本發(fā)明涉及一種適用于制漿過程的地衣芽孢桿菌工程菌及其構(gòu)建方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

制漿造紙工業(yè)是國家支柱性產(chǎn)業(yè)之一，但傳統(tǒng)的制漿造紙工業(yè)也是污染大戶。造紙行業(yè)的污染主要是在制漿生產(chǎn)過程中產(chǎn)生，目前，傳統(tǒng)的制漿方法主要采用化學(xué)制漿法，而化學(xué)制漿法在制漿過程中產(chǎn)生大量含殘余木素和化學(xué)物質(zhì)的廢液，正是污染的罪魁禍?zhǔn)住Ｒ虼?，徹底解決制漿造紙工業(yè)的廢水污染，研制開發(fā)無污染或低污染制漿造紙的技術(shù)已經(jīng)迫在眉睫。

現(xiàn)代制漿造紙工業(yè)的發(fā)展及其出現(xiàn)的一系列問題，使其與生物技術(shù)特別是微生物工程的聯(lián)系日趨緊密。近十幾年來，人們對(duì)生物技術(shù)在制漿造紙工業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)行了大量的研究，其研究內(nèi)容幾乎涉及了制漿造紙工業(yè)的各個(gè)方面。生物制漿，其原理是利用具有木素降解能力的微生物(主要是白腐菌類)選擇性地分解植物纖維原料中的木素。但由于木素不能做為碳源支持微生物的生長而需利用半纖維素和纖維素的分解以獲得能量，因此選擇無纖維素酶活的菌株就顯得非常重要。同時(shí),由于利用白腐菌處理原料的周期太長，難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的要求，因而有的研究者傾向于“酶法制漿”。利用降解木素酶，在常溫和常壓條件下可使木片中木素去除率達(dá)到75％～80％，紙漿得率高達(dá)60％，從而降低纖維原料用量和廢水污染負(fù)荷，松木和楊木木片都能用于生物制漿，尤其是闊葉材中木素通常易于被酶降解。但由于目前酶的價(jià)格昂貴，加上處理時(shí)間又長，要利用酶工程的純生物制漿，尚難以短期內(nèi)在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用。

地衣芽孢桿菌在自然界中分布廣泛，較其它木質(zhì)纖維素降解微生物具有繁殖快、適應(yīng)性好、木質(zhì)纖維素降解能力強(qiáng)等特點(diǎn)，在天然木質(zhì)纖維素降解過程中也發(fā)揮重要的作用，但由于天然地衣芽孢桿菌具有較強(qiáng)的纖維素降解能力，因此直接應(yīng)用在制漿過程中會(huì)損傷纖維素組分，降低纖維素回收率，地衣芽孢桿菌基因組中含有十種纖維素降解相關(guān)酶，完全敲除該菌纖維素酶基因難以操作，同時(shí)考慮到不同酶系之間存在協(xié)同降解作用，纖維素酶活性完全喪失會(huì)明顯抑制該菌對(duì)半纖維素和木質(zhì)素的降解效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適用于制漿過程的地衣芽孢桿菌工程菌及其構(gòu)建方法。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種低產(chǎn)纖維素酶地衣芽孢桿菌，將地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)中的編碼內(nèi)切纖維素酶基因celB失活后獲得；

所述celB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述編碼內(nèi)切纖維素酶基因celB失活為通過基因敲除、基因增補(bǔ)、基因替換或基因突變引起編碼內(nèi)切纖維素酶基因celB的啟動(dòng)子、終止子或編碼區(qū)的變化導(dǎo)致編碼內(nèi)切纖維素酶基因celB無法表達(dá)。

上述低產(chǎn)纖維素酶地衣芽孢桿菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)提取地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)20085菌體的DNA，以DNA為模板，使用引物F₁和R₁進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到用于celB基因敲除的同源臂celB1；

