本發(fā)明涉及以納米氧化銅作為模擬堿性過氧化物酶，在堿性條件下催化過氧化氫氧化對羥基苯丙酸，形成穩(wěn)定的二聚體熒光產物，測定過氧化氫的熒光分析方法，屬于分析化學和納米技術領域。

背景技術：

天然酶作為生物催化劑，因其催化效率高、專一性強。反應條件溫和而受到廣泛的關注和應用，與生物體的生長、發(fā)育、繁殖等生命活動有著密切的聯系。但由于天然酶的制備和純化成本高、操作繁瑣，價格昂貴，并且容易受到各種物理、化學因素的影響而失去活性，使其實際應用受到極大限制。納米人工模擬酶相較于天然酶在高溫、極端pH、高鹽濃度等惡劣環(huán)境下依然能保持良好的催化活性，并且具有結構穩(wěn)定、經濟、易于大規(guī)模制備以及可調催化活性等優(yōu)點，使納米人工模擬酶成為生物醫(yī)學應用中的有前景的工具。

過氧化物酶是由微生物或植物所產生的一類氧化還原酶，在許多生物系統(tǒng)中起關鍵作用，并且是生物分析和臨床化學中的重要工具。過氧化氫是生化反應中重要的中間產物，所以對過氧化氫及其相關物質的精確測定具有重要意義。天然過氧化物酶及其模擬物通常在酸性或中性條件下發(fā)揮最佳性能。然而，在堿性條件下進行的研究很少。因此，堿性過氧化物酶模擬物的發(fā)現對于實際應用具有重要意義。

本發(fā)明基于納米氧化銅作為模擬堿性過氧化物酶，在堿性條件下催化過氧化氫氧化對羥基苯丙酸產生二聚體熒光產物，提供一種以納米氧化銅為催化劑測定過氧化氫的熒光分析方法。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是基于納米氧化銅作為模擬堿性過氧化物酶，在堿性條件下催化過氧化氫氧化對羥基苯丙酸產生二聚體熒光產物，提供一種以納米氧化銅為催化劑測定過氧化氫的熒光分析方法。

為了實現上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：所述一種納米氧化銅模擬堿性過氧化物酶，其特征是納米氧化銅在堿性條件下催化過氧化氫氧化對羥基苯丙酸作為模擬堿性過氧化物酶；所述的納米氧化銅由如下步驟制得：1）取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；2）快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液10 ml，加完后繼續(xù)攪拌5分鐘，得到黑色氧化銅沉淀；3）將反應得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，即得納米氧化銅粉體。

所述的一種納米氧化銅模擬堿性過氧化物酶，其特征是將對羥基苯丙酸、過氧化氫、納米氧化銅溶液和磷酸鹽緩沖液四者混合溫浴反應，反應產物具有熒光，最大激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為320 nm和409 nm。

納米氧化銅模擬堿性過氧化物酶最佳活性pH值為10.1~10.3。

納米氧化銅對底物對羥基苯丙酸的米氏常數為0.68 mmol/L，對底物過氧化氫的米氏常數為5.4 mmol/L。

本發(fā)明基于納米氧化銅模擬堿性過氧化物酶測定過氧化氫的熒光分析方法，其特征是將對羥基苯丙酸、過氧化氫、納米氧化銅溶液和磷酸鹽緩沖液四者混合溫浴反應，測定熒光強度。

上述的納米氧化銅由如下步驟制得：1）取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；2）快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液10 ml，加完后繼續(xù)攪拌5分鐘，得到黑色氧化銅沉淀；3）將反應得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，即得納米氧化銅粉體。

所述的一種基于納米氧化銅模擬堿性過氧化物酶測定過氧化氫的熒光分析方法，其特征是將50 μL不同濃度的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸，200 μL濃度為2mg/L的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L、pH為10.25的磷酸鹽緩沖溶液中，混合液在65 ℃溫浴，45分鐘后分別測定其在409 nm處的熒光強度，激發(fā)波長為320 nm，以熒光強度對過氧化氫濃度作圖得到標準曲線。

熒光強度與過氧化氫濃度在0.05~0.4 mmol/L范圍內呈線性關系，檢測限為0.81 μmol/L。

所述的熒光反應體系的pH值優(yōu)選為10.25，氧化銅濃度優(yōu)選為0.4mg/L，對羥基苯丙酸濃度優(yōu)選為4mmol/L。

所述的熒光反應溫度優(yōu)選為65℃，反應時間優(yōu)選為45分鐘。

本發(fā)明的技術方案具體步驟如下：

（一）納米氧化銅的制備：

取醋酸銅溶液和冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰，快速加入氫氧化鈉溶液，加完后，繼續(xù)攪拌后，得到黑色氧化銅。將反應得到的黑色氧化銅立即離心，用無水乙醇洗滌，減壓干燥，即得納米氧化銅粉體。將納米氧化銅粉體分散于二次蒸餾水中得到棕色納米氧化銅膠體溶液。

納米氧化銅具體制備步驟如下：

（1）取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；

（2）快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液10 ml，加完后繼續(xù)攪拌5分鐘，得到黑色氧化銅沉淀；

