專利名稱：神經(jīng)干細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)的制作方法
本申請(qǐng)是1994年11月14日申請(qǐng)的U.S.Ser.No.08/338,730的部分繼續(xù)申請(qǐng)。
在分裂旺盛的組織，如產(chǎn)生血細(xì)胞的骨髓中存在著特化的細(xì)胞，即干細(xì)胞。干細(xì)胞的關(guān)鍵性鑒定特征是其具有自我更新或產(chǎn)生更多自身細(xì)胞的能力。一個(gè)干細(xì)胞的最簡(jiǎn)單定義為具自我維持能力的一個(gè)細(xì)胞。一種較為嚴(yán)格的(但仍然是簡(jiǎn)化的)干細(xì)胞的定義是由Potten和Loeffler[“發(fā)育”Development)，1101001(1990)]提出的，他們把干細(xì)胞定義為“具有下列功能的未分化細(xì)胞a)增殖，b)自我維持，c)產(chǎn)生大量分化的具功能的子代，d)受傷后再生組織，和e)靈活運(yùn)用這些選擇。
干細(xì)胞分裂產(chǎn)生子代，即前體細(xì)胞。前體細(xì)胞包含新的干細(xì)胞和祖細(xì)胞。新的干細(xì)胞能夠再分裂，產(chǎn)生更多的干細(xì)胞，保證其自身維持和產(chǎn)生更多的祖細(xì)胞。祖細(xì)胞能夠進(jìn)行有限的增殖，其所有子代最終經(jīng)過(guò)非可逆分化成為無(wú)絲分裂的功能細(xì)胞。

圖1示干細(xì)胞、祖細(xì)胞和分化細(xì)胞之間的相互關(guān)系。
干細(xì)胞的作用是替換那些由于自然的細(xì)胞死亡、損傷或疾病而失去的細(xì)胞。特殊類型組織中出現(xiàn)的干細(xì)胞通常與那些含有高轉(zhuǎn)換率細(xì)胞的組織相關(guān)。然而這一相關(guān)性并非總是如此，因?yàn)楦杉?xì)胞被認(rèn)為出現(xiàn)在一些組織，如肝臟中[Travis，“科學(xué)(Science)，2591829(1989)]，而這些組織中細(xì)胞并不具高轉(zhuǎn)換率。
最典型的干細(xì)胞系統(tǒng)是造血干細(xì)胞。有證據(jù)表明位于骨髓的一個(gè)單一的造血干細(xì)胞，能夠經(jīng)過(guò)一系列祖細(xì)胞形成所有的血細(xì)胞譜系。1991年10月29日授權(quán)的美國(guó)專利5,061,620提供了一種分離、再生和利用造血干細(xì)胞的方法。出生前，造血干細(xì)胞在許多部位，包括胎兒卵黃囊、骨髓、肝和脾中處于活躍狀態(tài)；即將出生時(shí)，骨髓成為血細(xì)胞生長(zhǎng)的主要部位，肝臟和脾臟中的造血干細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，并且只有當(dāng)骨髓中造血干細(xì)胞的活性被抑制或出現(xiàn)大范圍血細(xì)胞破壞時(shí)，肝、脾中造血干細(xì)胞才重新開(kāi)始產(chǎn)生血細(xì)胞。
成體哺乳動(dòng)物CNS的分化細(xì)胞很少或不能進(jìn)入有絲分裂周期和產(chǎn)生新的神經(jīng)組織—基本上所有的神經(jīng)發(fā)生出現(xiàn)在出生前和出生后不久階段。雖然人們認(rèn)為星形細(xì)胞的轉(zhuǎn)換有限而且緩慢[Korr等，“比較神經(jīng)病學(xué)雜志”(J.Comp.Neurol.)150169(1971)]，并且出現(xiàn)能導(dǎo)致少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞[Wolsqijk和Noble，“發(fā)育”(Development)，105386-698(1989)]，但并不能正常產(chǎn)生新的神經(jīng)元。然而，大鼠在有限的成體腦部位，如齒狀回和嗅球[Kaplan，“比較神經(jīng)病學(xué)雜志”(J.Comp.Neurol.)，195323(1987)；Bayer，S.A.“紐約科學(xué)院”(NY.Acad.Sci.)，457163-172(1985)]中具有產(chǎn)生新的神經(jīng)元的有限的能力，但這并不出現(xiàn)于所有的哺乳動(dòng)物中；并且在成體靈長(zhǎng)類中也沒(méi)有新的神經(jīng)元的產(chǎn)生[Rakic，P.“科學(xué)”(Science)，2271054(1985)]。在多數(shù)哺乳動(dòng)物(特別是靈長(zhǎng)類)中這種不能產(chǎn)生新的神經(jīng)元細(xì)胞的特性對(duì)長(zhǎng)期的記憶保留可能是有利的，但是當(dāng)需要替代由于損傷或疾病而失去的神經(jīng)細(xì)胞時(shí)，這成了一種明顯的缺陷。
哺乳動(dòng)物CNS中細(xì)胞的低轉(zhuǎn)換，以及成體哺乳動(dòng)物CNS在受傷或疾病后細(xì)胞損失情況下不能相應(yīng)地產(chǎn)生新細(xì)胞的特性，導(dǎo)致人們認(rèn)為成體哺乳動(dòng)物CNS不含干細(xì)胞。然而最近從CNS中分離到在體外具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞。這種細(xì)胞出現(xiàn)在從胚胎[Reynolds等，“神經(jīng)科學(xué)雜志”(J.Neurosci.)124565(1992)]至成體[Reynolds和Weiss，“科學(xué)”(Science)，2551707(1992)]，表明了成體CNS雖然相應(yīng)于損傷或疾病并不產(chǎn)生新細(xì)胞，但它能夠以類似于造血系統(tǒng)的方式產(chǎn)生新細(xì)胞和通過(guò)干細(xì)胞及其子代的增殖和分化修復(fù)自身。最近的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在成體腦室的室管膜下襯墊質(zhì)中存在著相對(duì)靜止的干細(xì)胞群(Moreshead等，“神經(jīng)元”(Neuron)，Vol.13(5)1071-1082(1994))。在神經(jīng)損傷或疾病狀態(tài)下，這些干細(xì)胞假如經(jīng)適當(dāng)刺激，能成為替代細(xì)胞的來(lái)源。
造血干細(xì)胞以及肝、腸和皮膚中的干細(xì)胞系統(tǒng)的存活、擴(kuò)展和增殖，已被證實(shí)受許多不同營(yíng)養(yǎng)因子的控制。例如在造血系統(tǒng)中，紅細(xì)胞生成素和糖蛋白CSF(集落刺激因子)以及各種白細(xì)胞介素已被確定為調(diào)節(jié)干細(xì)胞功能的因子[Metcalf，D.，“生物測(cè)定”(Bioassays)，14(12)799-805(1992)]。
通過(guò)對(duì)營(yíng)養(yǎng)因子在神經(jīng)細(xì)胞在胚胎發(fā)育過(guò)程中作用的研究表明在出生前神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中有內(nèi)源性產(chǎn)生物質(zhì)，如血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGFα)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)參與作用。例如一種胚胎神經(jīng)祖細(xì)胞，即0-2A細(xì)胞能產(chǎn)生少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和2型星形細(xì)胞。在PDGF存在下，0-2A細(xì)胞分裂并經(jīng)幾次分裂分化成少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。加入CNTF和底物因子，而不加PDGF，能夠促進(jìn)0-2A祖細(xì)胞分化成I型星形細(xì)胞[Raff等，“自然”(Nature)(Lond.)，303390-396(1983)]。bFGF使發(fā)育成神經(jīng)元的胚胎祖細(xì)胞的增殖增加2倍[(Gensberger等，“歐洲生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)通訊”(FEB Lett.)，2171-5(1987)]。Cattaneo和Mckay(1990)的結(jié)果顯示將生長(zhǎng)因子一起加入或以先后方式加入時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生新的效應(yīng)，而這種效應(yīng)在將這些因子單獨(dú)加入時(shí)見(jiàn)不到。他們證明了只有將成神經(jīng)細(xì)胞先用bFGF處理后，NGF才能刺激其增殖而產(chǎn)生神經(jīng)元[Cattaneo，E.和Mckay，R.“自然”(Nature)，347762-765(1990)]。bFGF也顯示出能夠影響PDGF受體的表達(dá)和在PDGF存在下阻斷0-2A祖細(xì)胞的分化[Mckinnon等，“神經(jīng)元”(Neuron)，5603-614(1990)]。EGF或TGFα顯示出對(duì)生長(zhǎng)于培養(yǎng)物中的胚胎視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮細(xì)胞具有一定的促細(xì)胞分裂作用，結(jié)果使在生長(zhǎng)因子持續(xù)存在下的祖細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)元，而不產(chǎn)生膠質(zhì)細(xì)胞[Anchan等，“神經(jīng)元”(Neuron)，6923-936(1991)]。在同一研究中，他們報(bào)道了在衍生于出生后大鼠神經(jīng)上皮的培養(yǎng)物中出現(xiàn)神經(jīng)元和Muller細(xì)胞。
