專利名稱：一種能無限自我更新的神經(jīng)干細(xì)胞、其制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種神經(jīng)干細(xì)胞、其制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell, NSC)是一類具有分裂潛能和自我更新能力的母細(xì)胞，它可以通過不對等的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類細(xì)胞。根據(jù)分化潛能的時(shí)序分為 主要存在胚胎時(shí)期的神經(jīng)管上皮細(xì)胞、放射狀膠質(zhì)神經(jīng)元和神經(jīng)母細(xì)胞。放射狀膠質(zhì)神經(jīng)元主要存在于幼年時(shí)期，可以分裂產(chǎn)生本身并同時(shí)產(chǎn)生神經(jīng)元前體細(xì)胞或是膠質(zhì)細(xì)胞；神經(jīng)母細(xì)胞主要存在于成年動物體中，可以產(chǎn)生神經(jīng)前體細(xì)胞、神經(jīng)元和各類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 而根據(jù)部位分類可以主要分兩類可發(fā)育為外周神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和Schwann氏細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等的神經(jīng)嵴干細(xì)胞(neural crest stemcell, NC-SC)；可發(fā)育成為神經(jīng)系統(tǒng)的大部分細(xì)胞，稱為中樞神經(jīng)干細(xì)胞(CNS-SC)，主要存在于腦部。目前將具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我更新并足以提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞都統(tǒng)稱為NSC。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方面，除了傳統(tǒng)的藥物、手術(shù)及康復(fù)治療外，近年來細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究得到了廣泛開展，主要包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞與NSC 移植等。2009年，Sharp等人成功的將人胚胎干細(xì)胞注射到脊髓損傷的大鼠體內(nèi)，從而使大鼠恢復(fù)了運(yùn)動能力(Jason Sharp, Jennifer Frame, Monica Siegenthaler, et al. Human embryonic Stem Cell-Derived OligodendrocyteProgenitor Cell Transplants Improve Recovery after CervicalSpinal Cord Injury. Stem Cells，2009，1002 (10) ·)。但直接注射胚胎干細(xì)胞還存在形成腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。Brederlau等人將分化16天人胚胎干細(xì)胞移植入 Parkinson病大鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示在22只大鼠中有16只生成畸胎瘤；而將分化23d的細(xì)胞進(jìn)行移植實(shí)驗(yàn)卻未發(fā)現(xiàn)生成畸胎瘤情況(Brederlaua.，Correia A. S.，Anisimovs S. V.， et al. Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Cells toa Rat Model of Parkinson's Disease :Effect of In VitroDifferentiation on Graft Survival and Teratoma Formation. StemCells, 2006, 24 1433 1440.)。這說明未完全分化的細(xì)胞容易生成畸胎瘤，直接應(yīng)用到臨床還是存在風(fēng)險(xiǎn)的。而利用NSC進(jìn)行細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病是有效且安全的選擇。NSC細(xì)胞不具有成瘤性，具有向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的潛能；是未分化的原始細(xì)胞，不表達(dá)成熟的細(xì)胞抗原，不被免疫系統(tǒng)識別，具有低免疫源性；其組織融合性好，可以與宿主的神經(jīng)組織良好融合，并在宿主體內(nèi)長期存活，是最理想的細(xì)胞移植材料。NSC不僅可以存活和整合入宿主組織中，分化出神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，填充因損傷造成的空洞，并且可以和宿主細(xì)胞之間形成突觸樣的結(jié)構(gòu)，使神經(jīng)組織損傷區(qū)域的結(jié)構(gòu)得以重建，進(jìn)而恢復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的部分功能(YW Z，et al. . Oligodendrocyteprogenitor cells derived from human embryonic stem cellsexpress neurotrophic factors. Stem
