本發(fā)明涉及屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種治療腦部損傷類疾病的神經(jīng)干細胞注射液和制備方法及其使用方法。
背景技術(shù)：
：小兒腦癱通常指出生前到出生后一個月內(nèi)由各種原因引起的非進行性腦損傷或腦發(fā)育異常所導(dǎo)致的中樞性運動障礙。臨床上以姿勢與肌張力異常、肌無力、不自主運動和共濟失調(diào)等為特征，常伴有感覺、認知、交流、行為等障礙和繼發(fā)性骨骼肌肉異常，并可有癲癇發(fā)作，該病目前無理想的治療手段，致殘率高，給患者本人及家庭造成的精神負擔(dān)和經(jīng)濟負擔(dān)重。根據(jù)衛(wèi)生部發(fā)布的數(shù)據(jù)計算，我國每年新生兒1600萬人，據(jù)不同統(tǒng)計，小兒腦癱發(fā)病率在千分之二到千分之五左右，即每年3-8萬人；而由于以往人口出生率高、醫(yī)療條件落后導(dǎo)致發(fā)病率高、治愈率低等原因，有報道稱我國已有累積小兒腦癱患者500萬人。因此該病危害十分嚴重。小兒腦癱目前常用的治療方式有物理治療、作業(yè)治療、家庭訓(xùn)練、矯形器等。常用的藥物有腦神經(jīng)營養(yǎng)藥、肌肉松弛劑等，然而藥物治療只有在必要時才使用，它不能替代功能性訓(xùn)練。注射用鼠神經(jīng)生長因子是被SFDA批準(zhǔn)的一種生物制劑，提取自小鼠的頜下腺，與人的同源性達90％，采用肌肉注射的方式給藥，據(jù)報道對小兒腦癱引起的肌張力、運動發(fā)育、姿勢異常、反射異常等癥狀有一定改善效果。目前所有的治療小兒腦癱的藥物大多為提供營養(yǎng)，緩解癥狀，不能達到治療的目的。也就是說，目前市場上并沒有特異性治療小兒腦癱的有效藥物。在臨床上通常采取藥物和運動康復(fù)相結(jié)合的辦法。最近CFDA批準(zhǔn)的一種注射用鼠神經(jīng)生長因子生物制劑用于小兒腦癱的治療，該藥物來源于小鼠的額下腺，與人的同源性達90％，采用肌肉注射方式給藥，據(jù)報道對小兒腦癱引起的肌張力，運動發(fā)育，姿勢異常，反射異常等癥狀有一定改善效果。腦損傷主要還包括腦中風(fēng)和創(chuàng)傷性腦損傷，國內(nèi)外已有大量臨床前實驗研究表明神經(jīng)干細胞(NSC)對于腦中風(fēng)和創(chuàng)傷性腦損傷有一定的治療效果。并且有部分臨床試驗證明NSC移植能夠治療腦損傷。神經(jīng)干細胞(NSC)是一群較原始的、能自我更新并具有多種分化潛能的細胞,可分化成神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星形細胞。在生理條件下,體內(nèi)的NSC通常保持靜息狀態(tài)；神經(jīng)損傷后,內(nèi)源性NSC可因微環(huán)境的改變而被激活、遷移和分化,以替代損傷的細胞和重建神經(jīng)環(huán)路；遺傳修飾后,外源性NSC移植顯示了很大的治療潛力,為腦損傷的治療提供了新的手段。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，一種治療腦部損傷類疾病的神經(jīng)干細胞注射液和制備方法及其使用方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：本發(fā)明涉及一種治療腦部損傷類疾病的神經(jīng)干細胞注射液的制備方法，所述方法包括如下步驟：S1：原代細胞培養(yǎng)：將原代神經(jīng)干細胞用無血清培養(yǎng)基對細胞懸液進行培養(yǎng)擴增；其中，原代神經(jīng)干細胞的來源為哺乳動物、靈長類動物或嚙齒類動物的神經(jīng)干細胞中的一種或幾種；所述原代神經(jīng)干細胞為手術(shù)分離廢棄胎腦組織的皮層組織，然后消化酶將組織消化離心獲得原代神經(jīng)干細胞懸液；原代神經(jīng)干細胞的來源方法包括IPSC誘導(dǎo)、提取胚胎干細胞、提取人類視網(wǎng)膜色素上皮細胞或提取神經(jīng)組織器官以外的其他器官或組織干細胞。優(yōu)選的，原代神經(jīng)干細胞的來源為醫(yī)療廢棄的人源胎腦皮層組織的神經(jīng)干細胞。這種來源為完全100％人源，是一種單一的干細胞產(chǎn)品，用自主研發(fā)的無血清培養(yǎng)基和培養(yǎng)工藝，在體外培養(yǎng)到P3代，干細胞純度可達95％以上，神經(jīng)干細胞活性在90％以上。