專利名稱：一種豬鏈球菌密度感應(yīng)系統(tǒng)阻斷多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種豬鏈球菌密度感應(yīng)系統(tǒng)阻斷多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
密度感應(yīng)(quorum sensing, QS)是指微生物群體在其生長過程中，由于群體密度的增加，導(dǎo)致其生理和生化特性的變化，顯示出少量菌體或單個菌體所不具備的特征(Fuqua WC, Winans SC, Greenberg EP (1994) Quorum sensing in bacteria: theLuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators. JBacteriol 176: 269-275)。它是細菌彼此之間傳遞信號的一種特殊機制，利用一種激素 樣的化合物作為信號分子(autoinducer, Al)來調(diào)節(jié)細菌基因的表達(Lerat E, MoranNA (2004) The evolutionary history of quorum-sensing systems in bacteria. MolBiol Evol 21: 903-913)。隨著細菌密度的增加，信號分子濃度也隨之增加，當(dāng)信號分子的濃度也達到一定的水平，通過包括受體蛋白在內(nèi)相關(guān)蛋白的信號傳遞，誘導(dǎo)或抑制信號最終傳遞到胞內(nèi)，影響特定基因的表達，調(diào)控微生物群體的生理特征，如生物發(fā)光、抗生素合成、生物被膜形成等。利用QS機制進行“細胞對細胞的交流”，微生物能夠在復(fù)雜的環(huán)境中協(xié)調(diào)一致，以“團隊作戰(zhàn)能力”使整個種群更好地存活下來(Swift S，DownieJA, Whitehead NA, Barnard AM, Salmond GP, et al. (2001) Quorum sensing as apopulation-density-dependent determinant of bacterial physiology. Adv MicrobPhysiol 45: 199-270.)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)了另一種新型的細菌群體感應(yīng)機制，即由LuxS蛋白參與合成的AI-2型信號分子介導(dǎo)的種間群體感應(yīng)。LuxS基因是產(chǎn)生AI-2分子所必需的，在許多革蘭氏陰性和陽性菌中都存在高度保守的LuxS類似物。AI-2是唯一的細菌非特異性信號分子，細菌可以利用AI-2感知其它細菌數(shù)量來調(diào)節(jié)自身行為，參與對其他種屬細菌的群體感應(yīng)，從而在同一個生存環(huán)境中協(xié)調(diào)自身基因的表達。由于在革蘭氏陰性菌與陽性菌中廣泛存在，故被看作細菌種群間的系統(tǒng)。目前細菌與細菌之間的信息交流已成為微生物研究的熱點，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)細菌的許多生理功能都受LuxS/AI-2系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，包括細菌發(fā)光，抗生素的合成，質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，毒力的變化，基因的表達，生物被膜的形成等。在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中LuxS所起的作用不僅有正調(diào)控還有負(fù)調(diào)控。由于使用抗生素帶來種種弊端，迫切需要找到一種能夠替代抗生素的東西來控制致病菌。目前認(rèn)為通過干擾致病菌的QS系統(tǒng)是一種行之有效的新手段。因此QS已成為農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點之一。由于QS控制細菌許多病基因的表達，因此任何能夠阻止QS信號分子集聚或受體識別信號分子的過程都可以阻斷依賴細菌QS的毒力基因表達。群體淬滅(Quenching quorum-sensing)是通過干擾微生物細胞間的QS系統(tǒng),阻止QS依賴型基因表達而防御病原菌感染的一種現(xiàn)象。目前已發(fā)現(xiàn)的群體淬滅主要有競爭性抑制和信號分子降解兩種方式。由于QS介導(dǎo)的是微生物病原性,干擾QS體系不會對病原菌產(chǎn)生選擇壓力，因此，這使得對QS猝滅劑和抑制機制的研究具有潛在的意義。豬鏈球菌(Streptococcus suis, SS)是豬的重要致病菌,可以引起腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎等疾病，也可導(dǎo)致生豬從業(yè)人員感染和死亡。豬群帶菌率接近100%，而致死率能達到近20%。由豬鏈球菌引起的豬鏈球菌病給我國養(yǎng)殖業(yè)和生豬從業(yè)人員帶來了極大的威脅。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種豬鏈球菌密度感應(yīng)系統(tǒng)阻斷多肽不僅能夠抑制豬鏈球菌，而且能夠消除抗生素所帶來的種種弊端。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種豬鏈球菌密度感應(yīng)系統(tǒng)阻斷多肽及其應(yīng)用，所述多肽具有用序列號I表示的氨基酸序列，序列號I表示的序列為TTMHSIRTNRHN。所述阻斷多肽體外抑制豬鏈球菌AI-2分子產(chǎn)生的應(yīng)用。 所述阻斷多肽提高動物體內(nèi)機體抵抗細菌感染的應(yīng)用。豬鏈球菌密度感應(yīng)系統(tǒng)阻斷蛋白的表達將質(zhì)粒P⑶NA3. I用HindiΙΙ/XhoI雙酶切后與寡聚核苷酸 P (5-AGCTT ACCACCATGCACCCAATCCGCACCGACCGCCACGACC-3)用 T4DNA 連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a中，得到攜帶有序列號I中氨基酸序列質(zhì)粒的工程菌。本發(fā)明具有以下優(yōu)點