所述的PCR引物序列如下：

F1:CGGGATCCCGCTTCTAAAACACCCGTTG

R1:AAGGCCAGCAAAAGTACATGACATTGCCGTCT

(2)提取穿梭質(zhì)粒PHT01的DNA，以DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到Cm^r片段；

所述的PCR引物序列如下：

F₂:ATGTCATGTACTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA

R₂:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT

(3)將步驟(i)制得的celB1片段與步驟(ii)制得的Cm^r片段進(jìn)行重疊PCR，制得celB1-Cm^r片段；

(4)將敲除載體用限制性內(nèi)切酶BamH I酶切，并利用電轉(zhuǎn)化儀轉(zhuǎn)化至地衣芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)復(fù)蘇后，涂在含氯霉素的培養(yǎng)基上，在35～38℃培養(yǎng)1～2天，篩選具有氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，制得低產(chǎn)纖維素酶地衣芽孢桿菌。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)來源于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)CICC 20085。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，PCR擴(kuò)增體系如下：

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，PCR擴(kuò)增體系如下：

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸3min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，重疊PCR的初次擴(kuò)增體系為：

所述的重疊PCR的補(bǔ)充擴(kuò)增體系為：

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，重疊PCR的初次擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5個(gè)循環(huán)；72℃延伸2min；

所述的重疊PCR的補(bǔ)充擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸5min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中，地衣芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法如下：

挑取新鮮的Bacillus licheniformis 20085單菌落，培養(yǎng)至菌體濃度OD₆₀₀為0.7～0.9，置于冰上冷卻，冷卻后離心，然后用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液洗滌菌體3～5次，電轉(zhuǎn)緩沖液重懸菌體后分裝至預(yù)冷的無菌的EP管，制得Bacillus licheniformis 20085電感受態(tài)細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中，含氯霉素的培養(yǎng)基為含有氯霉素濃度為20～30μmol/mL的L B固體培養(yǎng)基。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中，電轉(zhuǎn)化的條件為電壓1500～2000V，電擊時(shí)間4～5ms。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中，復(fù)蘇為在35～38℃條件下于液體復(fù)蘇培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～4h，所述液體復(fù)蘇培養(yǎng)基每升組分如下：

蛋白胨8～10g，酵母浸粉3～5g，氯化鈉8～10g，山梨醇85～100g，甘露醇60～800g，蒸餾水定容至1000mL。

有益效果

1、本發(fā)明構(gòu)建的低產(chǎn)纖維素酶地衣芽孢桿菌菌株，既克服了纖維素酶過高表達(dá)引起紙漿纖維的破壞，同時(shí)一定程度低產(chǎn)的纖維素酶能夠保障半纖維素酶和木質(zhì)素酶紙漿處理效果的發(fā)揮，具有廣泛的應(yīng)用前景；

2、本發(fā)明首次在菌株構(gòu)建過程中選擇性從十種纖維素酶中敲除編碼內(nèi)切纖維素酶基因celB，取得了通過傳統(tǒng)發(fā)酵條件優(yōu)化預(yù)料不到的技術(shù)效果——纖維素酶活性及纖維素水解能力顯著下降，僅為原菌株的1/10左右，但半纖維素和木質(zhì)素水解能力保留85％以上。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的celB基因敲除轉(zhuǎn)化子的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖中泳道M為DNA分子量標(biāo)記(DNA marker)，泳道1-4為轉(zhuǎn)化子條帶，大小為1834bp。

圖2為本發(fā)明構(gòu)建的低產(chǎn)纖維素酶地衣芽孢桿菌菌株發(fā)酵能力的傅里葉紅外光譜分析圖；

圖中，830cm^-1芳香核C-H、1235cm^-1愈創(chuàng)木酚與C＝O伸縮振動(dòng)、1593cm^-1C-O伸縮振動(dòng)、是木質(zhì)素的特征吸收峰；2916cm^-1木聚糖的C-H不對(duì)稱伸縮振動(dòng)，是半纖維素的特征吸收峰；3400cm^-1為纖維素的特征吸收峰。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。