優(yōu)選的，所述原代神經(jīng)干細胞為手術(shù)分離廢棄胎腦組織的皮層組織，細胞消化計數(shù)后，采用無血清完全培養(yǎng)基進行重懸，并調(diào)整密度為1x105個/ml，然后接種至超低吸附培養(yǎng)瓶中，放入35℃5％CO2中環(huán)境中進行培養(yǎng)。其中，無血清培養(yǎng)基是由DMEM/F12，B27，N2，以及神經(jīng)營養(yǎng)因子BFGF,EGF,LIF組成，無任何動物源血清成分。S2：神經(jīng)干細胞純化及擴大培養(yǎng)：將擴增滿的原代神經(jīng)干細胞進行消化、傳代，直至傳到第5代,并鑒定細胞純度達95％以上后，作為種子細胞；P5到P8代都可作為種子細胞，種子細胞可以凍存，便于保存。所述擴增滿為至細胞直徑超過300μm，然后進行消化傳代至P1代神經(jīng)干細胞；培養(yǎng)方法為連續(xù)培養(yǎng)10-14天，期間每24小時進行觀察，確認細胞生長狀態(tài)正常，每隔48-72小時進行換液；懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞在顯微鏡下的形態(tài)見圖1。P1代神經(jīng)干細胞消化后接種至超低吸附培養(yǎng)瓶中，放入35℃5％CO2的環(huán)境中進行培養(yǎng)至傳代，重復(fù)消化、接種、培養(yǎng)的過程直至傳代到P5代神經(jīng)干細胞；所述培養(yǎng)方法為每間隔48-72小時進行換液，連續(xù)培養(yǎng)10-14天。將P5代神經(jīng)干細胞進行細胞特性和異源物質(zhì)檢測，細胞特性鑒定包括流式鑒定神經(jīng)干細胞表面標(biāo)記物SOX2和NESTIN,檢測其純度達95％以上，見圖2。熒光免疫的方法鑒定神經(jīng)干細胞特性和純度為95％以上，并具有多種分化潛能，能夠分化為神經(jīng)元，星型膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。異源物質(zhì)主要是微生物的檢測，包括無菌檢測，支原體和內(nèi)毒素檢測，其結(jié)果陰性為合格，檢測合格后將細胞凍存作為種子細胞。S3：神經(jīng)干細胞工作細胞庫的建立：將步驟S2中的種子細胞，計數(shù)并無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，待培養(yǎng)瓶細胞融合到80％—90％，將細胞消化傳代，如此反復(fù)直至細胞傳代P9代；S4：神經(jīng)干細胞注射液的制備：將步驟S3中的P9代細胞加生理鹽水定容或負載于微載體，制成臨床用神經(jīng)干細胞注射液。優(yōu)選的，步驟S3的懸浮培養(yǎng)的方法包括以下步驟：具體方法參見申請?zhí)枮?01110173821.1的專利。(a)將神經(jīng)干細胞接種在包含bFGF和EGF的DMEM/F12或DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(b)2、3或4天后在培養(yǎng)基中添加5-20％體積的營養(yǎng)補充液并繼續(xù)培養(yǎng)，其中所述營養(yǎng)補充液是包含1×B27添加劑，1×N2添加劑，1.0-3.0mMol/L的L-谷氨酰胺，0.5-1.5mMol/L的丙酮酸鈉，0.5-1.5mMol/L的NAC，50-150ng/ml的bFGF，50-150ng/ml的EGF以及1-15ng/ml的LIF的DMEM/F12或DMEM培養(yǎng)基；(c)監(jiān)測培養(yǎng)基中形成的神經(jīng)球直徑，當(dāng)60％以上、優(yōu)選70％以上神經(jīng)球直徑高于閾值時，分離直徑高于所述閾值的神經(jīng)球，消化后收獲，其中所述閾值為200-500μm，例如為250μm、300μm、350μm、400μm或450μm；(d)未挑中的直徑小于所述閾值的剩余細胞保留在原培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基移除1/2-1/4體積，然后添加與移除體積相同體積的(a)中所述的包含bFGF和EGF的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；(e)在(a)接種神經(jīng)干細胞10、11、12、13、14或15天后通過合并(c)中收獲的細胞和(d)繼續(xù)培養(yǎng)所得的細胞而收獲細胞。