本發(fā)明涉及納米材料領(lǐng)域，具體地說，涉及一種能高效產(chǎn)生活性氧自由基的氧化銅-鉑納米復(fù)合體在抗菌方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由細菌感染引起的疾病，日益成為威脅人類健康的罪魁禍首之一。如：霍亂、肺炎、瘧疾、結(jié)核及肝炎等，都是由于細菌或微生物傳播而引起的。在生物醫(yī)學(xué)移植物、手術(shù)設(shè)備、工業(yè)管道等器械中，細菌集落和生物膜又是引起一些傳染性疾病暴發(fā)和醫(yī)院獲得性感染的主要原因。細菌集落及生物膜可以在外圍形成保護屏障，使得傳統(tǒng)的抗菌治療以及免疫響應(yīng)不能徹底清除這些病原灶?？股氐膯柺?，為人類戰(zhàn)勝這些疾病提供了有效的治療途徑。但是，抗生素濫用會引起細菌耐藥性的急劇增加，導(dǎo)致許多藥物無法治療的“超級感染”，如：耐甲氧西林金黃葡萄球菌的感染等。在2002年，大約有170萬病人遭受了醫(yī)院獲得性感染，其中一半人是由于泌尿管和中心靜脈留置導(dǎo)管滅菌不徹底而引發(fā)的二次感染。

隨著納米科技的發(fā)展，越來越多的無機納米抗菌材料也應(yīng)運而生。無機抗菌材料具有低毒性、耐熱性、耐久性、持續(xù)性、抗菌譜廣等優(yōu)點，日益成為生活制品的最佳選擇。無機抗菌材料又以含金屬離子金屬氧化物型抗菌劑和半導(dǎo)體光催化型抗菌劑為主。金屬離子金屬氧化物型抗菌劑是利用金屬本身所具有的抗菌能力來達到抗菌目的，例如銀系列的抗菌材料。銀離子本身就可以通過電荷引力吸附在細菌表面，破壞細胞壁，并與菌體內(nèi)的巰基基團反應(yīng)，使得蛋白凝聚，下調(diào)破壞細菌的細胞合成酶的活性，使細胞喪失分裂增殖能力而死亡。但是這類抗菌劑一般成本較高，穩(wěn)定性差，生物安全性評價不完善，并且長期暴露于材料下也會影響人類的健康。

氧化銅-鉑納米復(fù)合體是首先通過水熱法制備得到的氧化銅納米片，然后在氧化銅納米片的分散液中，通過硼氫化鈉還原氯鉑酸得到的。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，其對細菌(如大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)具有一定的抗菌作用，但抗菌效果并不十分理想。若能基于該納米復(fù)合體開發(fā)一種使其強效抗菌的途徑，將對由細菌引發(fā)的傳染病的防治十分有利。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供氧化銅-鉑納米復(fù)合體在抗菌方面的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

第一方面，本發(fā)明提供了氧化銅-鉑納米復(fù)合體在抗菌方面的應(yīng)用，具體為利用氧化銅-鉑納米復(fù)合體與過氧化氫共同作用，引起細胞內(nèi)活性氧自由基含量的增加，進而引起細菌內(nèi)部氧化應(yīng)激失調(diào)，達到抑菌目的。

作為優(yōu)選，上述應(yīng)用針對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用格外顯著，因此，優(yōu)選所述細菌為大腸桿菌或金黃色葡萄球菌。

進一步地，當所述細菌為大腸桿菌時，所述氧化銅-鉑納米復(fù)合體的作用濃度為10～20μg/mL，所述過氧化氫的作用濃度為40～60μM。作為優(yōu)選，所述氧化銅-鉑納米復(fù)合體的作用濃度為15～20μg/mL，所述過氧化氫的作用濃度為45～55μM。更為優(yōu)選，所述氧化銅-鉑納米復(fù)合體的作用濃度為20μg/mL，所述過氧化氫的作用濃度為50μM。