（3）將反應得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，即得納米氧化銅粉體。

（二）過氧化氫的測定

在EP管中依次加入過氧化氫溶液、對羥基苯丙酸、納米氧化銅、磷酸鹽緩沖液，將混合液放入65 ℃水浴。45分鐘后測定其熒光強度，以熒光強度對過氧化氫濃度作圖得到標準曲線以用于測定過氧化氫。

本發(fā)明的優(yōu)點：

本發(fā)明納米氧化銅模擬堿性過氧化物酶，在堿性條件下催化過氧化氫氧化對羥基苯丙酸產生二聚體熒光產物，納米氧化銅對底物對羥基苯丙酸的親和力高于辣根過氧化物酶。本發(fā)明納米氧化銅模擬堿性過氧化物酶可用于過氧化氫的熒光分析，測定過氧化氫的線性范圍為0.05~0.4 mmol/L，其檢測限為0.81 μmol/L，具有靈敏度高，樣品需求量少，重現性好，成本低等優(yōu)點。。

附圖說明

圖1為反應體系的熒光光譜圖。

圖2為pH值對熒光強度的影響圖。

圖3為反應溫度對熒光強度的影響圖。

圖4為反應時間對熒光強度的影響圖。

圖5為納米氧化銅濃度對熒光強度的影響圖。

圖6為對羥基苯丙酸濃度對熒光強度的影響圖。

圖7為納米氧化銅對于對羥基苯丙酸的穩(wěn)態(tài)動力學曲線圖。

圖8為納米氧化銅對于過氧化氫的穩(wěn)態(tài)動力學曲線圖。

圖9為過氧化氫的標準曲線圖。

具體實施方式

以下通過實施例對本發(fā)明做進一步說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

實例1：

納米氧化銅具體制備步驟如下：（1）取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；（2）快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液10 ml，加完后繼續(xù)攪拌5分鐘，得到黑色氧化銅沉淀；（3）將反應得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，即得直徑為6 nm的納米氧化銅粉體。

實例2：

將50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸和200 μL濃度為2mg/L的實例1制備的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合搖勻后置于65℃溫浴，45分鐘后測定其熒光光譜。如圖1所示，熒光產物激發(fā)波長為320 nm，發(fā)射波長為409 nm。

實例3：

將50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸和200 μL濃度為2mg/L的實例1制備的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L不同pH的磷酸鹽緩沖溶液（pH 9～11）中，混合搖勻后置于65℃溫浴，45分鐘后測定其在409 nm處的熒光強度（激發(fā)波長為320 nm）。如圖2所示，熒光強度在pH為10.1~10.3之間達到最大值。

實例4：

將50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸和200 μL濃度為2mg/L的實例1制備的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合搖勻后置于不同溫度水?。?5℃～85℃）溫浴，45分鐘后測定其在409 nm處的熒光強度（激發(fā)波長為320 nm）。如圖3所示，熒光強度在65℃時達到最大值。

實例5：

將50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸和200 μL濃度為2mg/L的實例1制備的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合搖勻后置于65℃溫浴，反應不同時間（0~75分鐘）后測定其在409 nm處的熒光強度（激發(fā)波長為320 nm）。如圖4所示，熒光強度在45分鐘時達到最大值。

實例6：

將50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸和200 μL不同濃度的實例1制備的納米氧化銅溶液（0～5 mg/L）加入到700 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合搖勻后置于65℃溫浴，45分鐘后測定其在409 nm處的熒光強度（激發(fā)波長為320 nm）。如圖5所示，熒光強度隨混合液中納米氧化銅濃度增大而增大并在終濃度為0.4 mg/L時達到最大。

實例7：

將50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL不同濃度的對羥基苯丙酸（0～80 mmol/L）和200 μL濃度為2mg/L的實例1制備的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合搖勻后置于65℃溫浴，45分鐘后測定其在409 nm處的熒光強度（激發(fā)波長為320 nm）。如圖6所示，熒光強度隨混合液中對羥基苯丙酸濃度增大而增大，在終濃度為3.5 mmol/L時，熒光強度達到最大值。

實例8：

將50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL不同濃度的對羥基苯丙酸（0～60 mmol/L）和200 μL濃度為2 mg/L的實例1制備的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合搖勻后置于37℃溫浴，1分鐘后測定其在409 nm處的熒光強度（激發(fā)波長為320 nm），計算初速度。通過米氏方程擬合，可以得出納米氧化銅對底物對羥基苯丙酸的米氏常數為0.68 mmol/L（見圖7）。

實例9：

將50 μL不同濃度的過氧化氫溶液（1～120 mmol/L），50 μL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸和200 μL濃度為2mg/L的實例1制備的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合搖勻后置于37℃溫浴，1分鐘后測定其在409 nm處的熒光強度（激發(fā)波長為320 nm），計算初速度。通過米氏方程擬合，可以得出納米氧化銅對底物過氧化氫的米氏常數為5.4 mmol/L（見圖8）。

實例10：

將50 μL不同濃度的過氧化氫溶液（0～8 mmol/L），50 μL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸和200 μL濃度為2mg/L的實例1制備的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合搖勻后置于65℃溫浴，45分鐘后測定其在409 nm處的熒光強度（激發(fā)波長為320 nm），以熒光強度對過氧化氫濃度作圖得到標準曲線。如圖9所示，熒光強度與過氧化氫濃度在0.05~0.4 mmol/L范圍內呈線性關系，檢測限為0.81 μmol/L。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改，等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。