CNS疾病包括很多種，如神經(jīng)變性疾病(象Alzheimer病和帕金森疾病)、急性腦損傷(如中風(fēng)、頭部受傷、大腦性麻痹)和大量與CNS機(jī)能障礙有關(guān)的疾病(如抑郁、癲病和精神分裂癥)。最近幾年由于對(duì)這些疾病危險(xiǎn)性最大的老年人口的增長(zhǎng)，神經(jīng)變性疾病已成為一個(gè)重要問(wèn)題。這些疾病，其中包括Alzheimer疾病、多發(fā)性硬化、Huntington舞蹈病、肌萎縮性側(cè)索硬化和帕金森疾病。這些疾病被認(rèn)為與CNS特定部位的神經(jīng)細(xì)胞的變性有關(guān)，它們會(huì)導(dǎo)致這些細(xì)胞或腦部位不能執(zhí)行其應(yīng)當(dāng)執(zhí)行的功能。除了神經(jīng)變性疾病以外，急性腦損傷常常導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損失、受影響腦部位的功能不良以及隨之而來(lái)的行為異常。CNS機(jī)能障礙的最常見(jiàn)類型(按照受影響人數(shù))的特征不是神經(jīng)細(xì)胞的損失，而是現(xiàn)存的神經(jīng)細(xì)胞功能異常。這可能是由于神經(jīng)元不恰當(dāng)?shù)募ぐl(fā)，或者是由于神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放和加工的異常。對(duì)其中一些機(jī)能障礙進(jìn)行了充分研究，它們是典型的疾病，如抑郁和癲癇，其他的則是研究較少的疾病，如神經(jīng)官能癥和精神病。
到目前為止，治療CNS疾病主要是通過(guò)用藥物化合物進(jìn)行。然而，這種治療伴隨著許多問(wèn)題，包括轉(zhuǎn)運(yùn)藥物通過(guò)血-腦屏障的能力有限和病人長(zhǎng)期使用這些藥物獲得的藥物耐受性。例如用左旋多巴使帕金森病人的多巴胺能的活性獲得部分恢復(fù)，該藥物是一種能穿過(guò)血-腦屏障的多巴胺前體。但病人會(huì)對(duì)左旋多巴的作用產(chǎn)生耐受性，因而需要逐漸增加劑量以維持其功效。此外，有許多副作用與左旋多巴相關(guān)，如運(yùn)動(dòng)的增加和無(wú)法控制的運(yùn)動(dòng)。
治療神經(jīng)疾病的一項(xiàng)新興技術(shù)需要將細(xì)胞植入CNS，以替代或補(bǔ)償宿主神經(jīng)細(xì)胞的損失或功能異常。雖然胚胎CNS細(xì)胞在人體試驗(yàn)中獲得了最佳結(jié)果[Winder等，“新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志”(New Eng.J.Med.)3271556(1992)]，并且是優(yōu)選的供體組織，但是倫理上和政治上所需考慮的問(wèn)題以及大量組織的可獲得性限制了這種細(xì)胞的應(yīng)用。人們正在研究用于治療CNS疾病的其他類型供體組織。其中包括經(jīng)遺傳修飾的神經(jīng)細(xì)胞系[Renfranz等，“細(xì)胞”(Cell)，66173(1991)；Synder等，“細(xì)胞”(Cell)，681(1992)]、成纖維細(xì)胞[Kawaja等，“神經(jīng)科學(xué)雜志”(J.Neurosci.)122849(1992)]、肌肉細(xì)胞[Jiao等，“自然”(Nature)，363456(1993)]、膠質(zhì)祖細(xì)胞[Groves等，“自然”(Nature)362453(1993)]和包在莢膜內(nèi)的細(xì)胞[Hoffman等，“實(shí)驗(yàn)神經(jīng)病學(xué)”(Exp.Neurol.)，132100(1993)]。
盡管移植法比現(xiàn)有的治療神經(jīng)疾病的方法有顯著的進(jìn)步，但這項(xiàng)技術(shù)尚未完善。例如，在移植時(shí)有些類型細(xì)胞不能整合到宿主CNS組織中。特別地，用非神經(jīng)元原代細(xì)胞培養(yǎng)物會(huì)限制所移植的材料與宿主組織之間建立聯(lián)系的能力。從原始神經(jīng)組織中獲得的永生化供體細(xì)胞能夠形成連接，但是整合入這些轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的癌基因的表達(dá)難以控制，因而會(huì)產(chǎn)生腫瘤和其他并發(fā)癥。供體和宿主會(huì)產(chǎn)生對(duì)移植入細(xì)胞的排斥。也存在著移植的細(xì)胞導(dǎo)致腫瘤形成或?qū)魅拘晕镔|(zhì)從供體組織傳到宿主的潛在可能。
Gage等在美國(guó)專利5,082,670中公開(kāi)了一種將遺傳修飾的神經(jīng)細(xì)胞移植至適當(dāng)CNS部位，以治療缺損、疾病或CNS細(xì)胞的損害。這一專利中公開(kāi)的供體細(xì)胞取自非神經(jīng)元的原代培養(yǎng)物，但建議遺傳轉(zhuǎn)化的神經(jīng)細(xì)胞可以使用。這些供體細(xì)胞有著內(nèi)在問(wèn)題。Gage等認(rèn)識(shí)到用于他們技術(shù)中供體細(xì)胞所帶來(lái)的局限性，并且承認(rèn)存在著“…復(fù)制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的缺乏…”。他們也承認(rèn)，“非復(fù)制神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)病毒感染的抗性”。這后一論點(diǎn)概括了與試圖應(yīng)用現(xiàn)有技術(shù)方法進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞遺傳修飾相關(guān)的困難，這些神經(jīng)細(xì)胞除了取自胚胎組織的以外，在正常情況下不能促細(xì)胞分裂。這一技術(shù)本質(zhì)上具有組織排斥的潛在可能。在理想情況下，遺傳修飾的移植細(xì)胞應(yīng)該為自體的，因而可防止免疫并發(fā)癥—即如果病人自身靜止的神經(jīng)干細(xì)胞能經(jīng)遺傳修飾和/或刺激，在體外分裂和分化成新的神經(jīng)細(xì)胞，然后被植入以替代失去的或受傷的神經(jīng)組織，那么這將是有益的。
現(xiàn)在為人所知的在其一生中都存在于哺乳動(dòng)物腦中的多潛能神經(jīng)干細(xì)胞[Reynolds和Weiss，“科學(xué)”(Science)，2551707(1992)]提供了非轉(zhuǎn)化神經(jīng)細(xì)胞的一種來(lái)源，這種非轉(zhuǎn)化神經(jīng)細(xì)胞在生長(zhǎng)因子，如表皮生長(zhǎng)因子的存在下經(jīng)刺激成為具有絲分裂活性。在培養(yǎng)物中，神經(jīng)干細(xì)胞可被誘導(dǎo)增殖并提供大量未分化的神經(jīng)細(xì)胞。這些未分化的神經(jīng)細(xì)胞能夠分化成主要類型的神經(jīng)細(xì)胞，并且能被移植、遺傳修飾，然后移植或用于藥物篩選或其他目的。
為了能夠增加、減少或以其他方式改變神經(jīng)干細(xì)胞和/或其子代有絲分裂活性，能夠在體外調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞增殖將是一個(gè)有利方面。增加靜止神經(jīng)干細(xì)胞有絲分裂的活性有一顯著的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榭捎糜谝浦?、遺傳修飾、藥物篩選等的子代數(shù)量將會(huì)增加。這也有利于測(cè)定體外生長(zhǎng)的、在增殖誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子存在下進(jìn)行增殖的神經(jīng)干細(xì)胞是如何被調(diào)節(jié)而使增殖的數(shù)量下降。這一資料可用于在體內(nèi)調(diào)節(jié)增殖誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子，如見(jiàn)1993年11月9日申請(qǐng)的U.S.Ser.No.08/149,508中所公開(kāi)的那些。這不僅有利于調(diào)節(jié)那些在一種生長(zhǎng)因子或幾種生長(zhǎng)因子結(jié)合作用下成為具有絲分裂活性的神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量，而且有利于調(diào)節(jié)這些干細(xì)胞的前體子代的有絲分裂速率。