優(yōu)選的，步驟S4中，所述微載體包括脂質(zhì)體、微膠囊或微球載體。上述的制備方法制成的治療腦部損傷類疾病的神經(jīng)干細胞注射液。上述的神經(jīng)干細胞注射液中包含大于1×106個神經(jīng)干細胞。上述的治療腦部損傷類疾病的神經(jīng)干細胞注射液的使用方法，將所述治療腦部損傷類疾病的神經(jīng)干細胞注射液植入患者體內(nèi)；所述植入方法包括定點注射，靜脈回輸、鞘內(nèi)注射、鼻腔粘膜吸附或肌肉注射。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：1、本發(fā)明的神經(jīng)干細胞注射液可來源自認廢棄的胚胎組織，完全100％人源，是一種單一的干細胞產(chǎn)品，用自主研發(fā)的無血清培養(yǎng)基和培養(yǎng)工藝，在體外培養(yǎng)到P3代，干細胞純度可達95％以上，神經(jīng)干細胞活性在90％以上。2、該發(fā)明的神經(jīng)干細胞在體外可連續(xù)傳代到第32代并保持良好的干性和分化潛能。對數(shù)期細胞倍增時間最快可達16-24小時，活率95％以上。3、體外擴增能力強，增值倍數(shù)(每傳代一次)可最高達8-10倍。自主開發(fā)的凍存復(fù)蘇技術(shù)，細胞凍存后復(fù)蘇率可達90％以上，便于神經(jīng)干細胞制劑的制備和儲存。4、體外分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞能力較強。在無誘導(dǎo)分化下，此神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元的比例為75％-80％(遠高于其他同類產(chǎn)品，大部分神經(jīng)干細胞自發(fā)分化神經(jīng)元的比例在20％左右)，分化為少突膠質(zhì)細胞的比例為4％以上(其他神經(jīng)干細胞自發(fā)分化為少突膠質(zhì)細胞較少，1％以下)。5、該發(fā)明的神經(jīng)干細胞可以來源于IPS,胚胎干細胞，不同來源間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)化得到的神經(jīng)干細胞，具有大腦皮層來源的神經(jīng)干細胞。6、哺乳動物來源的神經(jīng)干細胞注射液7、該注射液用于治療小兒腦癱，腦卒中，急慢性腦損傷8、鼻腔粘膜吸附的給藥方式和紋狀體定點給藥治療腦損傷和小兒腦癱9、體外免疫學(xué)反應(yīng)測試顯示，此神經(jīng)干細胞對外周淋巴細胞沒有明顯的刺激作用，具有較低的免疫原性。10、藥效學(xué)實驗表明此神經(jīng)干細胞注射液鼻腔或腦內(nèi)給予可改善腦損傷大鼠的運動平衡能力和腦損傷面積。移植的神經(jīng)干細胞可在腦內(nèi)存活35天以上，并分化為神經(jīng)元。所有實驗動物未出現(xiàn)免疫反應(yīng)和意外死亡，顯示了較好的安全性。附圖說明圖1為懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞球和正在分裂增殖的單個神經(jīng)干細胞；圖2為流式檢測鑒定神經(jīng)干細胞純度為95％以上；圖3為鼻腔給予神經(jīng)干細胞后第42天腦組織的切片的CV染色圖，比例尺為2mm；圖4為腦梗死面積百分比；圖5為hNSC能夠改善HI損傷后大鼠的感覺，學(xué)習(xí)，記憶和認知能力。圖(A)為HI造模、hNSCs給藥以及各種行為測試的時間安排；圖(B-C)為sham+saline(n＝23),sham+hNSCs(n＝24),HI+saline(n＝17)andHI+hNSCs(n＝17)各組大鼠的翻正反射(B)和步態(tài)分析(C)的表現(xiàn)；圖(D)為各組大鼠的走網(wǎng)試驗的表現(xiàn)(N＝12/組)；圖(E-H)為SCT的表現(xiàn)；圖6為Morris水迷宮的表現(xiàn)，左圖為訓(xùn)練時間，右圖為目標(biāo)象限所花費的時間；圖7hNSCs能夠調(diào)節(jié)NF-κB信號傳導(dǎo)，并降低IL-1β的表達。