進一步地，當所述細菌為金黃色葡萄球菌時，所述氧化銅-鉑納米復(fù)合體的作用濃度為10～20μg/mL，所述過氧化氫的作用濃度為250～450μM。作為優(yōu)選，所述氧化銅-鉑納米復(fù)合體的作用濃度為15～20μg/mL，所述過氧化氫的作用濃度為250～350μM。更為優(yōu)選，所述氧化銅-鉑納米復(fù)合體的作用濃度為20μg/mL，所述過氧化氫的作用濃度為300μM。

進一步地，所述抗菌表現(xiàn)為抑制細菌生長和/或清除細菌生物膜。

第二方面，本發(fā)明提供了一種抗菌劑，包括氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫。該抗菌劑現(xiàn)用現(xiàn)配，針對不同細菌將氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫按照上述優(yōu)選方案組合即可。

本發(fā)明涉及到的原料或試劑均為普通市售產(chǎn)品，涉及到的操作如無特殊說明均為本領(lǐng)域常規(guī)操作。

在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可以相互組合，得到具體實施方式。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明利用氧化銅-鉑納米復(fù)合體材料和過氧化氫共同作用，產(chǎn)生大量活性氧自由基。在正常的生理狀態(tài)下，活性氧自由基受到機體自身的酶(超氧化物歧化酶等)和小分子(抗壞血酸等)的調(diào)節(jié)，使其處于穩(wěn)態(tài)，不會對機體產(chǎn)生傷害。一旦穩(wěn)態(tài)被打破，引起細胞內(nèi)活性氧自由基含量的增加，進而引起細菌內(nèi)部氧化應(yīng)激失調(diào)，達到抑菌目的。所述氧化銅-鉑納米復(fù)合體材料不僅可以有效地抑制細菌生長而且還能清除細菌生物膜。

附圖說明

圖1是實施例1所述氧化銅-鉑納米復(fù)合體的透射電鏡圖。

圖2是氧化銅-鉑納米復(fù)合體對細菌胞內(nèi)活性氧自由基含量的影響圖。

圖3是不同濃度的氧化銅-鉑納米復(fù)合體對兩種細菌的抑制效果圖。

圖4是氧化銅-鉑納米復(fù)合體對細菌生長狀態(tài)的熒光強度圖。

圖5是氧化銅-鉑納米復(fù)合體對細菌生物膜破壞的效果圖。

圖6是不同濃度的過氧化氫對細菌存活率的影響圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。

下述實施例使用的原料包括：

1、來自美國典型培養(yǎng)物收藏中心(ATCC)的大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 6538。

2、液體LB培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，1mol/L NaOH調(diào)pH至7.4，高壓蒸汽滅菌20min。

3、固體LB培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，15g/L瓊脂，1mol/LNaOH調(diào)pH至7.4，高壓蒸汽滅菌20min。

4、液體TSB培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨17g/L，大豆木瓜蛋白酶消化物3g/L，氯化鈉5g/L，磷酸二氫鉀2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，1mol/L NaOH調(diào)pH至7.4，高壓蒸汽滅菌20min。

下述實施例中細菌懸浮液的制備方法為：通過無菌操作，使用接種環(huán)將兩種細菌接種于LB培養(yǎng)基中，37℃、150rpm過夜培養(yǎng)。

下述實施例中細菌生物膜的培養(yǎng)方法為：(1)通過無菌操作，在24孔板中加入900μL TSB培養(yǎng)基。(2)將對數(shù)生長期的細菌分別取100μL加入每孔。(3)將24孔板靜止于培養(yǎng)箱中孵育48小時，37℃，每個12小時更換新鮮TSB培養(yǎng)基。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1氧化銅-鉑納米復(fù)合體的制備

1、氧化銅納米片制備

將0.5g二水合氯化銅和0.5g CTAB溶解在15mL水中，并加入1mL氫氧化鈉溶液(0.3g/mL)；將上述反應(yīng)溶液移入20mL反應(yīng)釜中，120℃反應(yīng)6h。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)離心、洗滌，得到氧化銅納米片。