生物材料來源：

地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)20085保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)；編號(hào)為CICC20085；

穿梭質(zhì)粒PHT01購自杭州寶賽生物科技有限公司；

L B固體培養(yǎng)基，每升組分如下：

蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化鈉10g，瓊脂20g，蒸餾水定容至1000mL，pH 7.0～7.4。

L B培養(yǎng)基，每升組分如下：

蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化鈉10g，蒸餾水定容至1000mL，pH 7.0～7.4。

實(shí)施例1：基因敲除片段構(gòu)建

1)(i)提取Bacillus licheniformis 20085DNA(采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒)，以DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到同源臂celB1；

所述的PCR引物序列如下：

F1:CGGGATCCCGCTTCTAAAACACCCGTTG

R1:AAGGCCAGCAAAAGTACATGACATTGCCGTCT

所述的PCR擴(kuò)增體系為：

所述的PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存；

瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物，長度為589bp，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物-20℃保存，備用；

(ii)提取穿梭質(zhì)粒PHT01的DNA，以DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到Cm^r片段；

所述的PCR引物序列如下:

F₂:ATGTCATGTACTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA

R₂:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT

所述的PCR擴(kuò)增體系為：

所述的PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸3min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存；

瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物，長度為1245bp,使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物-20℃保存，備用；

(iii)將步驟(i)制得的celB1片段與步驟(ii)制得的Cm^r片段進(jìn)行重疊PCR，制得celB1-Cm^r片段；

所述的重疊PCR的擴(kuò)增體系為：

所述的重疊PCR的初次擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5個(gè)循環(huán)；72℃延伸2min；

所述的重疊PCR的補(bǔ)充擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸5min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存；

瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物，長度為1823bp,使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物-20℃保存，備用；

實(shí)施例2：制備地衣芽孢桿菌感受態(tài)

(i)挑取新鮮LB固體培養(yǎng)基表面的Bacillus licheniformis 20085單菌落，接種于10mL GM培養(yǎng)基中，37℃、220r/min，過夜培養(yǎng)；

(ii)取1mL上述菌液轉(zhuǎn)接到100mLGM培養(yǎng)基，37℃、220r/min培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.9；

(iii)將菌液轉(zhuǎn)移至100mL離心管，冰浴15-20min，使菌體停止生長；

(iv)冰浴后4℃、5000g、5min離心，收集菌體；

(v)離心后的菌體用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液(ETM)洗滌2-3次；

(vi)洗滌結(jié)束后，使用1000μL電轉(zhuǎn)緩沖液重懸菌體；

(vii)將制備好的感受態(tài)細(xì)胞分裝100μL每管，-80℃保存，備用。

其中，GM培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基+0.5M山梨醇

ETM：0.5M山梨醇+0.5M甘露醇+10％甘油

RM培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇

實(shí)施例3：celB1-Cm^r片段電轉(zhuǎn)化Bacillus licheniformis 20085

(i)將celB1-Cm^r片段用限制性內(nèi)切酶BamH I消化；

酶切體系(40μL)如下：

(ii)濃縮純化酶切產(chǎn)物

(1)加入1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積無水乙醇，置于-20℃冰箱20min；

(2)12000r/min，離心5min得沉淀；

(3)300μL體積百分比濃度為75％的乙醇溶液重懸沉淀；

(4)12000r/min，離心5min，除去乙醇，37℃風(fēng)干30min；

(5)加入15～18μL ddH₂O重懸DNA，并置于-20℃保存。

(iii)電轉(zhuǎn)化

首先利用核酸超微量分光光度計(jì)測(cè)定celB1-Cm^r片段濃度，達(dá)到349.63ng/μL濃度后進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化條件為電壓1800V，電擊時(shí)間5ms，將得到的細(xì)胞經(jīng)液體復(fù)蘇培養(yǎng)基在37℃復(fù)蘇培養(yǎng)4h，取100μL涂布在含濃度25μmol/mL氯霉素的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)1～2天，篩選具有氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子；

