一種海洋地衣芽孢桿菌蛋白及其在心血管方面應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種海洋地衣芽孢桿菌蛋白，制備步驟：取海帶內(nèi)生地衣芽孢桿菌DNN6，將地衣芽孢桿菌DNN6接種于液體培養(yǎng)基中，該液體培養(yǎng)基的配方為：蔗糖40-50g/L和蛋白胨8-10g/L，pH調(diào)配成9；上步驟結(jié)束后分裝，每瓶裝100-200mL液體培養(yǎng)基，溫度30-35℃，轉(zhuǎn)速為150-200rpm,搖床培養(yǎng)4-5天；將上步驟的發(fā)酵液在8000r/min的條件下離心處理，去除菌體，然后加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為95%，4℃靜置過夜，過濾將沉淀用蒸餾水溶解后，再用截留分子量為3600道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥，得海洋地衣芽孢桿菌蛋白。該蛋白在心血管方面的應(yīng)用，工藝簡單、成本低廉。
【專利說明】一種海洋地衣芽孢桿菌蛋白及其在心血管方面應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種海帶內(nèi)生地衣芽孢桿菌DNN6 {Bacilluslicheniformis DNN6)菌株蛋白及在心血管方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]海帶QMmirmria Japonica Aresch)是一種在低溫海水中生長的大型海生褐藻植物。它生長于水溫較低的海中。海帶主要是自然生長，也有人工養(yǎng)殖，多以干制品行銷于市，質(zhì)量以色褐、體短、質(zhì)細(xì)而肥厚者為佳。海帶有“長壽菜”、“海上之蔬” “含碘冠軍”的美譽(yù)。
[0003]海帶作為一種重要的海洋資源，其食用與藥用價(jià)值早為世人所知。從海帶中提取的有效成分具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗HIV和增強(qiáng)免疫功能，對治療心腦血管疾病和中、早期慢性腎衰等均有一定的作用。海帶中還含有一些共附微生物，但這些微生物及其代謝產(chǎn)物迄今未止還沒有被充分利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、成本低廉的海帶內(nèi)生地衣芽孢桿菌DNN6(,Bacillus licheniformis DNN6)菌株蛋白及其在心血管方面的應(yīng)用，以充分利用海帶的共附微生物，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005]本發(fā)明的一種海洋地衣芽孢桿菌蛋白，按如下步驟制備:
a.取海帶內(nèi)生地衣芽抱桿菌DNN6(Bacilluslicheniformis DNN6),該菌株已于2012年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號:CGMCC No: 7077 ；
b.將地衣芽孢桿菌DNN6接種于液體培養(yǎng)基中，該液體培養(yǎng)基的配方為:蔗糖40-50g/L和蛋白胨8-10 g/L，pH調(diào)配成9;
c.b步驟結(jié)束后分裝，每瓶裝100-200 mL液體培養(yǎng)基，溫度30_35°C，轉(zhuǎn)速為150-200rpm,搖床培養(yǎng)4-5天；
d.將c步驟的發(fā)酵液在8000r/min的條件下離心處理，去除菌體，然后加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為95%，4°C靜置過夜，過濾將沉淀用蒸餾水溶解后，再用截留分子量為3600道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥，得海洋地衣芽孢桿菌蛋白。
[0006]本發(fā)明的一種海洋地衣芽孢桿菌蛋白在心血管方面的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的海洋地衣芽孢桿菌蛋白制備方法工藝簡單、成本低廉，從海帶內(nèi)生地衣芽孢桿菌菌株的發(fā)酵液中所提取的蛋白具有降血壓活性，可應(yīng)用于降血壓藥物的研制和開發(fā)，具有產(chǎn)業(yè)價(jià)值。
[0008]本發(fā)明中應(yīng)用的海洋地衣芽孢桿菌菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號:CGMCC No: 7077?！揪唧w實(shí)施方式】
[0009]本發(fā)明實(shí)施例依次按如下步驟進(jìn)行:
a.將菌株地衣芽孢桿菌DNN6接種于蔗糖40-50 g/L和蛋白胨8_10 g/L, pH為9的液體培養(yǎng)基中，每瓶裝100-200 mL液體培養(yǎng)基，溫度30-35°C，轉(zhuǎn)速為150-200 rpm,搖床培養(yǎng)4-5天。該地衣芽孢桿菌菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號:CGMCCNo: 7077。