2、氧化銅-鉑納米復(fù)合體制備

首先，取660μL氧化銅納米片(170mg/L)加入到2.34mL超純水中，超聲10min，使其均勻分散。然后，向上述混合液中加入23.5μL H₂PtCl₆·6H₂O水溶液(19.3mM)。最后，在冰浴下，快速攪拌并逐滴加入1mL NaBH₄水溶液(4.8mM)，滴加結(jié)束后繼續(xù)攪拌2h。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)離心、洗滌，得到氧化銅-鉑納米復(fù)合體。氧化銅-鉑納米復(fù)合體的透射電鏡圖如圖1所示，從圖中可見，鉑納米顆粒均勻地分布在氧化銅片上。

實施例2氧化銅-鉑納米復(fù)合體在抗菌方面的應(yīng)用

1、氧化銅-鉑納米復(fù)合體對細菌胞內(nèi)活性氧自由基的測量

步驟：(1)收集對數(shù)生長期的細菌，用0.01M的PBS洗滌，并調(diào)節(jié)其OD600＝0.1(10⁸CFU/mL)，分取20μL到1.5mL的離心管中。(2)向離心管中加入終濃度為20μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體，并同時加入過氧化氫。對于大腸桿菌過氧化氫終濃度為(50μM)，金黃色葡萄球菌過氧化氫終濃度為(300μM)。(3)將上述離心管放置于培養(yǎng)箱中，37℃、150rpm，作用3小時。(4)向上述體系中，加入熒光探針DCFH-DA(100μM)，37℃、150rpm，孵育30分鐘。(5)用酶標儀測定激發(fā)在485nm，發(fā)射在530nm處的熒光值。(6)計算細菌細胞內(nèi)活性氧自由基的含量。

2、氧化銅-鉑納米復(fù)合體對細菌存活率的評價

(A)稀釋平板法

步驟：(1)收集對數(shù)生長期的細菌，用0.01M的PBS洗滌，并調(diào)節(jié)其OD600＝0.1(10⁸CFU/mL)，分取20μL到1.5mL的離心管中。(2)向離心管中加入終濃度分別為5、10、15和20μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體，并同時加入過氧化氫。對于大腸桿菌過氧化氫終濃度為(50μM)，金黃色葡萄球菌過氧化氫終濃度為(300μM)。(3)將上述離心管放置于培養(yǎng)箱中，37℃、150rpm，作用3小時。(4)通過無菌操作，將上述混合物稀釋10倍，然后取100μL涂布于LB平板上，每個處理三次重復(fù)。(5)將上述涂布的培養(yǎng)皿放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。(6)通過統(tǒng)計菌落數(shù)，初步得到氧化銅-鉑納米復(fù)合體對細菌生長的抑制情況。

(B)熒光強度法

步驟：(1)收集對數(shù)生長期的細菌，用0.01M的PBS洗滌，并調(diào)節(jié)其OD600＝0.1(10⁸CFU/mL)，分取20μL到1.5mL的離心管中。(2)向離心管中加入終濃度為(20μg/mL)氧化銅-鉑納米復(fù)合體，并同時加入過氧化氫。對于大腸桿菌過氧化氫終濃度為(50μM)，金黃色葡萄球菌過氧化氫終濃度為(300μM)。(3)將上述離心管放置于培養(yǎng)箱中，37℃、150rpm，作用3小時。(4)通過無菌操作，將上述混合物分別加入1.5μL STYO 9和PI兩種熒光染液，每個處理三次重復(fù)。STYO 9可以標記所有的細胞，而PI只能標記受損的細胞，引起STYO 9的綠色熒光下降，進而區(qū)分活細胞和死細胞。(5)通過離心去除多余染液，然后用酶標儀分別記錄激發(fā)在480nm，發(fā)射在500nm和激發(fā)在490nm，發(fā)射在550nm處的熒光信號。(6)通過統(tǒng)計熒光強度，進一步得出氧化銅-鉑納米復(fù)合體對細菌生長的抑制情況。