3Cells and Development. 2006，15 :943_952·)，因此業(yè)內(nèi)一直致力于NSC的臨床應(yīng)用研究。NSC可以由胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和其它干細(xì)胞分化而來。胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ES)是從哺乳動物的囊胚內(nèi)細(xì)胞群(inner cell mass, I CM)和原始的生殖細(xì)胞(primordial germcells, PGC)著床前胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出來的一種全能性的多功能干細(xì)胞，這種細(xì)胞可以在體外進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)(Reubinof B E, hsyksonP, Turetsky T, et al. Neural progenitors from human emb ryonicstem cells. Nat Biotehnol，2001，19 (12) :1134_1140.)。胚胎干細(xì)胞具有可以自我復(fù)制、自我更新并能發(fā)育為完整的生物個(gè)體并可以產(chǎn)生后代的能力，在一定的條件下，其可以分化為人體的200多種類型的細(xì)胞，并可以構(gòu)建成心、肺、肝、脾、腎等各種組織和器官，最終可以發(fā)育成一個(gè)完整的生物個(gè)體(Heins N, Englund MC, SjoblomC, et al. Derivation, characterization, and differentiation ofhuman embryonic stem cells. Stem Cells, 2004,22(3) :367-376. Reubinoff BE, Pera MF, Fong CY, et al. Embryonic stem cell linesfrom human blastocysts:somatic differentiation in vitro. NatBiotechnol, 2000,18(4) :399-404.)。胚胎干細(xì)胞與成體組織中的干細(xì)胞不同，胚胎干細(xì)胞具有以下特點(diǎn)具有多向分化潛能和受精卵的某些特性，保持未分化狀態(tài)，具有自我復(fù)制的能力，可以分化為生物體內(nèi)各種類型的組織細(xì)胞；可以在體外培養(yǎng)的條件下通過單細(xì)胞克隆建立有相同遺傳特性的穩(wěn)定的細(xì)胞系，可長期增殖培養(yǎng)并保持高度未分化狀態(tài)和發(fā)育潛能性；胚胎干細(xì)胞端粒酶活性呈陽性，具有維持端粒長度，保持干細(xì)胞增殖能力的重要作用；胚胎干細(xì)胞注射到裸鼠皮下，可形成畸胎瘤；胚胎干細(xì)胞也較易于形成嵌合體動物和進(jìn)行基因改造， 從而成為細(xì)胞與個(gè)體之間的橋梁并成為臨床細(xì)胞移植治療新的細(xì)胞來源。日本京都大學(xué)的Yamanaka等研究發(fā)現(xiàn)利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將c_Myc、Klf4、0ct4、 Sox2這4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因整合入小鼠成纖維細(xì)胞可以獲得成體細(xì)胞誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞 (induced pluripotent stem cell, iPS細(xì)胞)，即多能性干細(xì)胞。通過用逆轉(zhuǎn)錄病毒向小鼠皮膚的成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入4個(gè)不同作用的關(guān)鍵基因0ct3/4、Sox-2、Klf-4與C-myc， 使它們與原有基因發(fā)生重組，成功地對成纖維細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了基因重新編排，產(chǎn)生的細(xì)胞最終具有胚胎干細(xì)胞的特性，具備變成機(jī)體任何細(xì)胞的潛能，它們能和真正的胚胎干細(xì)胞一樣發(fā)育，參與形成胎兒小鼠的身體各部分(Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Generationof germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 2007 ；448 (7151) 313-7. Wernig Μ,Meissner A,Foreman R,et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotentES-cell-like state. Nature. 2007 ；448(7151) :318_24·)。