(A，C，E，G)為對應(yīng)的westernblot條帶。(B，D，F(xiàn)，H)為各條帶表達的相對強度；圖8為行為學(xué)觀察圖；圖A體重(BWT)、圖B平衡木實驗(BBT)、圖C身體抬高搖擺實驗(EBST)、圖DBederson評分實驗數(shù)據(jù)分別用GraphPad5.0作圖；圖9腦梗死面積結(jié)果。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例1：制得原代神經(jīng)干細胞1、從胚胎干細胞(ESCs)誘導(dǎo)獲得原代神經(jīng)干細胞使用細胞刮挑取ESCs細胞克隆，輕柔吹散，然后使用神經(jīng)干細胞誘導(dǎo)液重懸，轉(zhuǎn)移至超低吸附培養(yǎng)皿中進行懸浮培養(yǎng)3天左右，收集形成的細胞球，輕柔吹散，再用神經(jīng)干細胞誘導(dǎo)液進行重懸，超低吸附培養(yǎng)皿中再次懸浮培養(yǎng)3天，收集形成的細胞球；將提前一天使用Laminin包被的培養(yǎng)皿用不含Ca、Mg的DPBS洗滌2次，將收集的細胞球用神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)基進行重懸，接種于包被好的培養(yǎng)皿中進行貼壁培養(yǎng)，每2-3天進行換液，直至形成明顯的神經(jīng)樣集落，然后使用細胞刮收集形成的集落，并使用accutase將其消化成為單個細胞，用神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)基進行重懸，懸浮培養(yǎng)，使其形成神經(jīng)干細胞球，獲得的神經(jīng)干細胞球可以消化進行傳代，也可以進行液氮凍存。2、從誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)誘導(dǎo)獲得原代神經(jīng)干細胞挑取iPSCs細胞克隆，將細胞輕柔吹散并使用不含bFGF和EGF的完全培養(yǎng)基進行重懸，轉(zhuǎn)移至超低吸附培養(yǎng)皿中進行懸浮培養(yǎng)7天左右，每2-3天進行半量換液，然后離心收集形成的細胞球。將提前一天使用Laminin包被的培養(yǎng)皿用不含Ca、Mg的DPBS洗滌2次，將收集的細胞球用含有并接種于包被好的培養(yǎng)皿中進行貼壁培養(yǎng)，每2-3天進行換液，直至形成明顯的神經(jīng)樣集落，然后使用細胞刮收集形成的集落，并使用accutase將其消化成為單個細胞，用神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)基進行重懸，懸浮培養(yǎng)，使其形成神經(jīng)干細胞球，獲得的神經(jīng)干細胞球可以消化進行傳代，也可以進行液氮凍存。3、人源廢棄胚胎組織獲得原代神經(jīng)干細胞1)胚胎組織獲取將完整的胚胎/廢棄胎兒置于100mm無菌培養(yǎng)皿的hibernationmedium緩沖溶液中，用緩沖液反復(fù)沖洗。在解剖鏡下，一手持眼科鑷，另一手持眼科剪，剝離頭部皮膚和骨骼，打開顱腔，暴露腦組織,用精細手術(shù)鑷撕去腦組織周圍血管膜。用精細手術(shù)鑷夾斷腦皮層的邊緣，分離腦皮層，放入35mm無菌培養(yǎng)皿的緩沖溶液中。再用精細手術(shù)鑷將腦皮層分割成約1mm大小的組織塊。將取材得到的人胚胎/胎兒腦皮層和緩沖溶液用無菌一次性3ml滴管轉(zhuǎn)移進入一個或多個15/50ml離心管，靜置5分鐘，使組織塊充分沉淀到管底，盡量吸棄上清。然后用無菌注射器和0.22um濾膜進行無菌過濾，直接濾入離心管中，每個15ml離心管中需5ml消化液，之后進行輕微晃動。將離心管放入35℃二氧化碳培養(yǎng)箱消化，每5分鐘手動振蕩一次，消化30分鐘后，離心300g，5分鐘，20℃。最后用無菌一次性3ml滴管吸棄上清至約50ul處，用1ml槍頭吸取950ul緩沖溶液加入離心管，輕柔吹吸10－15次，以致形成單細胞懸液。2)接種配制的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液20ml并加入低吸附T75培養(yǎng)瓶中。根據(jù)計數(shù)得到的懸液細胞密度和200個/ul的最終細胞接種密度，計算需接種的細胞懸液的體積。