效應(yīng)于腦或脊髓組織的損傷會(huì)發(fā)生神經(jīng)膠質(zhì)增生。這一過(guò)程所產(chǎn)生的膠質(zhì)瘢痕被認(rèn)為可能會(huì)阻止神經(jīng)元軸突重新建立穿過(guò)受傷部位的連接，因而阻礙了功能的恢復(fù)。在傷口部位和最接近傷口的一定距離處都能進(jìn)行增殖的星形細(xì)胞是膠質(zhì)瘢痕的主要細(xì)胞組成部分(Reier，P.J.“星形細(xì)胞”(Astrocytes)Vol.3263-323(1986))。效應(yīng)于損傷的神經(jīng)干細(xì)胞和其子代的增殖可能是神經(jīng)膠質(zhì)增生產(chǎn)生的一個(gè)因素。如果在損傷部位神經(jīng)膠質(zhì)增生的程度能夠減輕，那么神經(jīng)修復(fù)會(huì)得到增強(qiáng)。
能夠通過(guò)阻止或減低有絲分裂活性以減少神經(jīng)膠質(zhì)增生將是有利的，這將導(dǎo)致在傷口附近星形細(xì)胞數(shù)目的增加。減弱神經(jīng)干細(xì)胞和/或其子代效應(yīng)于傷口誘導(dǎo)信號(hào)的增殖能力，可能成為限制膠質(zhì)瘢痕形成的一種方法。被分離的軸突穿過(guò)受傷部位重新建立連接的增加將會(huì)提高神經(jīng)修復(fù)過(guò)程的質(zhì)量和恢復(fù)功能。
鑒于前面提到的伴隨著用于移植或其他用途的CNS細(xì)胞來(lái)源的缺陷，很明顯在本技術(shù)領(lǐng)域存在著一種對(duì)可靠方法的需求，使這些方法能夠培養(yǎng)大量的從人和非人來(lái)源的胚胎和成體神經(jīng)細(xì)胞，而這些細(xì)胞未經(jīng)插入癌基因有意識(shí)地使其永生化以誘導(dǎo)其無(wú)限增殖，因而這消除了對(duì)細(xì)胞正常的功能遺傳改變影響的任何問(wèn)題。在某些情況下，也需要能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞在體外和體內(nèi)的增殖。
因而本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了一種方法，它通過(guò)加入特定的生物因子，如生長(zhǎng)因子或這些因子的組合，以改變干細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基從而在體外調(diào)節(jié)CNS干細(xì)胞的增殖。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是為體內(nèi)調(diào)節(jié)CNS干細(xì)胞的增殖提供了一種方法和治療組合物。這一組合物包括特定的生物因子，如生長(zhǎng)因子或這些因子的組合，將它們注入CNS的室系統(tǒng)以調(diào)節(jié)干細(xì)胞增殖。
對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域熟練人員來(lái)說(shuō)，根據(jù)以下詳細(xì)描述和附加的權(quán)利要求，本發(fā)明這些目的連同其他的目的以及其特征是顯而易見(jiàn)的。
所有參考文獻(xiàn)不能被認(rèn)為是所要求保護(hù)的本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容，它應(yīng)被認(rèn)為是現(xiàn)有技術(shù)。提供的參考文獻(xiàn)用作背景材料。
本發(fā)明描述了一種調(diào)節(jié)體外增殖多潛能神經(jīng)干細(xì)胞和/或增殖所述神經(jīng)干細(xì)胞子代的方法。該方法包括以下步驟解離含有至少一個(gè)多潛能神經(jīng)干細(xì)胞的哺乳動(dòng)物神經(jīng)組織，這一多潛能神經(jīng)干細(xì)胞能夠產(chǎn)生出具分化成神元、星形細(xì)胞和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞能力的子代；并且在含有至少一種增殖因子和一種調(diào)節(jié)因子的培養(yǎng)基中增殖多潛能神經(jīng)干細(xì)胞，其中的增殖因子能夠誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖，而調(diào)節(jié)因子可以調(diào)節(jié)多潛能神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和/或這種多潛能神經(jīng)干細(xì)胞子代的增殖。
此外，本發(fā)明還描述了調(diào)節(jié)體內(nèi)增殖多潛能神經(jīng)干細(xì)胞和/或增殖所述神經(jīng)干細(xì)胞子代的一種方法和組合物。這一方法包括將一種治療組合物輸送到室的部位，該組合物至少含有一種能對(duì)多潛能神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和/或?qū)Χ酀撃苌窠?jīng)干細(xì)胞的子代增殖有調(diào)節(jié)作用的因子。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，增殖因子是bFGF，調(diào)節(jié)因子是EGF或硫酸乙酰肝素，它們能增加干細(xì)胞子代增殖率。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，含有抑制神經(jīng)干細(xì)胞增殖的一種因子或幾種因子結(jié)合的治療組合物是通過(guò)體內(nèi)應(yīng)用以減少細(xì)胞的增殖。
圖1說(shuō)明多潛能神經(jīng)干細(xì)胞增殖的示意圖。(A)在增殖因子存在下，干細(xì)胞分裂并且產(chǎn)生由更多干細(xì)胞和祖細(xì)胞組成的未分化細(xì)胞球。(B)當(dāng)來(lái)源于無(wú)性繁殖的未分化的細(xì)胞球被解離并且以單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行植板時(shí)，在非粘附性基質(zhì)上并且有增殖因子存在時(shí)，每個(gè)干細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一個(gè)新的球體。(C)如果將球體培養(yǎng)在可以進(jìn)行分化的條件下，祖細(xì)胞會(huì)分化成神經(jīng)元、星形細(xì)胞和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
圖2(A)培養(yǎng)在20ng/mgl EGF中10天的神經(jīng)球照片(放大100倍)。(B)培養(yǎng)在20ng/ml FGF中10天的神經(jīng)球照片(放大100倍)。(C)培養(yǎng)在20ng/mlEGF+20ng/ml FGF中10天的神經(jīng)球照片(放大100倍)。
圖3在20ng/ml EGF+20ng/ml FGF或20ng/ml FGF+2μg/ml硫酸乙酰肝素存下，來(lái)源于成體小鼠脊髓的頸、胸和腰區(qū)的初級(jí)細(xì)胞所產(chǎn)生的神經(jīng)球數(shù)目圖。
本發(fā)明是基于調(diào)節(jié)和控制多潛能神經(jīng)干細(xì)胞增殖的方法和組合物的研制，并且目的在于調(diào)節(jié)體外或體內(nèi)生長(zhǎng)的多潛能干細(xì)胞所衍生的子代數(shù)目。在此所用的“神經(jīng)干細(xì)胞”或“中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)干細(xì)胞”是指來(lái)自神經(jīng)組織的相對(duì)靜止的未分化干細(xì)胞，它能增殖而產(chǎn)生更多的神經(jīng)干細(xì)胞(因而保證其身維持)和祖細(xì)胞?！岸酀撃堋笔侵改軌虍a(chǎn)生子代的神經(jīng)干細(xì)胞，該子代細(xì)胞能夠產(chǎn)生各類主要的分化神經(jīng)細(xì)胞，即神經(jīng)元、星形細(xì)胞和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。與之相比較，能產(chǎn)生兩種分化細(xì)胞的未分化細(xì)胞，如能產(chǎn)生少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞的0-2A細(xì)胞被稱為“雙潛能”，而只產(chǎn)生一種分化細(xì)胞的未分化細(xì)胞稱為“單潛能”。