2007 年 11月底，Yamanaka課題組及Thomson JA課題組同時(shí)從人的纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成具有多分化潛能的 iPS 細(xì)胞(Takahashi K, Tanabe K, OhnukiM, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult humanfibroblasts by defined factors. Cell. 2007 ；131 (5) 861-72. YuJ, Vodyanik MA,Smuga-Otto K,et al. Induced pluripotent stemcell lines derived from human somatic cells. Science. 2007 ；318 (5858) :1917_20)。2008 年 1 月哈佛大學(xué) Daley GQ i果題組也證實(shí)了這一實(shí)驗(yàn)(Park IH, Zhao R，West JA, et al. Reprogramming ofhuman somatic cells to pluripotency with defined factors.Nature.2008 ； 451 (7175) 141-6) 國內(nèi)中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院的裴端卿、秦大江課題組掌握并發(fā)展了干細(xì)胞研究新技術(shù)，利用未經(jīng)修飾并且不帶有選擇標(biāo)記的小鼠成體細(xì)胞，探索
4出了直接運(yùn)用ip s技術(shù)的新途徑，并獲取了近千分之三左右的高成功率(Qi H, PeiD. The magic of four-induction of pluripotent stem cells fromsomatic cells by 0ct4, Sox2, Myc and Klf4. Cell Res. 2007 ； 17 (7) :578_80)。iPS細(xì)胞類似胚胎干細(xì)胞，具有胚胎干細(xì)胞的很多生理生化特性，例如，可以在體外快速增殖并穩(wěn)定傳代；并可持續(xù)表達(dá)胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志蛋白0ct4，Sox2, SSEA-I和 Nanog ；持續(xù)具有堿性磷酸酶活性；裸鼠皮下注射有成瘤性；體內(nèi)體外分化實(shí)驗(yàn)證明可分化為三胚層；小鼠和大鼠的多能性干細(xì)胞還可獲得嵌合鼠等。繼小鼠之后，用逆轉(zhuǎn)錄病毒將 c-Myc.Klf4.0ct4.Sox2這4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因整合入人成纖維細(xì)胞可以獲得人的iPS細(xì)胞。 與此同時(shí)，用慢病毒將0Ct4、SOX2、NanOg、Lin28基因整合入人成纖維細(xì)胞也獲得了多能性干細(xì)胞。從高度分化的體細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生多能性干細(xì)胞，有廣泛的應(yīng)用前景，例如，多能性干細(xì)胞可以用于建立體外疾病模型，進(jìn)行藥物篩選和細(xì)胞替代療法等，而且，將體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為有胚胎干細(xì)胞特性的細(xì)胞系后，那么一種高度分化的體細(xì)胞就可可能轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N高度分化的體細(xì)胞。因?yàn)槎嗄苄愿杉?xì)胞的研究有可能避免諸多的倫理問題，因此，全世界許多實(shí)驗(yàn)室也投入了 iPS細(xì)胞的研究工作，并且成功將多種細(xì)胞誘導(dǎo)為多能性干細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、終末期分化的淋巴細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞、胃上皮細(xì)胞和屬于成體干細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞。NSC在動物實(shí)驗(yàn)和臨床前研究中已顯示出良好的應(yīng)用前景。2009年1月22日， 美國著名的胚胎干細(xì)胞研發(fā)公司GERON公司獲FDA批準(zhǔn)，將開展用ES分化而來的神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞GRN0PC1治療脊髓損傷的人體試驗(yàn)。GERON公司前期的臨床前研究表明GRN0PC1 注射到脊髓損傷的部位，能夠遷移到受損部位并能夠成熟為有功能的少突膠質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞具有軸突再生和分泌因子的功能，注射GRN0PC1的實(shí)驗(yàn)組動物較對照組運(yùn)動功能得到顯著改善。將從人胚胎分離得到的NSC直接移植到大鼠帕金森疾病模型的大腦內(nèi)部后， NSC可以向表達(dá)酪氨酸羥化酶(TH)的多巴胺能神經(jīng)元分化，并明顯改善運(yùn)動不平衡癥狀； 移植到亨廷頓舞蹈癥(Huntington’ s disease, HD)大鼠模型腦內(nèi)后，實(shí)驗(yàn)中可以得到大量的由NSC分化來的神經(jīng)元細(xì)胞，這些細(xì)胞可以沿著宿主的白質(zhì)區(qū)纖維束包括正常的紋狀體傳出途徑投射，其中發(fā)現(xiàn)部分可以重建神經(jīng)通路。