用無菌一次性吸管混勻細胞懸液，用合適量程的移液槍在液面下再吹打，取出計算體積的單細胞懸液，迅速加入低吸附T75培養(yǎng)瓶中，并輕輕從不同方向晃動容器，使細胞在培養(yǎng)液中均勻分布。將接種后的T75培養(yǎng)瓶迅速放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為35℃，二氧化碳濃度為5％。4)原代細胞培養(yǎng)原代細胞接種培養(yǎng)后，根據(jù)細胞生長情況及培養(yǎng)液外觀，按照《神經(jīng)干細胞培養(yǎng)加液標(biāo)準(zhǔn)操作程序》每過2-3天，從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出T75培養(yǎng)瓶，放入生物安全柜中。用2ml的無菌移液管，取出已配置好的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)營養(yǎng)補充液2ml，迅速加入低吸附T75培養(yǎng)瓶中，并輕輕從不同方向晃動，使細胞均勻分布。將加好補液的低吸附T75培養(yǎng)瓶迅速放回二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為35℃，二氧化碳濃度為5％。5)細胞收獲神經(jīng)干細胞培養(yǎng)至7-10天，觀察細胞生長狀態(tài)，用無菌吸管將低吸附T75培養(yǎng)瓶中的神經(jīng)球和培養(yǎng)液吸入50ml離心管中，100g，4℃，離心10min，使神經(jīng)球充分沉淀到管底，盡量吸去上清,將吸取的上清液放入無菌容器中，得到原代神經(jīng)干細胞。實施例2：P1-P5代神經(jīng)干細胞的制備1、原代神經(jīng)干細胞傳代與培養(yǎng)將已配好的10ml無菌神經(jīng)消化液用無菌注射器注入裝有原代神經(jīng)干細胞球的離心管中。將離心管口用parafilm膜密封，靜置3分鐘。加入準(zhǔn)備好的除菌神經(jīng)組織消化液，放入35℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中作用30分鐘(每10分鐘手動震蕩一次5秒)。低溫離心機4℃，300g，離心10分鐘。用無菌一次性吸管吸棄上清，用大功率移液器和移液管加入1·-5mLDMEM/F12沖洗，上下吹打2-3次，使組織分離。低溫離心機4℃，300g，離心10-20分鐘。重新加入1-5mLhibernationmedium洗滌，共洗滌三次。用無菌一次性吸管吸棄上清。加入1-5mLDMEM，使細胞沉淀懸浮均勻，注意不要產(chǎn)生氣泡使細胞沉淀懸浮均勻，用于后續(xù)計數(shù)操作。1.1細胞計數(shù)按照《細胞密度測定標(biāo)準(zhǔn)操作程序》對單細胞懸液進行計數(shù)。1.2傳代與培養(yǎng)根據(jù)計數(shù)得到的懸液細胞密度，計算需接種的細胞懸液的體積。將三個低吸附T75培養(yǎng)瓶中加入10-30ml的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液。用無菌一次性吸管混勻細胞懸液，用合適量程的移液槍在液面下再吹打，取出計算體積的單細胞懸液(根據(jù)計數(shù)得到的懸液細胞密度和50-500個/ul的最終細胞接種密度)，迅速加入低吸附T75培養(yǎng)瓶中，并輕輕從不同方向晃動，使細胞在培養(yǎng)液中均勻分布。將接種后的低吸附T75培養(yǎng)瓶迅速放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為35℃，二氧化碳濃度為5％。2、細胞的收獲與凍存P2細胞接種培養(yǎng)后，根據(jù)細胞生長情況及培養(yǎng)液外觀，按照《神經(jīng)干細胞培養(yǎng)加液標(biāo)準(zhǔn)操作程序》每過2-3天，從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出T75培養(yǎng)瓶，放入生物安全柜中。用2ml的無菌移液管，取出已配置好的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)營養(yǎng)補充液2ml，迅速加入低吸附T75培養(yǎng)瓶中，并輕輕從不同方向晃動，使細胞均勻分布。