“祖細(xì)胞”也指衍生于神經(jīng)干細(xì)胞的一個(gè)未分化細(xì)胞，但它與干細(xì)胞的區(qū)別在于它具有有限的增殖能力而不能維持自身。每個(gè)神經(jīng)祖細(xì)胞的子代在適當(dāng)條件下將分化成神經(jīng)元、星形細(xì)胞(I型或II型)或少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是分化的膠質(zhì)細(xì)胞，它們?cè)谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)(CNS)中形成包圍軸突的髓鞘質(zhì)。少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的表型為半乳糖腦苷脂(+)、髓鞘質(zhì)堿性蛋白(+)和膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(-)[GalC(+)，MBP(+)，GFAP(-)]。神經(jīng)元指分化的神經(jīng)元細(xì)胞，其表型為神經(jīng)元特異性烯醇化酶(+)、神經(jīng)絲(+)、微管相關(guān)蛋白(+)或Tau-1(+)[NSE(+)，NF(+)，MAP-2(+)或Tau-1(+)]。星形細(xì)胞是表型為GFAP(+)、GalC(-)和MBP(-)的分化的膠質(zhì)細(xì)胞。
對(duì)CNS干細(xì)胞已有報(bào)道，其用途已有描述[Reynolds和Weiss，“科學(xué)”(Science)，2551707(1992)；Reynolds等，“神經(jīng)科學(xué)雜志”(J.Neurosci.)，124565(1992)；Reynolds和Weiss，“恢復(fù)神經(jīng)學(xué)和神經(jīng)科學(xué)”(RestorativeNeurology and Neuroscience)，4208(1992)；Reynolds和Weiss，“神經(jīng)細(xì)胞的死亡和修復(fù)”(Neuronal Cell Death and Repair)，Cuello，A.C.編，ElsevierScience，pp.247-255(1993)]。此外，這些細(xì)胞的應(yīng)用描述于公開(kāi)的PCT申請(qǐng)WO 93/01275，WO 94/16718，WO 94/10292和WO 94/09119中。如同存在于其他哺乳動(dòng)物組織中的干細(xì)胞一樣，CNS干細(xì)胞也能自我維持并產(chǎn)生大量的子代，包括新的干細(xì)胞和能夠分化成神經(jīng)元，星形細(xì)胞和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞。
CNS干細(xì)胞可以根據(jù)Reynolds和Weiss[“科學(xué)”(Science)，2551707(1992)]的方法、上述作為參考的公開(kāi)的PCT申請(qǐng)和以下實(shí)施例1所述的方法從任何出生前或出生后哺乳動(dòng)物CNS組織中分離和培養(yǎng)。多潛能CNS干細(xì)胞出現(xiàn)在各CNS區(qū)中，包括脊髓圓錐、脊髓的頸、胸和腰區(qū)、腦干、紋狀體和下丘腦。這些神經(jīng)干細(xì)胞能從上述各區(qū)的組織中獲得，并能在體外經(jīng)誘導(dǎo)而分裂，它們能自我維持并產(chǎn)生大量的子代，包括神經(jīng)元、星形細(xì)胞和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
簡(jiǎn)而言之，多潛能神經(jīng)干細(xì)胞取自神經(jīng)組織并生長(zhǎng)在一種培養(yǎng)基上，這種培養(yǎng)基優(yōu)選為無(wú)血清培養(yǎng)基，它可以是含有已知的能維持細(xì)胞存活的物質(zhì)的任意結(jié)合。一種合適的無(wú)血清培養(yǎng)基，以下稱為“完全培養(yǎng)基”，包括Dulbecco氏改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)和F-12營(yíng)養(yǎng)混合液(Gibco)(1∶1)，葡萄糖(0.6％)，谷氨酰胺(2mM)，碳酸氫鈉(2mM)，HEPES(4-[2-羥乙基]-1-哌嗪乙磺酸)緩沖液(5mM)以及一種確定的激素混合液和鹽混合物(10％；可從Sigma獲得)。用該激素混合液和鹽混合物代替血清，其中含有胰島素(25μg/ml)、運(yùn)鐵蛋白(100μg/ml)、孕酮(20μM)、腐胺(60μM)和氯化硒(30nM)。向完全培養(yǎng)基中至少加入一種誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞增殖的生物因子。
這里所用的“生物因子”指對(duì)CNS細(xì)胞有作用的生物活性物質(zhì)，如一種蛋白質(zhì)、肽、核酸、生長(zhǎng)因子、類固醇或其他分子，可以是天然的或人造的，它對(duì)干細(xì)胞或干細(xì)胞子代有生長(zhǎng)、增殖、分化、營(yíng)養(yǎng)或調(diào)節(jié)作用(可以是單一作用或與其他生物因子聯(lián)合作用)。生物因子的例子包括生長(zhǎng)因子，如酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF、bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和類EGF的配位體、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGFα)、類胰島素生長(zhǎng)因子1(IGF-1)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)；營(yíng)養(yǎng)因子有腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、纖毛神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)和膠質(zhì)衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)；與生長(zhǎng)因子活性有關(guān)的胞內(nèi)途徑調(diào)節(jié)物有佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯、星形孢菌素、CGP-41251、酪氨酸磷酸化抑制劑等等；激素有活化素和促甲狀腺素釋放激素(TRH)；各種不同的蛋白質(zhì)和多肽例如有白介素、Bcl-2基因產(chǎn)物、成骨蛋白(BMP-2)和巨噬細(xì)胞發(fā)炎蛋白(MIP-1α、MIP-1β和MIP-2)；寡核苷酸例如有針對(duì)EGF受體、FGF受體等轉(zhuǎn)錄的反義鏈；類似肝素的分子例如有硫酸乙酰肝素；對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞或干細(xì)胞子代有作用的各種其他分子，包括雙調(diào)蛋白、視黃酸和腫瘤壞死因子α(TNFα)。
生物因子如EGF和bFGF，它們單獨(dú)對(duì)多潛能神經(jīng)干細(xì)胞能產(chǎn)生增殖作用，在此稱為“增殖因子”。通常增殖因子結(jié)合到一個(gè)細(xì)胞表面受體，而產(chǎn)生對(duì)增殖的誘導(dǎo)。優(yōu)選的增殖因子包括EGF、雙調(diào)蛋白、aFGF、bFGF、TGFα和將這些因子與其他生物因子，如硫酸乙酰肝素相結(jié)合。誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的特別優(yōu)選的結(jié)合是EGF和bFGF的結(jié)合。通過(guò)將增殖因子以約10pg/ml至500ng/ml濃度加入培養(yǎng)基中，優(yōu)選的濃度為約1ng/ml至100ng/ml。對(duì)EGF、aFGF和bFGF的最優(yōu)選濃度是每一增殖因子約20ng/ml。