一些研究也證明將人胚胎干細(xì)胞分化來的少突狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，移植到動物體內(nèi)可以明顯改善其運(yùn)動功能和促進(jìn)髓鞘損傷部位的再生(Keirstead HS, Nistor G，Bernal G，et al. Humanembryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor eel!transplants remyelinate and restore locomotion after spinalcord injury. J Neurosci.，2005，25(19) :4694_4705· Nistor GIiTotoiu M0, Haque N，et al. Human embryonic stem eellsdifferentiate into oligodendrocytes in high purity andmyelinate after spinal cord transplantation. Glia.，2005，49 (3) 385-396. Utzschneider DA, Archer DR, Kocsis JD, etal. Transplantation of glial cells enhances action potentialconduction of amyelinated spinal cord axons in themyelin-deficient rat. Proc Natl Acad Sci，1994，91 (1) :53_57. Warrington AE, Barbarese E，Pfeiffer SE. Differentialmyelinogenic capacity of specific developmental stages of theoligodendrocyte 1ineage upon transplantation intohypomyelinating hosts. J Neurosci Res. ,1993,34(1) :1_13.)0
但是目前從ES定向分化獲得的NSC或者直接從動物體內(nèi)分離培養(yǎng)的NSC在體外培養(yǎng)時(shí)通常只能傳幾代，不能無限自我更新，難以為臨床應(yīng)用提供更多的細(xì)胞。目前多使用轉(zhuǎn)基因的方法，建立NSC永生化細(xì)胞系。這類NSC能自我復(fù)制并在體外大量增殖，在移植入人體內(nèi)后仍具有多向分化潛能，但轉(zhuǎn)基因操作對這類細(xì)胞的臨床應(yīng)用存在威脅，而且這類細(xì)胞還往往具有高致瘤性。以往認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元在出生前或出生后不久，就失去再生能力。因此，提供無致瘤性、且能夠在體外快速增殖和穩(wěn)定傳代的NSC，成為目前的當(dāng)務(wù)

發(fā)明內(nèi)容
為此，申請人經(jīng)過深入研究，終于通過將ES細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行定向分化后，或者直接從動物腦組織中分離后進(jìn)行體外培養(yǎng)，獲得了一類可以在體外長期傳代培養(yǎng)且的細(xì)胞，該細(xì)胞同時(shí)表達(dá)0ct4和Soxl。已知0ct4是POU家族的轉(zhuǎn)錄因子，是植入前胚胎發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，是哺乳動物多能性細(xì)胞維持多能狀態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控因子，是細(xì)胞多能性的標(biāo)志。Sox家族的HMG-box轉(zhuǎn)錄因子在維持神經(jīng)干細(xì)胞多潛能能力方面扮演著重要的角色，Soxl是胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中表達(dá)最早的神經(jīng)標(biāo)志物，它只在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，并且可以標(biāo)識在神經(jīng)管內(nèi)增殖的神經(jīng)干細(xì)胞池。因此，Soxl較巢蛋白在鑒定神經(jīng)干細(xì)胞方面更具有特異性。Sox 家族的其他成員如Sox2和Sox3等在神經(jīng)前體細(xì)胞中也有表達(dá)。Soxl是神經(jīng)細(xì)胞最為早期的信號標(biāo)記蛋白。該類細(xì)胞在僅為N2B27的基礎(chǔ)培養(yǎng)液內(nèi)不能長期維持生存。添加GSK/3 信號通路抑制劑CHIR99021可以維持0ct4的表達(dá)，CHIR99021的添加劑量在一定范圍內(nèi)與 0ct4的表達(dá)量正相關(guān)。CHIR99021還可以維持多種非神經(jīng)細(xì)胞的增殖和自我更新。本發(fā)明還添加一種ROCK信號通路抑制劑Y27632，主要維持細(xì)胞Soxl的表達(dá)，在一定范圍內(nèi)，Soxl 的表達(dá)量與Y27632的添加劑量正相關(guān)。由此確定所獲得的細(xì)胞是NSC (神經(jīng)干細(xì)胞)。通過經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的這類NSC細(xì)胞可以在無血清無飼養(yǎng)層的化學(xué)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，裸鼠體內(nèi)注射不存在致瘤性，臨床應(yīng)用安全性好。而且該類NSC細(xì)胞可以在有血清的條件下只分化為各種神經(jīng)細(xì)胞。由此使為臨床應(yīng)用提供大量的NSC成為可能，進(jìn)而完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明提供了以下多個(gè)方面的內(nèi)容。