本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域，涉及地衣芽孢桿菌bl06及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
地衣芽孢桿菌為芽孢桿菌屬內(nèi)菌株，是目前得到廣泛應(yīng)用和研究，并具有巨大潛在開發(fā)價(jià)值的的菌株之一，菌體能通過產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，具有獨(dú)特的生物奪氧作用機(jī)制，抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)能夠產(chǎn)生多種促生相關(guān)物質(zhì)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。
農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，植物病原真菌性病害是威脅作物生產(chǎn)，影響作物產(chǎn)量和質(zhì)量的病原物。其中，黃瓜霜霉病是由古巴假霜霉菌(pseudoperonosporacubensis)引起的,是全世界范圍內(nèi)黃瓜產(chǎn)區(qū)最主要葉部病害之一。全世界大約有70多個(gè)國(guó)家先后發(fā)生過這種病害，對(duì)黃瓜生產(chǎn)威脅極大。目前，黃瓜霜霉病的防治措施主要依靠培育抗性品種，主要方法有雜交法、轉(zhuǎn)基因、紫外誘變和藥劑馴化，其次是選用化學(xué)藥劑防治。病害一旦發(fā)生，必須間隔三四天施藥一次控制病害，農(nóng)藥殘留問題異常突出，同時(shí)易產(chǎn)生抗藥性。
相似的植物病原真菌病害還有辣椒疫病、小麥赤霉病。均是嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要病害。
軟腐病主要由歐氏桿菌屬(erwinia)細(xì)菌和根霉屬(rhizopus)真菌引起的植物病害?？墒怪参锏慕M織或器官發(fā)生腐爛。病菌均為弱寄生菌，主要為害植物的多汁肥厚的器官，如塊根、塊莖、果實(shí)、莖基等。發(fā)病不限于田間,運(yùn)輸途中和貯藏期間也有發(fā)生,且為害更重。為害的作物種類甚多。中國(guó)主要的軟腐病有由軟腐歐氏桿菌(erwiniaaroideae)引起的十字花科作物、番茄、馬鈴薯、瓜類等的軟腐病,由黑根霉(rhizopusstolonifer)引起的甘薯軟腐病等。
隨著社會(huì)對(duì)綠色食品要求的呼應(yīng)，限制或少用、不用化學(xué)藥劑的聲音也越來越多，即使是一些防效相對(duì)穩(wěn)定的霜霉威等藥劑也不斷叫停。同時(shí)，消費(fèi)者逐漸意識(shí)到化學(xué)農(nóng)藥殘留問題對(duì)人體健康的影響，各界轉(zhuǎn)而開始使用生物農(nóng)藥，如克菌康、武夷菌素、綠盾豐、雙抗等，活體的生防菌劑主要有芽孢桿菌和假單胞類，但大多處于實(shí)驗(yàn)室研究開發(fā)階段。
生物防治的手段近些年不斷浮出視野，主要是利用一些芽孢桿菌屬菌株的發(fā)酵液及其次生代謝產(chǎn)物以及一些天然產(chǎn)物植物的代謝物，防效大多在50％到70％之間。相比化學(xué)藥劑,因其安全、口感品質(zhì)上都稍勝一籌，故其生物防治的研究也逐步在上臺(tái)階。已有大量研究報(bào)道了將頡頏菌引入植物可提高植物的抗病、抗蟲、抗逆性。由于頡頏菌在抑制植物病害方面的廣譜性、高效性以及安全性，目前成為農(nóng)藥市場(chǎng)發(fā)展的趨勢(shì)，被稱為是最有潛力的發(fā)展方向。因此，開發(fā)新的、更為高效和安全的微生物制劑控制病害的發(fā)生是提高社會(huì)生產(chǎn)總量的需要，同時(shí)更是農(nóng)業(yè)安全及可持續(xù)發(fā)展的需要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中，缺乏對(duì)蕓薹菜軟腐病引起的病害有較高防效的芽孢桿菌生防制劑的現(xiàn)狀，提供一種防治蕓薹菜軟腐病的單一生防菌菌株及其菌劑。
本發(fā)明的另一目的是提供該菌株的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
地衣芽孢桿菌hs06，于2016年12月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為cgmccno.13462。
由所述的地衣芽孢桿菌bl06制備的生防菌劑。
生防菌株bl06用于制備生防菌劑的方法為：將地衣芽孢桿菌bl06的種子菌液以1:500體積比接種至lb發(fā)酵培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，28℃、200rpm培養(yǎng)48h，然后6000rpm離心10min，用滅菌水進(jìn)行稀釋制成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為1×109～1×1010cfu/ml。
當(dāng)然，利用所述的防治霜霉菌等真菌病害的地衣芽孢桿菌bl06菌株制備生防菌劑并不限于以上方法。凡是能夠大量培養(yǎng)bl06，且保持其抗霜霉病菌病害活性的方法均可用于制備本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的生防菌劑。
所述的保藏號(hào)為cgmccno.13462的地衣芽孢桿菌bl06種子菌液制備方法為：將保藏號(hào)為cgmccno.13462的芽孢桿菌hs06菌株接種到lb培養(yǎng)液中28℃培養(yǎng)200rpm振蕩培養(yǎng)至600nm處的od值為0.8時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。
本發(fā)明所述的地衣芽孢桿菌bl06在制備防治蕓薹菜軟腐病的生防菌劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的地衣芽孢桿菌bl06制備的生防菌劑在防治蕓薹菜軟腐病中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的地衣芽孢桿菌bl06在促進(jìn)植物生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