I.本發(fā)明的阻斷因子能夠與密度感應(yīng)系統(tǒng)中的LuxS作用，并特異性干擾LuxS/AI-2密度感應(yīng)系統(tǒng)，在體外能抑制信號分子AI-2的產(chǎn)生，起到顯著降低豬鏈球菌感染實驗動物的作用。2.本發(fā)明的阻斷因子是一種蛋白質(zhì)，有兩種獲得該蛋白的途徑，可以人工合成，也可以通過原核表達高效獲得。3.本發(fā)明的阻斷因子是一種分泌性小肽，可以對多種細菌中的密度感應(yīng)系統(tǒng)做出干擾，因而其作用范圍廣泛。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例做詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。載體P⑶NA3.1 ( + )購自invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶、連接酶等試劑購自TAKARA公司；S腺苷同型半胱氨酸(SAM)購自sigma公司。質(zhì)粒提取、DAN純化、DNA回收試劑盒購自天根生物科技有限公司。實施例I
一種豬鏈球菌密度感應(yīng)系統(tǒng)阻斷多肽，其氨基酸序列為TTMHSIRTNRHN。豬鏈球菌密度感應(yīng)系統(tǒng)阻斷多肽的構(gòu)建方法表達豬鏈球菌密度感應(yīng)系統(tǒng)阻斷多肽的質(zhì)粒P⑶NA-P構(gòu)建將質(zhì)粒P⑶NA3. I用Hindlll/Xhol雙酶切后與寡聚核苷酸P(5-AGCTT ACCACCATGCACCCAATCCGCACCGACCGCCACGACC-3)用 T4DNA 連接酶室溫連接 2-4 小時，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a中，并涂布于含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)30小時，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pCDNA-P，具有序列號I中氨基酸序列。實施例2
多肽抑制豬鏈球菌信號分子AI-2實驗。SRH的制備將I mg/mL純化的Pfs重組蛋白與I mM SAM在10 mM磷酸鈉(sodiumphosphate buffer, pH 7. 5)緩沖液中，37° C 作用 I 小時,反應(yīng)液用 Millpore (10，000 Dacutoff)的超濾膜，進行超濾，去除反應(yīng)液中的蛋白。濾液即為SRH，濾液凍存于-80° C。將人工合成的多肽溶于IOmM磷酸鈉緩沖液中，同時加入純化的重組蛋白LuxS，37°C 作用 I 小時，加入 ImM SRH, 37°C 作用 I 小時，反應(yīng)液用 Millpore (IOOOOODa cutoff)的超濾膜，進行超濾，去除反應(yīng)液中的蛋白。取適量濾液用IOOmM磷酸鈉，O. ImM EDTA，pH 7. 2緩沖液作20倍稀釋。取200ul上述稀釋液，加入IOOul的5mM Ellman’ s試劑(DTNB，溶于IOOmM磷酸鈉，O. ImM EDTA, pH 7. 2緩沖液)，37° C作用15min，在412nm的波長下測光吸收值。表I多肽抑制性實驗
權(quán)利要求
1.一種豬鏈球菌密度感應(yīng)系統(tǒng)阻斷多肽，其特征在于所述多肽具有用序列號I表示的氣基酸序列，序列號I表不的序列為TTMHSIRTNRHN。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種豬鏈球菌密度感應(yīng)系統(tǒng)阻斷多肽的應(yīng)用，其特征在于所述阻斷多肽用于在體外抑制豬鏈球菌AI-2分子的產(chǎn)生。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種豬鏈球菌密度感應(yīng)系統(tǒng)阻斷多肽的應(yīng)用，其特征在于所述阻斷多肽用于提高動物體內(nèi)機體抵抗細菌感染。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種豬鏈球菌密度感應(yīng)系統(tǒng)阻斷多肽及其應(yīng)用。該多肽的氨基酸序列如序列號1所示，本發(fā)明的多肽能夠與密度感應(yīng)系統(tǒng)中的LuxS作用，并特異性干擾LuxS/AI-2密度感應(yīng)系統(tǒng)，在體外能抑制信號分子AI-2的產(chǎn)生，起到顯著降低豬鏈球菌感染動物的作用。本發(fā)明的阻斷因子是一種蛋白質(zhì)，有兩種獲得該蛋白的途徑，可以人工合成，也可以通過原核表達獲得。此外，本發(fā)明的阻斷因子是一種分泌性小肽，可以對多種細菌中的密度感應(yīng)系統(tǒng)做出干擾，作用范圍廣泛。
文檔編號A61K38/10GK102942617SQ20121046132
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者汪洋, 易力, 張才, 王臣, 李宏偉, 陸承平, 劉一塵, 李小康, 余祖華, 程相朝 申請人:河南科技大學(xué)