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種神經(jīng)干細(xì)胞，其特征在于同時(shí)表達(dá)標(biāo)志蛋白0ct4和Soxl，并可在體外快速增殖和穩(wěn)定傳代。另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種神經(jīng)干細(xì)胞(neural stemcelLNSC)株，這類細(xì)胞主要的特征是1)同時(shí)表達(dá)特征蛋白0ct4和Soxl，其中0ct4是維持該類NSC在體外長期傳代和自我更新的關(guān)鍵基因，而Soxl的表達(dá)證明該類NSC仍是神經(jīng)干細(xì)胞；2)可以在無血清無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)；3)可在體外長期傳代和擴(kuò)增，細(xì)胞核型正常；4)能繼續(xù)分化為多種神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。本發(fā)明所述的神經(jīng)干細(xì)胞，還同時(shí)表達(dá)Sox2、Nestin和Pax6。
本發(fā)明所述神經(jīng)干細(xì)胞，其分離自哺乳動物的腦組織。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了獲得本發(fā)明的NSC細(xì)胞的方法，具體包括無菌條件下獲得從動物的胎兒腦組織(例如小鼠胎兒腦組織)，用胰酶消化分散后，用含添加 ROCK信號通路抑制劑和GSK/3信號通路抑制劑的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至有神經(jīng)球樣細(xì)胞懸浮，將懸浮細(xì)胞繼續(xù)消化傳代培養(yǎng)，收集繼續(xù)存活的少數(shù)表達(dá)0ct4和Soxl的細(xì)胞，由此獲得本發(fā)明的NSC細(xì)胞。其中所述的動物的胎兒腦組織可以來自人、大鼠、小鼠、狗、兔、猴子等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的神經(jīng)干細(xì)胞是通過定向分化哺乳動物胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞獲得的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的NSC可以通過對動物(例如小鼠和大鼠)的神經(jīng)細(xì)胞ES的定向分化獲得，所述的方法的特征是分化液為添加ROCK信號通路抑制劑和GSK/3信號通路抑制劑的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液，將ES細(xì)胞先貼壁分化至表達(dá)Soxl 的細(xì)胞開始聚集懸浮成神經(jīng)球時(shí)，收集懸浮的神經(jīng)球，再Laminin上繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，通過貼壁-懸浮-再貼壁的方法完成NSC細(xì)胞富集。由于添加了 GSK/3信號通路抑制劑，這類細(xì)胞還低表達(dá)0ct4，可以在無血清無飼養(yǎng)層的化學(xué)限定性培養(yǎng)基內(nèi)長期培養(yǎng)。本發(fā)明所述的神經(jīng)干細(xì)胞，其在體內(nèi)可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，該類細(xì)胞在含血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液內(nèi)只分化為神經(jīng)細(xì)胞。添加不同的誘導(dǎo)分化因子，該類細(xì)胞也可分化為表達(dá)HB9的運(yùn)動神經(jīng)元，表達(dá)TUJl、 TH的多巴胺神經(jīng)元和表達(dá)等標(biāo)記物的膠質(zhì)細(xì)胞。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案涉及本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞在制備治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中的用途。神經(jīng)退行性疾病(Neurodegenerative disease)是一類慢性、進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要包括帕金森氏癥、老年癡呆癥、腦中風(fēng)、退行性心臟病等老年性疾病，且多發(fā)于高齡的人群，近些年來，隨著社會的老齡化程度加劇，神經(jīng)退行性疾病在所有疾病中占有越來越重要的地位。隨著神經(jīng)退行性疾病發(fā)病率的逐年上升，此類疾病也受到了世界的許多專家和學(xué)者的關(guān)注，并成為醫(yī)學(xué)上的一大難題。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案涉及本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞在治療脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)中的用途，SCI是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的嚴(yán)重創(chuàng)傷，因其高致殘率和高病死率，SCI —直是世界性的醫(yī)學(xué)難題。