3、氧化銅-鉑納米復(fù)合體對細菌生物膜的破壞

步驟：(1)用0.01M PBS對上述培養(yǎng)48小時的生物膜清洗，去除殘余培養(yǎng)基。(2)向24孔板中加入終濃度分別為5、10、15和20μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體，并同時加入過氧化氫，用PBS補足體積至1mL。對于大腸桿菌過氧化氫終濃度為(50μM)，金黃色葡萄球菌過氧化氫終濃度為(300μM)。(3)將上述24孔板放置于培養(yǎng)箱中，37℃靜止作用3小時。(4)通過無菌操作，使用移液槍移除作用后的混合液，用PBS進行兩次清洗。(5)向24孔板中加入500μL甲醇，固定生物膜15min。(6)每孔加入300μL結(jié)晶紫染液(1％)，靜止染色30min。(7)去除多余染液，并用PBS清洗兩次后，用數(shù)碼相機對孔底部的生物膜進行拍照。(8)每孔加入1mL乙醇，提取吸附在生物膜上的染液，并使用酶標儀測定其在595nm處的吸收值。(9)計算氧化銅-鉑納米復(fù)合體對細菌生物膜的破壞程度。

對比例1

本對比例與實施例2的區(qū)別在于：在實施例2的各項實驗中，均不加入過氧化氫。并與實施例2所得結(jié)果進行對比，結(jié)果見圖2～圖5。

其中，圖2為氧化銅-鉑納米復(fù)合體對細菌胞內(nèi)活性氧自由基含量的影響圖。如圖2所示，只加入過氧化氫時，細菌胞內(nèi)的活性氧自由基沒有出現(xiàn)劇增，由此推斷，該濃度下的過氧化氫不會對細菌的生長產(chǎn)生影響。只加入氧化銅-鉑納米復(fù)合體時，細菌胞內(nèi)的活性氧自由基會有所增加。如果同時使用氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫時，細菌胞內(nèi)的活性氧自由基會呈現(xiàn)倍數(shù)性增加。氧化銅-鉑納米復(fù)合體聯(lián)合過氧化氫時，會導(dǎo)致大腸桿菌內(nèi)部活性氧自由基有2.7倍的增加；也會引起金黃色葡萄球菌內(nèi)部活性氧自由基有8.2倍的增加。

圖3為氧化銅-鉑納米復(fù)合體對兩種細菌的抑制效果圖。如圖3A和3B所示，在5μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫的聯(lián)合作用下，兩種細菌的存活率已經(jīng)明顯下降至50％左右。沒有過氧化氫存在時，5μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體對兩種細菌的存活率影響極小，可以忽略不計。在10μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫的聯(lián)合作用下，兩種細菌的存活率已經(jīng)明顯下降至30％以下。若沒有過氧化氫輔助時，僅10μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體對細菌的生長影響極小，可以忽略不計。在15μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫的聯(lián)合作用下，兩種細菌的存活率已經(jīng)明顯下降至10％以下。沒有過氧化氫存在時，只15μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體作用下，其對細菌的生長影響極小，可以忽略不計。在20μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫聯(lián)用作用下，兩種細菌的存活率已經(jīng)明顯接近0％。無過氧化氫輔助時，僅氧化銅-鉑納米復(fù)合體作用時，細菌依舊維持很高的存活率。圖3C和3D分別為對應(yīng)處理條件下平板菌落圖，從平板圖中可以明顯發(fā)現(xiàn)，5μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫的聯(lián)合作用抑菌效果要好于單獨的氧化銅-鉑納米復(fù)合體的抑菌效果。10μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫的聯(lián)用能在一定程度上抑制細菌生長，使得平板上的細菌菌落數(shù)有明顯減少。而無過氧化氫存在時，僅10μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體時，平板上依舊會形成大量的細菌菌落。15μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫的聯(lián)用能顯著地抑制細菌生長。20μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫的聯(lián)用能強烈地抑制細菌生長，平板上僅有很少的菌落。由此可知，氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫的聯(lián)用抑菌效果要優(yōu)于單獨的氧化銅-鉑納米復(fù)合體或過氧化氫的抑菌效果。