干細(xì)胞可培養(yǎng)在任何培養(yǎng)容器中，例如96孔板或培養(yǎng)瓶。在增殖誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子或幾種因子相結(jié)合作用下，多潛能神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行分裂。在3-4天內(nèi)形成未分化的干細(xì)胞子代。這種干細(xì)胞子代，在此稱為“前體細(xì)胞”，包括新產(chǎn)生的多潛能干細(xì)胞和祖細(xì)胞。在體外，單個(gè)干細(xì)胞的子代典型地形成一個(gè)前體細(xì)胞簇，稱之為“神經(jīng)球”；但是，可以改變培養(yǎng)條件(如通過(guò)提供一種處理過(guò)的底物，其上附著增殖細(xì)胞)以使增殖細(xì)胞不形成典型的神經(jīng)球。前體細(xì)胞對(duì)任何神經(jīng)元的或膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記不具免疫反應(yīng)性，但對(duì)nestin有免疫反應(yīng)性，nestin是一種存在于未分化CNS細(xì)胞中的中間體絲狀蛋白[Lehndahl等，“細(xì)胞”(Cell)，60585-595(1990)]。
在增殖誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子的繼續(xù)存在下，神經(jīng)球內(nèi)的前體細(xì)胞繼續(xù)分裂而使神經(jīng)球增大，這是由于未分化細(xì)胞[nestin(+)，NF(-)，NSE(-)，GFAP(-)，MBP(-)]的數(shù)目增大。有可能在相同的或不同的生長(zhǎng)因子存在下對(duì)前體細(xì)胞進(jìn)行傳代，這些因子可使細(xì)胞進(jìn)一步增殖而不促進(jìn)其分化。采用增殖培養(yǎng)方法細(xì)胞能傳代30次或更多次，使前體細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增加。
上述體外增殖CNS干細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)可通過(guò)采用其他的生物因子或?qū)追N因子結(jié)合使用的方法進(jìn)行改進(jìn)，這些因子或因子的結(jié)合以某種其他方式增加、減少或改變了前體細(xì)胞的數(shù)目和特性，這些前體細(xì)胞獲自效應(yīng)于EGF或其他增殖因子的干細(xì)胞。增殖的變化是通過(guò)觀察形成的神經(jīng)球數(shù)目的增加或減少，和/或神經(jīng)球大小的增加或減小(它是增殖速率的反映—取決于每一種神經(jīng)球中前體細(xì)胞的數(shù)目)。因而這里所用的“調(diào)節(jié)因子”指對(duì)干細(xì)胞和/或前體細(xì)胞的增殖有調(diào)節(jié)作用的生物因子。例如，當(dāng)一種生物因子能夠增加或減少干細(xì)胞數(shù)目，而這種干細(xì)胞能夠效應(yīng)于一種增殖誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子(如EGF)在體外增殖，那么這種生物因子即可被認(rèn)為是一種“調(diào)節(jié)因子”?；蛘?，效應(yīng)于增殖誘導(dǎo)因子的干細(xì)胞數(shù)目可能維持相同，但加入調(diào)節(jié)因子影響到干細(xì)胞和干細(xì)胞子代增殖的速率。當(dāng)一種增殖因子與另一種增殖因子相結(jié)合使用時(shí)，它也可以作為一種調(diào)節(jié)因子。例如，在bFGF和EGF相結(jié)合作用下形成的神經(jīng)球顯著大于bFGF單獨(dú)作用下形成的神經(jīng)球，這表明干細(xì)胞和干細(xì)胞子代的增殖速率較高。
其他的調(diào)節(jié)因子例如包括硫酸乙酰肝素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)、活化素、成骨蛋白(BMP-2)、纖毛神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、視黃酸、腫瘤壞死因子α(TNFα)、巨噬細(xì)胞發(fā)炎蛋白(MIP-1α，MIP-1β和MIP-2)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、白介素和Bcl-2基因產(chǎn)物。結(jié)合到增殖因子轉(zhuǎn)錄物和其受體轉(zhuǎn)錄物的反義分子也能調(diào)節(jié)干細(xì)胞的增殖。其他的對(duì)干細(xì)胞增殖有調(diào)節(jié)作用的因子包括那些干擾c-fos途徑(一個(gè)立即早期基因，已知被EGF所激活)激活的因子，包括對(duì)c-fos途徑起正調(diào)節(jié)作用的佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯(PMA；Sigma)、星形孢菌素(Research Biochemical International)、負(fù)調(diào)節(jié)c-fos表達(dá)的CGP-41251(Ciba-Geigy)以及其他因子，如酪氨酸磷酸化抑制劑[Fallon，D.等，“分子細(xì)胞生物學(xué)”(Mol.Cell Biol.)11(5)2697-2703(1991)]等等，它們能通過(guò)將EGF與其受體結(jié)合誘導(dǎo)酪氨酸激酶活化的阻遇。
優(yōu)選的用于增加效應(yīng)于FGF的神經(jīng)干細(xì)胞子代增殖速率的調(diào)節(jié)因子為硫酸乙酰肝素和EGF。優(yōu)選的減少效應(yīng)于增殖因子的干細(xì)胞數(shù)目的調(diào)節(jié)因子為T(mén)GFβ族的成員、白介素、MIPs、PDGF、BMP-2、TNFα、視黃酸(10-6M)和CNTF。減小由增殖因子產(chǎn)生神經(jīng)球的體積的優(yōu)選因子為T(mén)GFβ族的成員、視黃酸(10-6M)和CNTF。
將調(diào)節(jié)因子以約10pg/ml至500ng/ml的濃度范圍加入培養(yǎng)基中，優(yōu)選濃度為約1ng/ml至100ng/ml。調(diào)節(jié)因子最優(yōu)選的濃度約10ng/ml。調(diào)節(jié)因子視黃酸從1mM母液進(jìn)行制備，使用的最終濃度在0.01μM至100μM之間，優(yōu)選為0.05-5μM。為降低EGF或bFGF對(duì)神經(jīng)球增殖作用優(yōu)選采用濃度約為1μM的視黃酸。反義鏈可以1-25μM的濃度使用。優(yōu)選的范圍是約2-7μM。用于增加增殖的PMA和相關(guān)的分子，可以采用約1μg/ml-500μg/ml的濃度，優(yōu)選的濃度約為10μg/ml-200μg/ml。糖胺聚糖-硫酸乙酰肝素是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面普遍存在的一種組分，已知它能影響各種細(xì)胞過(guò)程，并且結(jié)合生長(zhǎng)因子分子，如FGF和雙調(diào)蛋白，以此促進(jìn)這些分子與細(xì)胞表面的這些分子的受體相結(jié)合?？梢詫⑺约s1ng/ml-1mg/ml濃度加入培養(yǎng)基中，與其他生物因子相結(jié)合；更優(yōu)選的濃度為0.2μg/ml-20μg/ml，最優(yōu)選的濃度約為2μg/ml。
前體細(xì)胞可用于移植以治療各種神經(jīng)疾病，見(jiàn)PCT申請(qǐng)WO 93/01275，WO 94/16718，WO 94/10292和WO 94/09119所公開(kāi)的內(nèi)容。用于移植的細(xì)胞可從采用本領(lǐng)域所知的任何方法從培養(yǎng)基收獲，并移植至任何異常神經(jīng)癥狀或神經(jīng)變性癥狀的動(dòng)物中，這種動(dòng)物可以來(lái)自任何方式，包括來(lái)自因化學(xué)、電、機(jī)械或其他損傷，因?qū)嶒?yàn)抽取神經(jīng)部位或者因疾病或老化的動(dòng)物。
在用生物因子體內(nèi)調(diào)節(jié)患者正常靜止干細(xì)胞增殖之前，也可以用本文所公開(kāi)的方法試驗(yàn)生物因子對(duì)多潛能哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞體外增殖或調(diào)節(jié)作用。神經(jīng)干細(xì)胞可以取自神經(jīng)疾病患者，以測(cè)定生物因子對(duì)機(jī)能障礙、患病或受傷組織的增殖或調(diào)節(jié)作用。含有調(diào)節(jié)因子的治療組合物可以隨后制成以用于治療各種神經(jīng)障礙、疾病或損傷。組合物以生理學(xué)上可接受的制劑形式含有上述濃度的一種或多種調(diào)節(jié)因子。
治療組合物可以在體內(nèi)應(yīng)用，以調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。正常靜止的神經(jīng)干細(xì)胞遍布于靠近室區(qū)的CNS中。位于前腦內(nèi)的是側(cè)(第一和第二)室。第三室是前腦較低部分的一個(gè)腔，它連接位于菱腦的第四室。與前面提到的室結(jié)構(gòu)相連續(xù)的中央管是脊髓的室成份。