傳統(tǒng)的治療手段如手術(shù)減壓、藥物與高壓氧等雖然可以有效減輕其繼發(fā)損害，但是無力解決SC I治療的核心問題——重建神經(jīng)元、軸突與突觸后聯(lián)系，恢復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能。在SCI病人中，大多數(shù)為青壯年，此類損傷導(dǎo)致的勞動力喪失對病人、家庭和社會帶來了極大的痛苦和負(fù)擔(dān)。因此，對SC I病人進(jìn)行積極救治，挽救肢體功能，盡可能恢復(fù)傷者的生活能力，甚至勞動能力，具有極其重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會效益。目前SCI的綜合治療手段主要包括外科治療、藥物治療、物理治療、組織與細(xì)胞移植及功能重建五大方面。這些手段可以有效減輕SCI的繼發(fā)性損害，但難以恢復(fù)SCI的原發(fā)性損害所導(dǎo)致的中樞神經(jīng)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)與功能的缺失。NSC是治療SCI最理想的細(xì)胞移植材料，NSC 不僅可以存活和整合入宿主組織中，分化出神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，填充因損傷造成的空洞，并且可以和宿主細(xì)胞之間形成突觸樣的結(jié)構(gòu)，使神經(jīng)組織損傷區(qū)域的結(jié)構(gòu)得以重建，進(jìn)而恢復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的部分功能。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案涉及本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞在發(fā)育生物學(xué)等基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的用途。本發(fā)明通過添加ROCK信號通路抑制劑，使多能干細(xì)胞全部定向?yàn)镹SC，該類 NSC不僅可在體外分化為多種神經(jīng)細(xì)胞，而且這類NSC細(xì)胞表達(dá)多能干細(xì)胞標(biāo)記物0ct4，而且具有長期自我更新的潛能。本發(fā)明證明了該類細(xì)胞的存在。


圖1顯示為倒置顯微鏡下(10X5倍)神經(jīng)球干細(xì)胞照片。圖2顯示為激光共聚焦顯微鏡下熒光照片，其中紅色標(biāo)記為Nestin表達(dá)一抗為鼠抗Soxl單克隆抗體(1 100)，二抗為山羊抗鼠熒光二抗(1 100)；綠色標(biāo)記為0ct4 表達(dá)一抗為鼠抗0ct4單克隆抗體(1 100)，二抗為山羊抗鼠熒光二抗(1 100)；藍(lán)色為DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。圖3顯示為倒置顯微鏡下46c小鼠ES細(xì)胞經(jīng)6-8d分化形成懸浮的神經(jīng)球干細(xì)胞。圖4顯示為圖3的神經(jīng)球干細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，因46c為Soxl-EGFP， 表明形成的神經(jīng)球干細(xì)胞表達(dá)Soxl基因。圖5顯示為分化得到的神經(jīng)元細(xì)胞免疫熒光染色后，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。 A標(biāo)記為Tujl，其中一抗為鼠抗Tujl單克隆抗體(1 100)，二抗為山羊抗鼠熒光二抗 (1 100) ；B標(biāo)記為DAPI ;C顯示為Merge圖。圖6顯示為分化得到的多巴胺神經(jīng)元TH染色熒光顯微鏡下結(jié)果。A標(biāo)記為TH，其中一抗為兔抗TH單克隆抗體(1 100)，二抗為鼠抗兔熒光二抗(1 100) ；B標(biāo)記為DAPI 染核；C顯示為Merge圖。圖7顯示為分化得到的運(yùn)動神經(jīng)元HB9染色熒光顯微鏡下結(jié)果。A標(biāo)記為HB9，其中一抗為山羊抗HB9單克隆抗體(1 100)，二抗為兔抗山羊熒光二抗(1 100) ；BDAPI染核；C顯示為Merge圖。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1 原代小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)1)小鼠胎兒的獲取和腦組織的原代培養(yǎng)斷頸法處死懷孕5d以上的小鼠，在無菌條件下打開腹腔，取出子宮，并用含抗生素的PBS洗3次。將胎兒從子宮中取出，去除軀干，在顯微鏡下將腦組織小心剝離。將剝離的腦組織用0. 25%胰酶消化2min，用血清終止后，吹打數(shù)次，1000轉(zhuǎn)離心5min，倒掉上清， 用N2B27+CHIR99021(3mM)+Y27632(10nmol/L)培養(yǎng)液洗兩次后，再加入預(yù)熱的該培養(yǎng)液在 5% CO2、37°C的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的傳代和純化上述原代細(xì)胞培養(yǎng)3天后可消化傳代，吸出培養(yǎng)液，加入0. 25%胰酶消化液，控時(shí)消化2min，加入血清終止消化，1000轉(zhuǎn)離心5min。棄去上清液，加入培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)液是條件性的選擇培養(yǎng)液(與原代培養(yǎng)液成分相同)，在多次傳代后，大部分細(xì)胞死亡，NSC以懸浮的形式存在并可長期傳代培養(yǎng)。