將加好補液的低吸附T75培養(yǎng)瓶迅速放回二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為35℃，二氧化碳濃度為5％。得到P2代細胞。2.1消化收獲用無菌吸管將低吸附T75培養(yǎng)瓶中的神經(jīng)球和培養(yǎng)液吸入50ml離心管中，100g，4℃，離心10min，使神經(jīng)球充分沉淀到管底，盡量吸去上清,將吸取的上清液放入無菌容器中做好標(biāo)記存放于4℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?.2洗滌將已配好的5-50ml無菌神經(jīng)消化液用無菌注射器注入裝有P2神經(jīng)球的離心管中。將離心管口用parafilm膜密封，靜置3分鐘。加入準(zhǔn)備好的除菌神經(jīng)組織消化液，放入35℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中作用10-50分鐘(每10分鐘手動震蕩一次5秒)。低溫離心機4℃，300g，離心10分鐘。用無菌一次性吸管吸棄上清，用大功率移液器和移液管加入5mLDMEM/F12沖洗，上下吹打2-3次，使組織分離。低溫離心機4℃，300g，離心5-30分鐘。重新加入1-10mLhibernationmedium洗滌，共洗滌三次。2.3過濾和細胞計數(shù)用無菌一次性吸管吸棄上清。加入2mLDMEM，使細胞沉淀懸浮均勻，按照《細胞密度測定標(biāo)準(zhǔn)操作程序》對單細胞懸液進行計數(shù)。2.4P2代到P5代細胞培養(yǎng)將消化后的P2代細胞按1×105個/ml的密度接種到T75培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)過程和消化過程與P1代細胞相同，待細胞生長到80％以上的時候進行消化，計數(shù)和傳代，以此類推，直至獲得P5代細胞的獲得。2.4細胞凍存分裝鑒定細胞純度達95％以上后，用無菌吸管將低吸附T75培養(yǎng)瓶中的神經(jīng)球和培養(yǎng)液吸入50ml離心管中，100g，4℃，離心10min，使神經(jīng)球充分沉淀到管底，盡量吸去上清,將吸取的上清液放入無菌容器中做好標(biāo)記存放于4℃冰箱中儲存?zhèn)溆?.5程序性降溫使用程序降溫儀進行程序降溫：將需凍存的細胞放置于程序性降溫儀中按照標(biāo)準(zhǔn)凍存程序?qū)⒅?80以下℃。2.6細胞入庫凍存結(jié)束后，將凍存盒取出轉(zhuǎn)移到液氮罐中貯存。實施例3P6-P9代神經(jīng)干細胞的制備1、細胞的復(fù)蘇從液氮罐中取出凍存的細胞，放入電熱恒溫水槽中的復(fù)蘇架上(水溫保持在40左右)，快速晃動復(fù)溫。由固態(tài)變成液態(tài)時，復(fù)蘇即完成。1.1細胞的洗滌將離心管口用parafilm膜密封，靜置3分鐘。加入準(zhǔn)備好的除菌神經(jīng)組織消化液，放入35℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中作用5-60分鐘(每10分鐘手動震蕩一次5秒)。低溫離心機4℃，300g，離心10分鐘。1.2取樣計數(shù)和洗滌用無菌一次性吸管吸棄上清，用大功率移液器和移液管加入1-10mLDMEM/F12沖洗，上下吹打2-3次，使組織分離。低溫離心機4℃，300g，離心10分鐘。重新加入1-10mLhibernationmedium洗滌，共洗滌三次。用無菌一次性吸管吸棄上清。1.3傳代與培養(yǎng)將1:3接種于低吸附T75培養(yǎng)瓶中加入5-50ml的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液。用無菌一次性吸管混勻細胞懸液，用合適量程的移液槍在液面下再吹打，取出計算體積的單細胞懸液(根據(jù)計數(shù)得到的懸液細胞密度和10-500個/ul的最終細胞接種密度)，迅速加入低吸附T75培養(yǎng)瓶中，并輕輕從不同方向晃動，使細胞在培養(yǎng)液中均勻分布。將接種后的低吸附T75培養(yǎng)瓶迅速放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為35℃，二氧化碳濃度為5％。