CNS干細(xì)胞位于組織襯墊的室中，它為這些細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)修飾和控制，以及最終治療影響CNS不同區(qū)域的各種神經(jīng)疾病、障礙和損傷提供了幾方面有利條件。因此可以設(shè)計(jì)對(duì)這些疾病的治療法，使得按此文所述方法在體內(nèi)控制或緩解受影響區(qū)域附近的干細(xì)胞包圍的室。這種室系統(tǒng)存在于幾乎所有腦部位，因而可以較容易接近受影響部位。如果想通過(guò)用含有一種生長(zhǎng)因子或病毒載體的組合物作用干細(xì)胞以修飾干細(xì)胞，那么移植能使組合物作用于室中的一個(gè)裝置相對(duì)較容易。例如，連接上一個(gè)滲透泵的套管可用于釋放組合物。或者，可將組合物直接注射入室中，這可以使CNS干細(xì)胞子代進(jìn)入由于受傷或疾病而損傷的部位。而且，室與許多腦部位之間的近距離使得由干細(xì)胞或其子代分泌的神經(jīng)劑能夠擴(kuò)散。
導(dǎo)致形成神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕組織的神經(jīng)膠質(zhì)增生，是由于對(duì)CNS組織的損傷造成的。這種瘢痕組織被認(rèn)為對(duì)軸突的長(zhǎng)出和切斷成分的重新連接有主要的抑制作用，因而阻止了腦或脊髓受傷后的功能恢復(fù)。盡管星形細(xì)胞不是CNS瘢痕組織的唯一組分，但它是有關(guān)的主要成分之一。(Reier，P.J.“星形細(xì)胞”(Astrocytes)，Vol.3263-323(1986))。神經(jīng)膠質(zhì)增生可能是由于，至少部分是由于以前的靜止干細(xì)胞的增殖。在CNS受傷之后，對(duì)室系統(tǒng)采用已知能抑制神經(jīng)干細(xì)胞增殖的一種因子將是有利的，它通過(guò)減少能產(chǎn)生星形細(xì)胞的干細(xì)胞子代的增殖而使在受傷部位的瘢痕組織的形成減少，并且使軸突成分重新連接的狀況得到改善，優(yōu)選的抑制因子為BMP-2。
實(shí)施例1衍生于胚胎腦組織的多潛能CNS干細(xì)胞的體外增殖-效應(yīng)于EGF的神經(jīng)球增殖通過(guò)無(wú)菌操作將胚胎期第14天(E14)的CD1白化病小鼠(Charles River)斷頭并取腦和紋狀體。將組織用火焰加工光滑的巴斯德吸管機(jī)械解離到完全培養(yǎng)基中。細(xì)胞在800r.p.m.下離心5分鐘，吸取上清液，將細(xì)胞重新懸浮于完全培養(yǎng)基中以便計(jì)數(shù)。
將細(xì)胞的25,000細(xì)胞/ml的密度懸浮于含有20ng/ml EGF的完全培養(yǎng)基中。用Eppendorf重復(fù)移液器連同一個(gè)5ml吸頭，向經(jīng)過(guò)不含底物預(yù)處理的96孔板的每一孔中加入200μl的細(xì)胞懸浮液，并且溫育在37℃、濕度100％和95％空氣/5％CO2中。
當(dāng)細(xì)胞增殖時(shí)，在最初48小時(shí)和體外3-4天(DIV)內(nèi)，它們形成小簇，即神經(jīng)球，神經(jīng)球在4-6DIV之間升離基質(zhì)。對(duì)每孔生成的神經(jīng)球數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果列于表中，并且將該數(shù)目與經(jīng)過(guò)傳代的效應(yīng)于EGF所生成的神經(jīng)球數(shù)目(見(jiàn)實(shí)施例2)和效應(yīng)于其他生物因子單獨(dú)作用或與EGF相結(jié)合的作用所生成的神經(jīng)球數(shù)(見(jiàn)實(shí)施例3)進(jìn)行比例。
實(shí)施例2增殖的神經(jīng)球的傳代示例1按實(shí)施例1所述制備細(xì)胞和培養(yǎng)基。細(xì)胞以0.2×106細(xì)胞/ml濃度植板于經(jīng)過(guò)不含底物預(yù)處理的75cm2組織培養(yǎng)瓶中(Corning)，并按實(shí)施例1所述溫育。
經(jīng)7DIV之后，取神經(jīng)球在400r.p.m下離心2-5分鐘，將沉淀用火焰加工光滑的玻璃巴斯德吸管在2ml完全培養(yǎng)基中機(jī)械解離成單個(gè)細(xì)胞。
將1×106細(xì)胞重新植板于75cm2的裝有20ml的含EGF的完全培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)瓶中。干細(xì)胞重新開(kāi)始增殖和形成新的神經(jīng)球。這一過(guò)程可以每隔6-8天重復(fù)。
示例2按照實(shí)施例1和實(shí)施例2示例1的方法，只是在完全培養(yǎng)基中加入20ng/ml FGF以替代EGF。
示例3按照實(shí)施例1和實(shí)施例2示例1的方法，只是除了在完全培養(yǎng)基中加有20ng/ml EGF外，還加入20ng/ml FGF。
經(jīng)過(guò)傳代所得的神經(jīng)球，可以按實(shí)施例1所述將其機(jī)械解離并將細(xì)胞植板于96孔板中?？梢詼y(cè)定特定的生物因子或生物因子組合對(duì)衍生于經(jīng)傳代神經(jīng)球的細(xì)胞所形成的神經(jīng)球的增殖的作用，并將這一作用與來(lái)自衍生于原初組織的細(xì)胞的結(jié)果相比較。
實(shí)施例3測(cè)定紋狀體衍生的神經(jīng)球效應(yīng)于增殖因子和調(diào)節(jié)因子各種組合的增殖作用示例1將按實(shí)施例1所制備的原始紋狀體細(xì)胞懸浮于不含生長(zhǎng)因子的完全培養(yǎng)基中，并按實(shí)施例1所述植板于96孔板(Nunclon)并溫育。經(jīng)過(guò)一小時(shí)溫育，向板的每孔中加入含有一種特定的增殖因子或幾種增殖因子的組合的完全培養(yǎng)基，增殖因子或其組合包括EGF，或bFGF(重組人bFGFR &D系統(tǒng))，或EGF和bFGF的組合，或EGF+FGF+硫酸乙酰肝素(Sigma)，或bFGF+硫酸乙酰肝素。每種生長(zhǎng)因子的濃度用20ng/ml，硫酸乙酰肝素的濃度用2μg/ml。
分別在含有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中配制濃度為0.2μg/ml的活化素、BMP-2、TGF-β、IL-2、IL-6、IL-8、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2(都來(lái)自Chiron Corp.)、TNFα、NGF(Sigma)、PDGF(R & DSystems)、EGF和CNTF(R.Dunn和P.Richardson，McGill University)。視黃酸(Sigma)以10-6M濃度加入。向96孔板的每一個(gè)含有增殖因子的孔中加入10μl含有上述調(diào)節(jié)因子的其中一種溶液。同時(shí)設(shè)置只含有增殖因子的對(duì)照孔。
在另一組實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)在含有調(diào)節(jié)因子而無(wú)增殖因子的完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)細(xì)胞，以測(cè)定各調(diào)節(jié)因子誘導(dǎo)神經(jīng)球的特性。當(dāng)在不含增殖誘導(dǎo)因子，如EGF或FGF時(shí)，這些調(diào)節(jié)因子(除EGF外)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖都不起作用。
每隔一天重復(fù)加入活化素、BMP-2、TGF-β、IL-2、IL-6、IL-8、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、TNFα和EGF，CNTF則每天加入，而視黃酸、NGF和PDGF只在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)加入一次。細(xì)胞溫育10-12天，對(duì)每孔中神經(jīng)球進(jìn)行計(jì)數(shù)并將所得值列表于Cricket圖表III。同時(shí)記錄與球體大小和形狀有關(guān)的其他有關(guān)信息。