3)細(xì)胞冷凍保存用0. 25%胰蛋白酶消化細(xì)胞大約2分鐘，用吸管將細(xì)胞懸液吸到15ml離心管內(nèi)， 再輕輕的吹打細(xì)胞，使其分散成小的細(xì)胞團(tuán)塊，對干細(xì)胞而言，小的細(xì)胞團(tuán)塊比單個(gè)的細(xì)胞較易冷凍存活，冷凍保存的細(xì)胞團(tuán)塊應(yīng)比消化傳代時(shí)的細(xì)胞團(tuán)塊稍大一點(diǎn)點(diǎn)。1000轉(zhuǎn)離心 2分鐘。用凍存液重懸細(xì)胞，無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的細(xì)胞可加入30%的血清替代物，DMSO的濃度仍為10%。DMSO在室溫時(shí)對細(xì)胞毒性較大，凍存液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，配置凍存液時(shí)，培養(yǎng)液和血清都不需要預(yù)熱，按比例配好凍存液后，直接懸浮細(xì)胞，每凍存管加入Iml細(xì)胞懸液，可先放入4°C冰箱30min，然后放在凍存用泡沫盒內(nèi)，-70°C過夜。再放入液氮灌內(nèi)永久保存。實(shí)施例2 從胚胎干細(xì)胞定向神經(jīng)干細(xì)胞分化1)小鼠胚胎干細(xì)胞向NSC定向步驟將mES細(xì)胞(小鼠46C胚胎干細(xì)胞，由美國加州大學(xué)應(yīng)其龍教授惠贈)用0. 25% 胰蛋白酶消化為單細(xì)胞懸液，加入血清終止離心后，用定向神經(jīng)分化培養(yǎng)液(與原代培養(yǎng)液成分相同)重懸。重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)板前，應(yīng)用50 μ g/ml濃度的Laminin包被培養(yǎng)板2個(gè)小時(shí)以上，以輔助細(xì)胞貼壁。細(xì)胞接種密度在每毫升1. OX IO4與1. OX IO5個(gè)細(xì)胞之間，細(xì)胞貼壁后呈單層貼壁生長，細(xì)胞之間有明顯界限，細(xì)胞太密，細(xì)胞增殖過快，會很快長滿培養(yǎng)皿，細(xì)胞密度過低，不利于細(xì)胞增殖。細(xì)胞培養(yǎng)3天后傳代，需傳至不鋪任何基質(zhì)膠的新培養(yǎng)板，以保證細(xì)胞可以同時(shí)聚集形成漂浮的神經(jīng)球。2)小鼠NSC的富集和鑒定ES細(xì)胞在神經(jīng)分化培養(yǎng)液內(nèi)貼壁分化5d后開始聚集懸浮，聚成圓形的神經(jīng)球(圖 1)，這類神經(jīng)球免疫熒光染色后表達(dá)Soxl和0ct4(圖2)，部分分化的雜細(xì)胞不能形成這種漂浮的神經(jīng)球。漂浮的神經(jīng)球繼續(xù)懸浮培養(yǎng)2d。2d后所有懸浮的神經(jīng)球都開始表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Soxl (圖3，圖4)積聚的神經(jīng)球轉(zhuǎn)入新鋪有Laminin的培養(yǎng)板中，漂浮的神經(jīng)球可以迅速貼壁，聚團(tuán)的神經(jīng)細(xì)胞開始鋪展，通過先貼壁分化_懸浮培養(yǎng)_再貼壁分化完成對NSC的富集過程。通用熒光染色步驟待染色細(xì)胞先用PBS洗一遍，再用4%多聚甲醛固定20min，PBS洗滌三次，每次lOmin。加入含0. 3% Triton和1 % BSA的PBS室溫孵育 40min, PBS洗三次，每次lOmin。加入一抗室溫60min，PBS洗三次，每次lOmin。加入二抗室溫避光45min，PBS洗三次，每次lOmin。加入DAPI，染核lOmin，PBS洗三次，每次lOmin。 以PBS 甘油(2 1)封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。實(shí)施例3 =NSC細(xì)胞裸鼠皮下注射成瘤實(shí)驗(yàn)NSC細(xì)胞用胰酶消化，分散成單個(gè)細(xì)胞后重懸于0. 3ml的PBS中。細(xì)胞懸液注射于雄性Balb/c裸鼠腋下部皮下。2周后可以看到注射ES細(xì)胞對照組裸鼠腋下出現(xiàn)畸胎瘤。 瘤體30-50天后成熟。成熟畸胎瘤分離后固定于10%中性福爾馬林中，石蠟包埋進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)切片，HE染色，并進(jìn)行顯微照相。而注射NSC細(xì)胞組未見成瘤。實(shí)施例4 =NSC向多種神經(jīng)細(xì)胞分化對NSC細(xì)胞繼續(xù)誘導(dǎo)為運(yùn)動神經(jīng)元的方法為N2B27+RA (IuM)分化4d， N2B27+RA (IuM) +SHH (100ng/ml)分化 7d，N2B27+SHH (50ng/ml) + ⑶NF (10ng/ml) +BDNF (lOng/ ml)+IGF(10ng/ml)分化IOd左右誘導(dǎo)為成熟的表達(dá)HB9的運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞；誘導(dǎo)NSC繼續(xù)分化為多巴胺神經(jīng)元的方法為N2B27+SHH(100ng/ml) +FGF8 (lOOng/