2、種子細胞的傳代P5細胞接種培養(yǎng)后，根據(jù)細胞生長情況及培養(yǎng)液外觀，每過2-3天，從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出T75培養(yǎng)瓶，放入生物安全柜中。用2ml的無菌移液管，取出已配置好的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)營養(yǎng)補充液1-5ml，迅速加入低吸附T75培養(yǎng)瓶中，并輕輕從不同方向晃動，使細胞均勻分布。將加好補液的低吸附T75培養(yǎng)瓶迅速放回二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為35℃，二氧化碳濃度為5％。2.1消化神經(jīng)干細胞培養(yǎng)至7-10天，觀察細胞生長狀態(tài)，達到平臺期(細胞經(jīng)連續(xù)2日觀察，增值緩慢或停滯)進行傳代操作。按照《神經(jīng)球消化標(biāo)準(zhǔn)操作程序》進行。其中6瓶T75用于1:3繼續(xù)傳代培養(yǎng)，其余按照《神經(jīng)干細胞凍存標(biāo)準(zhǔn)操作程序》凍存。2.2細胞計數(shù)將細胞吹打成單個神經(jīng)干細胞，取10ul在細胞自動計數(shù)儀上計數(shù)。2.3傳代與培養(yǎng)將消化后的單個神經(jīng)干細胞，按著0.1-10*105個/ML的濃度接種繼續(xù)培養(yǎng)，在T75瓶中混勻培養(yǎng)，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中,待培養(yǎng)瓶細胞融合到80％—90％，將細胞消化傳代，如此反復(fù)直至細胞傳代P9代。實施例4:P6-P9代神經(jīng)干細胞注射液的制備將凍存的P5-P8神經(jīng)干細胞按著實施例3的方法進行復(fù)蘇，計數(shù)后接種，在T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長情況及培養(yǎng)液外觀，每過2-3天，從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出T75培養(yǎng)瓶，放入生物安全柜中。用2ml的無菌移液管，取出已配置好的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)營養(yǎng)補充液1-5ml，迅速加入低吸附T75培養(yǎng)瓶中，并輕輕從不同方向晃動，使細胞均勻分布。將加好補液的低吸附T75培養(yǎng)瓶迅速放回二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為35℃，二氧化碳濃度為5％。待神經(jīng)干細胞培養(yǎng)10-14天，觀察細胞生長情況，如細胞融合達到85％以上，即可消化細胞，用無菌吸管將低吸附T75培養(yǎng)瓶中的神經(jīng)球和培養(yǎng)液吸入50ml離心管中，100g，4℃，離心10min，使神經(jīng)球充分沉淀到管底，盡量吸去上清,將吸取的上清液放入無菌容器中做好標(biāo)記存放于4℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩Ｐ枰獣r取出裝有神經(jīng)干細胞的離心管，加入50ml生理鹽水，細胞混勻后離心，4℃，離心10min。離心后取上清，再次重復(fù)以上步驟，共計洗滌2次，然后加入1ml生理鹽水進行細胞計數(shù)，最后用生理鹽水定容成1×106個細胞/ml的神經(jīng)干細胞注射液。此注射液可用于動物實驗和臨床實驗治療腦部損傷類疾病。實施例5：小兒腦癱動物模型研究1、實驗動物動物：SPF級出生后7天的SD大鼠(13-19g，雌雄各半)2、造模(HI)乙醚麻醉，動物固定并暴露左側(cè)頸總動脈，用電凝器進行橫斷，待其恢復(fù)1.5小時，然后在7.8％O2/92.2％N2的低氧箱中進行缺氧2小時(HI)。3、干細胞治療HI造模后24小時鼻腔給藥，細胞數(shù)共3x105/6ul，左右各3ul，兩次間隔時間5min。4、實驗分組正常對照組1(正常組)——給予生理鹽水正常對照組2——ANGE-S001HI模型對照組(模型組)——給予生理鹽水HI模型給藥組(ANGE-S001組)——ANGE-S001給藥ANGE-S001配制過程：將鮮活的P9代神經(jīng)干細胞3x105溶于6ul生理鹽水中。