[0010]b.將發(fā)酵液8000 r/min離心去除菌體，然后加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為95%，4°C靜置過夜，過濾將沉淀用蒸餾水溶解后，再用截留分子量為3600道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥，得海洋地衣芽孢桿菌蛋白，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明該沉淀物為蛋白質(zhì)。
[0011]取凍干樣品用PBS溶液溶解成I mg/mL的溶液,分別用180 mg/kg和18 mg/kg的劑量，頸靜脈給藥SD大鼠(第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，兩個(gè)劑量均能使收縮壓下降
3.17±0.1 KPa;離體心臟灌注18 mg/kg可以降低SD大鼠離體心臟的收縮幅度。
[0012]c.對大鼠血壓的影響
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性SD大鼠購自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)期間，保持動(dòng)物房室溫在22°C左右，相對濕度70%左右，早8點(diǎn)至晚8點(diǎn)自動(dòng)照明。動(dòng)物自由進(jìn)食，自由飲水。
[0013]動(dòng)脈導(dǎo)管的制備:PElO (內(nèi)徑0.3 cm，外徑0.5 cm)和PE50 (內(nèi)徑0.58 mm，外徑
0.96 mm)兩種規(guī)格導(dǎo)管制備動(dòng)脈導(dǎo)管，將PElO管與PE50管通過細(xì)鐵絲對接，加熱后按壓對接處形成的隆起，冷卻后抽出鐵絲，檢查對接處牢固、通暢后即可應(yīng)用。
[0014]20%氨基甲酸乙酯(烏拉坦)5 mL / kg腹腔麻醉大鼠，將其仰臥固定于動(dòng)物恒溫解剖臺，分離一側(cè)股動(dòng)脈，遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端插入注滿1%肝素生理鹽水的動(dòng)脈插管，插管的另一側(cè)連接三通管后經(jīng)由PowerLab MLTl 199有創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)，動(dòng)態(tài)記錄動(dòng)脈血壓。待血壓穩(wěn)定后，由頸靜脈插管給DNN6菌株蛋白(180 mg/kg和18 mg/kg),并記錄血壓變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩個(gè)劑量均能使收縮壓下降3.17±0.1 KPa，具有開發(fā)降壓藥的潛力。
[0015]d.離體鼠心模型的建立:將SD大鼠用烏拉坦(1.2 g*kg_l)和肝素(400IU ?kg-l)混合液腹腔麻醉后 ,迅速開胸取心,按經(jīng)典的Langendorff方法,經(jīng)升主動(dòng)脈逆行插入灌注管，使其置于主動(dòng)脈瓣上方，以利冠狀動(dòng)脈灌注。采用KH液進(jìn)行平衡灌注，于灌注前30 min及灌注時(shí)充以混合氣體(95% 02 + 5% C02 )，使平衡灌注的KH液充分達(dá)到氧飽和，pH值維持在7.35^7.45，保持灌注溫度為37.(TC ^37.5°C，灌注壓力為60 mmHg。將兩根懸浮心電記錄電極分別放置于肺動(dòng)脈圓錐及心尖部引導(dǎo)出心電圖，并記錄心率等心功能指數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)用含菌株DNN6的蛋白(18 mg/kg)的K-H液灌流心臟后4 min，心臟收縮幅度降低23%。再用K-H液恢復(fù)灌流后，心臟收縮幅度和靜息張力逐漸恢復(fù)。菌株DNN6蛋白的降血壓作用可能與降低心臟功能有關(guān)。
【權(quán)利要求】
1.一種海洋地衣芽孢桿菌蛋白，其特征在于:按如下步驟制備: a.取海帶內(nèi)生地衣芽抱桿菌DNN6(ifeci77w5.licheniformis DNN6),該菌株已于2013年I月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號:CGMCC No: 7077 ； b.將地衣芽孢桿菌DNN6接種于液體培養(yǎng)基中，該液體培養(yǎng)基的配方為:蔗糖40-50g/L和蛋白胨8-10 g/L，pH調(diào)配成9; c.b步驟結(jié)束后分裝，每瓶裝100-200 mL液體培養(yǎng)基，溫度30_35°C，轉(zhuǎn)速為150-200rpm,搖床培養(yǎng)4-5天； d.將c步驟的發(fā)酵液在8000r/min的條件下離心處理，去除菌體，然后加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為95%，4°C靜置過夜，過濾將沉淀用蒸餾水溶解后，再用截留分子量為3600道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥，得海洋地衣芽孢桿菌蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海洋地衣芽孢桿菌蛋白在心血管方面的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P9/12GK103965303SQ201310034684
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月30日
【發(fā)明者】張付云, 徐鳳, 楊陽, 王維才 申請人:大連海洋大學(xué), 張付云