有益效果：
本發(fā)明是生物制劑，完全沒有因化學(xué)農(nóng)藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利于蔬菜的無公害生產(chǎn)，農(nóng)民可以不用或減少其他化學(xué)農(nóng)藥的用量，這不僅可減少化學(xué)農(nóng)藥的殘留問題的產(chǎn)生，同時(shí)有利于提高蔬菜的品質(zhì)。
大田試驗(yàn)表明：該地衣芽孢桿菌bl06(cgmccno.13462)對(duì)蕓薹菜軟腐病的溫室生防效果可達(dá)79.03％，并能夠有效促進(jìn)黃瓜生長(zhǎng)。
生物樣品保藏信息
一種地衣芽孢桿菌bl06，分類命名為bacilluslicheniformis.，于2016年12月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號(hào)為cgmccno.13462
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
篩選方法：地衣芽孢桿菌bl06(cgmccno.13462)由江蘇省淮安市丁集鎮(zhèn)黃瓜日光大棚中黃瓜根圍分離到。將黃瓜根組織切成1cm的小片，用1％的次氯酸鈉浸泡5min，70％酒精浸泡1-2min，無菌水清洗3次(取最后一次清洗的溶液100μl涂于r2a固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，若48h后無菌生長(zhǎng)則認(rèn)為表面消毒干凈，無菌)。取3g消毒好的樣品置于菌研缽中，加入27ml無菌的0.85％nacl，浸軟組織，研磨，用無菌的0.85％nacl梯度稀釋。取10-1、10-2、10-3三個(gè)梯度的稀釋液各100μl涂于r2a上，28℃培養(yǎng)48h。挑取最大的單菌落接種到新鮮r2a固體培養(yǎng)基，經(jīng)反復(fù)轉(zhuǎn)接得到純化菌株。將純化后的菌株用40％甘油保存于-70℃超低溫冰箱中。
鑒定方法：通過形態(tài)特征，生理生化實(shí)驗(yàn)和16srdna序列分析對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定。
形態(tài)學(xué)特征：革蘭氏陽性桿菌，細(xì)胞形態(tài)和排列呈桿狀、單生，產(chǎn)近中生橢圓形芽孢，包囊稍膨大，在肉汁培養(yǎng)基上菌落扁平、邊緣不整齊，表面粗糙褶皺。
16srrna基因擴(kuò)增和序列分析:
地衣芽孢桿菌l06在r2a培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，以12000r/min離心5min收集菌體，采用上海賽百盛基因技術(shù)有限公司的基因組dna快速提取試劑盒，提取細(xì)菌的基因組dna，以提取的dna產(chǎn)物為模板，用細(xì)菌16srrna擴(kuò)增通用引物u8-27(5’-agagtttgatc(ac)tggctcag-3’)、l1494-1514(5’-ctacgg(ag)taccttgttacgac-3’)從基因組dna中擴(kuò)增出16srdna基因片段。pcr產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。通過blast軟件對(duì)測(cè)定16srrna基因序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果簡(jiǎn)表，因此，將該菌株鑒定為地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)。
表1lgn-3測(cè)序比對(duì)結(jié)果
實(shí)施例2bl06生防菌劑的制備
將地衣芽孢桿菌屬bl06(cgmccno.13462)菌株接種到lb培養(yǎng)液中28℃200rpm振蕩培養(yǎng)16h后，每隔2h在超凈工作臺(tái)中取樣測(cè)其在600nm處的od值，當(dāng)od值為0.8時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，此菌液作為種子菌液。把種子菌液以1:500體積比接種至lb發(fā)酵培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，28℃、200rpm培養(yǎng)48h，然后6000rpm離心10min，取沉淀即得所述的生防菌劑hs10。所得生防菌劑中活菌總濃度為1×109～1×1010cfu/ml。
實(shí)施例3溫室實(shí)驗(yàn)測(cè)定bl06對(duì)黃瓜促生作用
生防菌處理組每株苗用30ml濃度為108cfu/ml的菌液處理，對(duì)照組用清水處理，每個(gè)處理12棵苗，每處理重復(fù)3次。接種25天后測(cè)量黃瓜株高、葉面積及鮮重、干重等指標(biāo)。生物量增加(％)＝(處理組植株鮮重-對(duì)照植株鮮重)/對(duì)照植株鮮重×100％。
溫室促生數(shù)據(jù)顯示(表2)，bl06處理的黃瓜植株在株高、葉面積、鮮重等指標(biāo)上均高于對(duì)照，植株生物增量為15.62％。bl06處理的瓜苗干重為4.89g/株，顯著小于對(duì)照組，這說明菌劑處理的植株含水量更高，這可能是植株長(zhǎng)勢(shì)較好的原因。
表2:bl06對(duì)黃瓜苗的促生效果
注：數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示處理間在p＝0.05的顯著水平下，差異性顯著(duncantest)。
實(shí)施例4溫室實(shí)驗(yàn)測(cè)定bl06對(duì)蕓薹菜軟腐病的防治效果
生防菌處理方法：蕓薹植株移栽時(shí)用5×107cfu/mlhs10菌液灌根加噴霧處理，共處理三次。每個(gè)處理3株苗。生防菌第一次處理5d后，接種軟腐病菌。
病原菌接種方法：用1×107cfu/ml病原菌液噴施葉片，用保鮮膜封閉保濕，2d后取掉保鮮膜。
病原菌接種10d左右，蕓薹開始發(fā)病時(shí)統(tǒng)計(jì)病情，之后每天統(tǒng)計(jì)一次，待空白對(duì)照病害嚴(yán)重度達(dá)到100％時(shí)停止統(tǒng)計(jì)。
表4.生防菌hs10對(duì)蕓薹菜軟腐病防效