9ml)分化 5d, SHH(100ng/ml)+FGF8 (100ng/ml)+bFGF (10ng/ml)分化 8-10d, N2B27+⑶NF(10ng/ml)+BDNF(10ng/ml)+IGF(10ng/ml)分化 IOd 左右。對分化得到的神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色后，熒光染色方法同上，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。多巴胺運(yùn)動神經(jīng)元標(biāo)記物Tujl和TH表達(dá)見圖5和圖6所示。運(yùn)動神經(jīng)元標(biāo)記物HB9表達(dá)見圖7。經(jīng)過上述各個(gè)實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)，證明本發(fā)明成功地獲取了 NSC細(xì)胞，而且所提供的NSC細(xì)胞的免疫原性低，不存在動物源性血清和飼養(yǎng)層污染，而且可以在體外長期傳代，因此能為臨床細(xì)胞治療等應(yīng)用提供大量安全有效的NSC，意義重大。而且該類細(xì)胞同時(shí)表達(dá)0ct4和 Soxl蛋白，具有長期的自我更新能力和穩(wěn)定的神經(jīng)干細(xì)胞特性，有利于研究干細(xì)胞的自我更新與分化機(jī)理。盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式
已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)干細(xì)胞，其特征在于同時(shí)表達(dá)標(biāo)志蛋白0ct4和Soxl，并可在體外快速增殖和穩(wěn)定傳代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)干細(xì)胞，還同時(shí)表達(dá)S0X2、NeStin和Pax6。
3.一種分離、體外培養(yǎng)權(quán)利要求1的神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其包括如下步驟無菌條件下獲得從動物的胎兒腦組織，用胰酶消化分散后，用含添加ROCK信號通路抑制劑和GSK/3信號通路抑制劑的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至有神經(jīng)球樣細(xì)胞懸浮，將懸浮細(xì)胞繼續(xù)消化傳代培養(yǎng)，收集繼續(xù)存活的少數(shù)表達(dá)0ct4和Soxl的細(xì)胞，收獲所述細(xì)胞，即得到神經(jīng)干細(xì)胞。
4.一種分離、體外培養(yǎng)權(quán)利要求1的神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其特征在于使用分化液為添加ROCK信號通路抑制劑和GSK/3信號通路抑制劑的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液對動物的神經(jīng)細(xì)胞ES 進(jìn)行定向分化，包括步驟在所述分化液環(huán)境中將ES細(xì)胞貼壁分化，至表達(dá)Soxl的細(xì)胞開始聚集懸浮成神經(jīng)球時(shí)收集懸浮的神經(jīng)球，使之在Laminin上繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，通過貼壁、懸浮、再貼壁的方式進(jìn)行細(xì)胞富集，收集富集得到的細(xì)胞，即得到神經(jīng)干細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的神經(jīng)干細(xì)胞，其來自人、大鼠、小鼠、狗、兔或猴子。
6.權(quán)利要求3或4的方法，其中使用N2B27基礎(chǔ)培養(yǎng)液作為基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)液，ROCK信號通路抑制劑是Y27632，GSK/3信號通路抑制劑是CHIR99021。
7.權(quán)利要求1-2所述的神經(jīng)干細(xì)胞在制備治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中的用途。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述神經(jīng)退行性疾病選自下述疾病中的一種帕金森氏癥、 老年癡呆癥、腦中風(fēng)和退行性心臟病。
9.權(quán)利要求1-2所述的神經(jīng)干細(xì)胞在制備治療脊髓損傷的藥物中的用途。
10.權(quán)利要求1-2所述的神經(jīng)干細(xì)胞在制備神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種神經(jīng)干細(xì)胞株(NSC)，該類NSC細(xì)胞株可以分離自不同種屬的動物腦組織，也可以由胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和其它干細(xì)胞分化而來。其特征在于這類NSC可在體外快速增殖并穩(wěn)定傳代；可持續(xù)表達(dá)標(biāo)記蛋白Oct4和Sox1；可以高效分化為多種神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。本發(fā)明還提供有關(guān)NSC細(xì)胞的建系方法和用途。
文檔編號A61P9/00GK102191221SQ20101012610
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月17日
發(fā)明者劉韜, 吳孟超, 彭欣榮, 李琳芳, 錢其軍, 高海霞 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院