一般來(lái)說(shuō)，bFGF比EGF對(duì)每孔生成的神經(jīng)球數(shù)目有較強(qiáng)的增殖作用。在20ng/ml EGF存在下，每孔約生成29個(gè)神經(jīng)球，而在bFGF作用下，則約生成70個(gè)神經(jīng)球。但是在bFGF單獨(dú)作用下(圖1B)，神經(jīng)球的大小只占在EGF作用下(圖1A)生成的神經(jīng)球的20％。EGF和bFGF結(jié)合作用(圖1C)比EGF單獨(dú)作用明顯產(chǎn)生更多的神經(jīng)球，但少于只用bFGF時(shí)的神經(jīng)球數(shù)。神經(jīng)球大小要超過(guò)單用bFGF的大小，大致與用EGF時(shí)相近。對(duì)于用bFGF所生成的球體，加入硫酸乙酰肝素可使球體大小增至效應(yīng)于EGF所產(chǎn)生神經(jīng)球的70％。這些數(shù)據(jù)表明EGF和FGF對(duì)于干細(xì)胞分裂的誘導(dǎo)有不同的作用。
加入到含有增殖因子的孔中的調(diào)節(jié)因子的作用概述于表1?？偟膩?lái)說(shuō)，TGFβ族、白介素、巨噬細(xì)胞抑制蛋白、PDGF、TNFα、視黃酸(10-6M)和CNTF能顯著減少生成于所有增殖因子或所試的增殖因子相結(jié)合的神經(jīng)球數(shù)目。BMP-2(在10ng/ml劑量下)完全消除效應(yīng)于EGF的神經(jīng)球增殖作用。EGF和硫酸乙酰肝素兩者都大大增加(約400％)效應(yīng)于bFGF而形成的神經(jīng)球的大小。
表1<

>◆ 除BMP-2外(即TGFα和活化素)生成的神經(jīng)球數(shù)目(#)以百分比形式給出，它反映了每孔中神經(jīng)球數(shù)目的減少(-)或增加(+)。神經(jīng)球數(shù)目效應(yīng)于調(diào)節(jié)因子存在下的增殖因子，并且是與無(wú)調(diào)節(jié)因子存在下增殖的神經(jīng)球數(shù)目相比較所得的結(jié)果。
在增殖因子和調(diào)節(jié)因子存在下，生成的神經(jīng)球大小與增殖因子單獨(dú)存在下生成的神經(jīng)球相比較，表示如下++大很多+較大＝大小約相同～ 大小不定-較小 --小很多示例2反義/有義實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例1所述獲取胚胎組織，并植板于含完全培養(yǎng)基的96孔板中。用下列寡脫氧核苷酸(所有序列為從5′→3′)進(jìn)行反義和有義實(shí)驗(yàn)EGF受體 有義鏈GAGATGCGACCCTCAGGGAC反義鏈GTCCCTGAGGGTCGCATCTCEGF 有義鏈TAAATAAAAGATGCCCTGG反義鏈CCAGGGCATCTTTTATTTA取各寡脫氧核苷酸在雙蒸水中稀釋，并保持在-20℃。向96孔板的每孔中加10μl的寡脫氧核苷酸，以使終濃度為1、2、3、4、5、10或25μm。每24小時(shí)加入寡脫氧核苷酸。在生長(zhǎng)于bFGF(20ng/ml)的培養(yǎng)物中加入EGF受體(EGFr)和EGF寡脫氧核苷酸；生長(zhǎng)于EGF(20ng/ml)的培養(yǎng)物中加入EGFr寡脫氧核苷酸。將細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5％ CO2、濕度100％的培養(yǎng)箱中。經(jīng)10-12天，對(duì)每孔神經(jīng)球進(jìn)行記錄并列表。濃度為3μm的反義寡脫氧核苷酸使每孔生成的神經(jīng)球數(shù)減少50％，而有義寡脫氧核苷酸對(duì)效應(yīng)于EGF和FGF產(chǎn)生的神經(jīng)球數(shù)目沒(méi)有影響。當(dāng)應(yīng)用10μM或更高濃度時(shí)，有義和反義寡脫氧核苷酸都對(duì)細(xì)胞有毒性。
采用下列寡脫氧核苷酸可進(jìn)行相似的實(shí)驗(yàn)FGF受體有義鏈GAACTGGGATGTGGGGCTGG反義鏈CCAGCCCCACATCCCAGTTCFGF有義鏈GCCAGCGGCATCACCTCG反義鏈CGAGGTGATGCCGCTGGC將FGF受體(FGFr)和FGF寡脫氧核苷酸加入生長(zhǎng)于EGF的培養(yǎng)物中，而FGFr寡脫氧核苷酸加入生長(zhǎng)于bFGF的培養(yǎng)物。
示例3如實(shí)施例1所示制備胚胎組合，并植板于96孔板中。將含有20ng/ml EGF或bFGF的完全培養(yǎng)基加入每個(gè)孔中。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，用Eppendorf重復(fù)移液器和一個(gè)500μl的吸頭向96孔板的每個(gè)孔中加入10μl稀釋的佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)，使終濃度為10、20、40、100或200μg/ml。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5％ CO2、100％濕度的培養(yǎng)箱中。經(jīng)10-12天，對(duì)每個(gè)孔中神經(jīng)球計(jì)數(shù)并列入表中。
示例4如實(shí)施例1所述制備胚胎組織并植板于96孔板中。用Eppendorf重復(fù)移液器和一個(gè)500μl吸頭向96孔板的每個(gè)孔中加入10μl稀釋的星形孢菌素，使終濃度為10、1、0.1或0.001μM。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5％ CO2和濕度100％的培養(yǎng)箱中。經(jīng)10-12天對(duì)每孔神經(jīng)球進(jìn)行計(jì)數(shù)并列入表中。
實(shí)施例4成體脊髓干細(xì)胞增殖—對(duì)特定的生物因子或幾種因子組合的體外效應(yīng)脊髓組織取自6周至6個(gè)月的小鼠，方法如下頸組織取自第一肋骨嘴側(cè)的脊柱區(qū)；胸柱組織取自第一肋骨的尾區(qū)和約離最后一根肋骨嘴側(cè)5mm部位；腰骶骨組織構(gòu)成了脊髓的其余部分。解剖的組織用常規(guī)的人工腦脊髓液(aCSF)清洗，再切成小塊，然后置于裝有經(jīng)充氧的aCSF的旋轉(zhuǎn)瓶中，其中的aCSF含有高濃度Mg2+、低濃度Ca2+以及胰蛋白酶/透明質(zhì)酸酶和犬尿喹啉酸酶的混合液，以利于組織的解離。對(duì)組織進(jìn)行充氧、攪拌并在30℃下加熱1.5小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入一個(gè)小瓶，在培養(yǎng)液(DMEM/12/激素混合液)中用胰蛋白酶抑制劑處理。組織用一個(gè)火焰光滑的吸管搗25-50次。解離的細(xì)胞在400r.p.m下離心5分鐘，然后重新懸浮于新鮮培養(yǎng)液中。將細(xì)胞植板于35mm培養(yǎng)皿(Costar)中并使之沉淀。吸去多數(shù)的培養(yǎng)液并加入新鮮的培養(yǎng)液。在一些培養(yǎng)皿中單獨(dú)加EGF或加入EGF和bFGF，使每種因子濃度為20ng/ml，剩下的培養(yǎng)皿中加入bFGF(20ng/ml)和2μg/ml的硫酸乙酰肝素。細(xì)胞培養(yǎng)在5％ CO2、濕度100％和37℃下10-14天。對(duì)每孔生成的神經(jīng)球計(jì)數(shù)，并將結(jié)果列入表格。單獨(dú)用EGF時(shí)任何脊髓部位都不生成神經(jīng)球。而在EGF+bFGF存在下，所有脊髓部位都生成神經(jīng)球，尤以腰骶骨部位為最。EGF+FGF和FGF+硫酸乙酰肝素相結(jié)合能在頸區(qū)產(chǎn)生相似數(shù)目的球體，而bFGF+硫酸乙酰肝素結(jié)合在胸區(qū)和腰區(qū)產(chǎn)生較少的神經(jīng)球(見(jiàn)圖3)。
實(shí)施例5效應(yīng)于增殖因子的靈長(zhǎng)類組織神經(jīng)球的體外生成第一次傳代的神經(jīng)球取自成人組織。在一次常規(guī)活組織檢查中，從一名65歲老年女性患者中取正常組織。活檢部位位于右前葉，離側(cè)室前角尖端6mm處。組織用aCSF采用大致與實(shí)施例4相同的方法制備。干細(xì)胞培養(yǎng)在T25瓶(Nunclon)中，用含有20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF或EGF+bFGF各20ng/ml的完全培養(yǎng)基。每隔2-3天檢查培養(yǎng)瓶以觀察神經(jīng)球的形成。EGF+FGF相結(jié)合作用比單用EGF或FGF生成更多的神經(jīng)球。
實(shí)施例6受傷CNS中干細(xì)胞和干細(xì)胞子代增殖的抑制
