。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102121050SQ20101003244
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月8日
發(fā)明者嚴(yán)善春, 王占斌, 王志英 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué), 嚴(yán)善春, 王占斌, 王志英