所述液體復(fù)蘇培養(yǎng)基每升組分如下：

蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化鈉10g，山梨醇91g，甘露醇69g，蒸餾水定容至1000mL。

實(shí)施例4：陽性重組菌的培養(yǎng)及鑒定

挑取上述陽性重組菌落，接種到含氯霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)完成后，使用上海生物工程有限公司提供的試劑盒提取重組菌DNA，并以獲得的基因組為模板，F(xiàn)₁和R₂為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證；

所述的PCR引物序列如下:

F₁:CGGGATCCCGCTTCTAAAACACCCGTTG

R₂:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT

其中，下劃線標(biāo)識(shí)的為酶切位點(diǎn)

所述的PCR擴(kuò)增體系為20μl：

所述的PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸4min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存，瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物。

實(shí)施例5：低產(chǎn)纖維素酶Bacillus licheniformis工程菌在竹粉制漿預(yù)處理過程的應(yīng)用

(1)菌種在35℃的條件下于活化培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)3.5h，然后按體積百分比為1％的比例接種低產(chǎn)纖維素酶地衣芽孢桿菌于裝液量為30mL三角瓶，其中抗生素濃度為35mg/mL，培養(yǎng)條件為35℃、220rpm、12h，得到含低產(chǎn)纖維素酶地衣芽孢桿菌的菌液；

活化培養(yǎng)基配方為(g/L)：蛋白胨10、酵母浸粉5、氯化鈉10，蒸餾水定容，pH7.0～7.4；121℃滅菌20min；

(2)將(1)中得到低產(chǎn)纖維素酶工程菌的菌液按接種量3％接種于100mL含有抗生素濃度為35mg/mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃、220rpm的條件下于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵4d，得到發(fā)酵液；

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L)：蛋白胨4、硫酸銨4、磷酸二氫鉀1、七水合硫酸鎂0.4、氯化鈉5，蒸餾水定容；121℃滅菌20min；

(3)發(fā)酵液酶活測(cè)定

發(fā)酵24h、48h、72h、96h時(shí)取樣，15000g、4℃離心10min，小心吸取上清液于預(yù)冷的EP管中，即得發(fā)酵粗酶液。

采用DNS法以羧甲基纖維素(CMC)為底物測(cè)定酶活的具體方法為：

取750μL粗酶液和750μL的CMC溶液在15mL試管中混合均勻后，于30℃反應(yīng)60min；之后立刻加入3mL的DNS試劑，并將試管置于沸水浴中煮沸5min，煮沸步驟在使DNS和底物結(jié)合顯色的同時(shí)，也能使酶蛋白失活，終止酶反應(yīng)。之后將試管冰水混合物中冰浴，待其冷卻后從反應(yīng)體系中取200μL反應(yīng)液，稀釋于2.5mL去離子水中，并測(cè)量其OD₅₄₀nm的值。

實(shí)驗(yàn)中，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)溶液，以每分鐘生成1μg葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。得到結(jié)果低產(chǎn)纖維素酶工程菌發(fā)酵液中內(nèi)切纖維素酶活較原始菌株Bacillus licheniformis 20085降低了1.36U/mL。

發(fā)酵后竹粉殘?jiān)酶道锶~紅外光譜技術(shù)檢測(cè)低產(chǎn)纖維素酶Bacillus licheniformis工程菌的能力。其中，830cm^-1芳香核C-H、1235cm^-1愈創(chuàng)木酚與C＝O伸縮振動(dòng)、1593cm^-1C-O伸縮振動(dòng)、是木質(zhì)素的特征吸收峰；2916cm^-1木聚糖的C-H不對(duì)稱伸縮振動(dòng)，是半纖維素的特征吸收峰；3400cm^-1為纖維素的特征吸收峰。由圖2看出：低產(chǎn)纖維素酶Bacillus licheniformis工程菌纖維素水解能力顯著下降，而半纖維素和木質(zhì)素水解能力保留85％以上。