A脊髓受傷用戊巴比妥鈉(80mg/kg，腹膜內(nèi)注射)麻醉成體雄性CD1小鼠(CharlesRiver，St.Constant，Quebec)。在頸、胸或腰的高度進(jìn)行椎板切除術(shù)，并用微型外科剪刀切除后索。在損傷形成的同一天，用接有30號(hào)套管的100μl容量的滲透微型泵(ALZA；傳送速率0.5μl/h/7天；型號(hào)1007D)將含有抑制干細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)因子的一種組合物注入第四室。套管采用定向技術(shù)移植到前囟后部AP-6.0mm處的第四室，它位于硬腦膜以下L-0.3mm和DV-4.3m處，并在λ和前胸之間有一平的顱骨位置。套管用牙科的丙烯酸粘固劑固定。含有能抑制干細(xì)胞效應(yīng)于受傷刺激的增殖作用的調(diào)節(jié)因子的組合物以0.5μl/小時(shí)的流速灌注1-28天。該組合物含有0.9％鹽水、1mg/ml小鼠血清白蛋白(Sigma)和10ng/ml的BMP-2。可以應(yīng)用的其他的調(diào)節(jié)因子包括那些對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞體外增殖有抑制效果的調(diào)節(jié)因子，如CNTF、視黃酸、TGF-β和MIP族的成員和抗EGF受體和FGF受體的反義寡脫氧核苷酸。細(xì)胞在受傷部位的反應(yīng)按實(shí)施例7所述方法測(cè)定。
B.腦受傷用戊巴比妥鈉(80mg/kg，腹膜內(nèi)注射)麻醉成體雄性CD1小鼠(CharlesRiver，St.Constant，Quebec)。切去顱骨的一小塊，使大腦皮層暴露。按Cavanagh，J.B.的方法(“解剖學(xué)雜志”(J.Anatomy)106471-487(1970))在皮層中制造一個(gè)切傷。在損傷形成的同一天，用接有30號(hào)套管的100μl容量的滲透微型泵(ALZA；傳送速率0.5μl/h/7天；型號(hào)1007D)將抑制干細(xì)胞增殖的因子注入同側(cè)室中。用定向技術(shù)植入套管，用牙科的丙烯酸粘固劑固定。能抑制干細(xì)胞效應(yīng)于受傷刺激而產(chǎn)生增殖作用的因子以0.5μl/小時(shí)流速灌注1-28天。載體溶液為0.9％鹽水，其中含有1mg/ml小鼠血清白蛋白(Sigma)。抑制因子包括那些對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞體外增殖有抑制作用的因子，如BMP-2、CNTF、視黃酸、TGF-β和MIP族的成員和抗EGF和FGF受體的反義寡脫氧核苷酸。在受傷部位細(xì)胞的反應(yīng)按實(shí)施例7所述進(jìn)行測(cè)定。
實(shí)施例7檢測(cè)在CNS受傷部位進(jìn)行增殖的細(xì)胞在實(shí)施例6中灌注期結(jié)束之后，給小鼠注射溴脫氧尿苷(BrdU；Sigma，120mg/kg，腹膜內(nèi)注射)，每2小時(shí)一次共注射5次，以標(biāo)記在受傷部位進(jìn)行增殖的細(xì)胞。動(dòng)物在最后一次注射之后30分鐘、2天、4天、1星期、6星期或6個(gè)月用過(guò)量麻醉劑處死并用4％多聚甲醛穿心灌注。取受傷部位附近(包括受傷部位)以及靠近受傷部位的室部位，并在灌注液中4℃下后固定過(guò)夜，然后冷凍保護(hù)。切下30μm的弧矢狀冷凍切片并直接置于凝膠處理的載玻片上。進(jìn)行BrdU檢測(cè)的組織先用1M HCl在65℃下處理切片30分鐘，以使細(xì)胞的DNA變性，組織然后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)處理。采用大鼠抗-BrdU(Seralab)和驢抗-大鼠-FITC進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定。用GFAP的抗血清(由星形細(xì)胞表達(dá))，隨后用驢抗-小鼠-FITC以顯現(xiàn)GFAP的表達(dá)和膠質(zhì)細(xì)胞瘢痕的產(chǎn)生。用nestin的抗血清標(biāo)記切片，隨后進(jìn)行驢抗-小鼠-FITC和對(duì)靠近室區(qū)和損傷部位的nestin免疫反應(yīng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)定量這一處理對(duì)nestin表達(dá)的作用。以初級(jí)抗體的缺乏證實(shí)免疫染色的特異性。將經(jīng)過(guò)處理的動(dòng)物與只接受用載體室內(nèi)處理的對(duì)照進(jìn)行比較。
所有引用文獻(xiàn)引入此文作為參考。
權(quán)利要求
1.一種調(diào)節(jié)多潛能神經(jīng)干細(xì)胞/或所述的神經(jīng)干細(xì)胞子代體外增殖的方法，包括以下步驟(a)解離含有至少一個(gè)多潛能神經(jīng)干細(xì)胞的哺乳動(dòng)物神經(jīng)組織，它能產(chǎn)生能分化成神經(jīng)元、星形細(xì)胞和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的子代，并且(b)在一種含有至少一種增殖因子和一種調(diào)節(jié)因子的培養(yǎng)基中增殖所述的多潛能神經(jīng)干細(xì)胞，其中的增殖因子能誘導(dǎo)干細(xì)胞的增殖而調(diào)節(jié)因子能調(diào)節(jié)所述的多潛能神經(jīng)干細(xì)胞和/或所述的多潛能神經(jīng)干細(xì)胞子代的增殖。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的增殖因子選自由EGF、雙調(diào)蛋白、aFGF、bFGF和TGFα組成的一組因子。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的增殖因子為bFGF。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述的調(diào)節(jié)因子選自由硫酸乙酰肝素、CNTF、視黃酸、活化素、白介素和EGF所組成的一組因子。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述的調(diào)節(jié)因子為硫酸乙酰肝素。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所述的調(diào)節(jié)因子為EGF。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的多潛能神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源于哺乳動(dòng)物。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述的多潛能神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源于成年供體。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述的干細(xì)胞來(lái)源于人。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述的干細(xì)胞來(lái)源于患神經(jīng)疾病的人。
11.一種用于調(diào)節(jié)病人CNS中神經(jīng)干細(xì)胞增殖的治療組合物，所述的組合物含有治療上有效量的神經(jīng)干細(xì)胞調(diào)節(jié)因子。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述的調(diào)節(jié)因子抑制神經(jīng)干細(xì)胞增殖。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述的調(diào)節(jié)因子選自由BMP-2、CNTF、視黃酸、TGF-β族和MIP族的成員以及抗EGF和FGF受體的反義寡脫氧核苷酸所組成的一組因子。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中所述的調(diào)節(jié)因子為BMP-2。
15.權(quán)利要求12-14任意一項(xiàng)中的組合物，以防止腦或脊髓損傷病人瘢痕組織的形成。
全文摘要
本發(fā)明旨在用含有各種生物因子的組合物調(diào)節(jié)多潛能神經(jīng)干細(xì)胞在體外和體內(nèi)的增殖。特別地,本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)前體細(xì)胞數(shù)目的一種方法和治療組合物,它是通過(guò)干細(xì)胞在特定生物因子或這些因子的組合作用下而進(jìn)行的,其中的前體細(xì)胞是由進(jìn)行分裂的神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生。
文檔編號(hào)A61K38/44GK1170435SQ95196842
公開(kāi)日1998年1月14日 申請(qǐng)日期1995年11月14日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月14日
發(fā)明者塞繆爾·韋斯, 布倫特·A·雷諾茲 申請(qǐng)人:紐羅斯菲里斯控股有限公司