5、療效檢測和機理探索(1)鼻腔給予神經(jīng)干細胞注射液3h后，PKH-26(紅)標(biāo)記的hNSC(3×105細胞/動物)在SD大鼠頭部的在體生物發(fā)光，SD大鼠頭部的在體生物發(fā)光成像明顯；腦中總的熒光強度明顯強于生理鹽水給藥組；神經(jīng)干細胞在腦內(nèi)主要分布在嗅球，皮質(zhì)，胼胝體和海馬區(qū)域。(2)hNSCs對腦損傷的長期影響。見圖3。切片中腦損傷的面積和損傷對側(cè)的腦面積均進行了計算，見圖4?？梢奾NSCs給予后能顯著減少HI造成的組織損傷(模型組大鼠5只，神經(jīng)干細胞組大鼠6只)。。神經(jīng)干細胞給予后能明顯減少HI引起的腦梗死面積。(3)hNSC能夠改善HI損傷后大鼠的感覺，學(xué)習(xí)，記憶和認知能力。見圖5。由圖(B)可見在給藥后第3天，神經(jīng)干細胞能顯著降低翻正實驗所需的時間。由圖(C)可見在給藥后第5天，神經(jīng)干細胞能顯著降低步態(tài)分析的時間。需要注意的是HI+hNSCs組的老鼠和假手術(shù)組在交流和好奇心上表現(xiàn)出一致的偏好，而HI+生理鹽水組剛好相反。和HI+saline組大鼠不同，HI+的hNSCs組大鼠與假手術(shù)組大鼠表現(xiàn)出相似的nose-point(圖G)和ceter-point(圖H)指數(shù)。(4)在獲得性試驗中，HI+saline組大鼠的潛伏期明顯比HI+hNSCs組和假手術(shù)組大鼠長。在保留試驗中，HI+saline組大鼠和sham+saline組和HI+hNSCs組大鼠相比，在目標(biāo)象限所花費的時間和跨越平臺的頻率都顯著降低，見圖6。(5)鼻腔給藥后第3天采用westernblot對IL-1β，磷酸化IκBα，和NF-κBp65的表達，見圖7。如圖7所示，HI損傷增加了細胞內(nèi)IL-1β，磷酸化IκBα和NF-κBP65的表達，而hNSCs能逆轉(zhuǎn)這一過程。對于細胞核NF-κB，hNSCs能顯著的增強其表達。實施例6：腦損傷MCAO動物模型研究1.實驗動物動物:成年SD大鼠(220-250，雌雄各半)，共40只2.造模(MCAO)術(shù)前禁食不禁水12h。動物用10％戊巴比妥鈉(32mg/kg)腹腔注射麻醉。參考改進的ZeaLonga方法造模，缺血達到2h后小心抽出栓線，即形成再灌注。假手術(shù)對照只是不插入尼龍魚線，其余步驟同手術(shù)組。在手術(shù)后保持體溫在(37±0.5)℃。模型制作成功標(biāo)準(zhǔn)：參照Bederson確立的5級評分法，對大鼠的神經(jīng)功能缺損進行評分。在MCAO大鼠造模2h后，對大鼠的神經(jīng)功能進行評分，評分在1-3級者定為造模成功小鼠，0級和4級者棄去。3、神經(jīng)干細胞治療MCAO造模后24小時鼻腔給藥，NSC雙側(cè)鼻腔給藥，每側(cè)3ul，給藥后保持姿勢5min，間隔15min。實驗分組組別數(shù)量(只)劑量(細胞/體積)注射方式1正常組6生理鹽水/6ul雙側(cè)，造模后1,3,7天2模型組5生理鹽水/6ul雙側(cè)，造模后1,3,7天3人源NSC71*106個/6ul雙側(cè)，造模后1,3,7天4鼠源NSC101*106個/6ul雙側(cè)，造模后1,3,7天5.行為學(xué)觀察造模后第1d、3d、5d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d分別進行Bederson評分，EBST實驗、平衡木實驗，每次同步記錄體重數(shù)據(jù)。見圖8。Sham組與MCAO+NS、MCAO+hNSC.、MCAO+rNSC.組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；MCAO+NS組與MCAO+hNSC.組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；MCAO+NS組與MCAO+rNSC.組比較：無差異；MCAO+hNSC.組與MCAO+rNSC.組比較：^P＜0.05，^^P＜0.01。6.腦梗死面積結(jié)果由圖9可見，腦組織切片結(jié)果，神經(jīng)干細胞組能顯著修復(fù)腦損傷引起腦梗死。當(dāng)前第1頁1 2 3