圖4為細菌生長狀態(tài)的熒光強度對比圖。當細菌受到損傷時，紅色熒光分子就會滲透至細菌內(nèi)部，標記其核酸，使得綠色的熒光強度下降。如圖所示，細菌生長狀態(tài)良好時，其綠色熒光強度越高，紅色熒光強度就會越低，其兩者的比值就會很大。單獨的過氧化氫，能使的兩者的熒光比值下降，說明過氧化氫對細菌的生長還是產(chǎn)生了部分影響。熒光標記法相對于平板計數(shù)法更加靈敏地顯示出細菌的生長狀態(tài)。在氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫的連用下，熒光比值會降低到0，說明氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫共同作用，產(chǎn)生活性氧自由基，用于抑制細菌生長。僅氧化銅-鉑納米復(fù)合體或過氧化氫作用時，熒光比值并沒有出現(xiàn)顯著性下降，說明其單獨使用的抑菌效果不如聯(lián)合作用的抑菌效果。

圖5所制備的氧化銅-鉑納米復(fù)合體對細菌生物膜破壞的效果圖。如圖5A和5B所示，5μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫聯(lián)用時，不能有效地分解細菌生物膜。10μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫聯(lián)用時，能部分地分解細菌生物膜。15μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫聯(lián)用時，能很大程度地分解細菌生物膜。20μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫聯(lián)用時，能有效地分解細菌生物膜。圖5C和5D是對應(yīng)24孔板中的殘存細菌生物膜照片，相對于空白組而言，5μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫聯(lián)合處理組中仍有大量殘留生物膜。10μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫聯(lián)合處理組中，孔底殘留的生物膜有所減少。而單獨10μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體處理下，孔底部的細菌生物膜并沒有出現(xiàn)裂解，在孔底部依舊有大量細菌生物膜滋生。15μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫聯(lián)用處理組中，孔底殘留的生物膜有大量減少。然而，單獨15μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體作用時，其對細菌生物膜并沒有任何影響，孔底部依舊有大量生物膜。20μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫聯(lián)用的處理組中，孔底僅有少許殘留的細菌生物膜，因此其著色效果最差。由此可知，氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫的聯(lián)用能夠有效地分解細菌生物膜，并且其分解效果要優(yōu)于單獨的氧化銅-鉑納米復(fù)合體或過氧化氫作用的效果。

實施例3

本實施例通過比較過氧化氫濃度對細菌存活率的影響，對過氧化氫的用量進行優(yōu)化。

步驟：(1)收集對數(shù)生長期的細菌，用0.01M的PBS洗滌，并調(diào)節(jié)其OD600＝0.1(10⁸CFU/mL)，分取20μL到1.5mL的離心管中。(2)向離心管中加入不同濃度的過氧化氫。使對于大腸桿菌過氧化氫終濃度分別為5μM、10μM、25μM、50μM、100μM，金黃色葡萄球菌過氧化氫終濃度分別為10μM、30μM、100μM、300μM、900μM。(3)將上述離心管放置于培養(yǎng)箱中，37℃、150rpm，作用12小時。(4)用酶標儀測定吸收在600nm處的值。(6)計算細菌存活率。

實驗結(jié)果如圖6所示，細菌的存活率會隨著過氧化氫濃度的增加而下降。對于大腸桿菌，所選的過氧化氫濃度在50μM以下時，其對細菌的存活率影響較小，當過氧化氫濃度使用量達到100μM以上時，細菌的存活率出現(xiàn)急劇下降。對于金黃色葡萄球菌而言，所選的過氧化氫濃度在300μM以下時，其對細菌的存活率影響較小，當過氧化氫濃度使用量達到900μM以上時，細菌的存活率出現(xiàn)急劇下降。由于本抗菌體系中，是考慮到氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過氧化氫的聯(lián)合抑菌效應(yīng)。故此，首選過氧化氫濃度的最佳選擇條件為在某一濃度下，其本身對細菌的存活率不會造成很大影響，同時又能保證其用量充分。

綜上所述，本發(fā)明針對大腸桿菌選擇50μM的過氧化氫，針對金黃色葡萄球菌選擇300μM的過氧化氫。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。