一種地衣芽孢桿菌及微生物菌劑和它們在礦山生態(tài)修復(fù)中的用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種地衣芽孢桿菌，該地衣芽孢桿菌(Bacillus?licheniformis)的保藏編號為CCTCC?NO：M2013497。本發(fā)明還提供了一種微生物菌劑，該微生物菌劑通過包括如下步驟的制備方法制備得到：將本發(fā)明如上所述的地衣芽孢桿菌接種到液態(tài)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到種子液；(2)將所述種子液接種到固態(tài)培養(yǎng)基中并進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵后的物料。本發(fā)明還提供了如上所述的地衣芽孢桿菌或如上所述的微生物菌劑在礦山生態(tài)修復(fù)中的用途。通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明能夠顯著的促進(jìn)綠化植物的根系生長并達(dá)到更高的發(fā)達(dá)程度，從而進(jìn)一步增加了邊坡的穩(wěn)定性。
【專利說明】—種地衣芽孢桿菌及微生物菌劑和它們在礦山生態(tài)修復(fù)中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用領(lǐng)域，具體地，涉及一種地衣芽孢桿菌(BaciIIuslicheniformis)，含有該地衣芽孢桿菌的微生物菌劑以及它們在礦山生態(tài)修復(fù)中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]礦山修復(fù)即對礦業(yè)廢棄地污染進(jìn)行修復(fù)，實現(xiàn)對土地資源的再次利用。礦山開采過程中會產(chǎn)生大量非經(jīng)治理而無法使用的土地，又稱礦業(yè)廢棄地，廢棄地存在因生產(chǎn)導(dǎo)致的各種污染。
[0003]礦業(yè)廢棄地成因很多，包括剝離表土堆積而成、巖石碎塊和低品位礦石堆積形成、空采區(qū)和塌陷區(qū)形成、尾礦堆積形成、受采礦影響而無法利用開發(fā)的土地等。從廣義上來考慮，還包括礦石的冶煉所形成的冶煉渣堆積地，以及冶煉過程中重金屬和二氧化硫排放所導(dǎo)致的退化土地。
[0004]礦業(yè)廢棄 地多以重金屬污染和礦山酸性排水污染為主，治理內(nèi)容以生態(tài)修復(fù)和污染治理為主。礦山開發(fā)對生態(tài)環(huán)境的影響包括:對土地資源的影響、對水資源的影響、對大氣的影響和生物多樣性損失。
[0005]生態(tài)修復(fù)是指停止對生態(tài)的干擾和破壞，利用生態(tài)系統(tǒng)的自我恢復(fù)能力，輔以人工措施，使遭到破壞的生態(tài)系統(tǒng)逐步恢復(fù)或使生態(tài)系統(tǒng)向良性循環(huán)方向發(fā)展的過程。礦山生態(tài)修復(fù)的措施主要包括:邊坡的治理措施、尾礦的治理措施、土壤基層改良和礦山重金屬污染的植物修復(fù)等。
[0006]其中，邊坡治理主要工作就是要穩(wěn)定邊坡。該過程的任務(wù)是清除危石、降坡削坡，將未形成臺階的懸崖盡量構(gòu)成水平臺階，把邊坡的坡度降到安全角度以下，以消除崩塌隱患；之后就要對已經(jīng)處理的邊坡進(jìn)行復(fù)綠，使其進(jìn)一步保持穩(wěn)定。
[0007]在對邊坡的復(fù)綠過程中，常用的植物包括胡枝子(Lespedeza bicolor Turcz.)和/或紫穗槐(Amorpha fruticosa Linn.)等灌木,但是在實際使用過程中發(fā)現(xiàn)上述植物的根系在礦山邊坡中的發(fā)達(dá)程度不高，難以進(jìn)一步保持礦山邊坡的穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的發(fā)明人分離了一株地衣芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著的促進(jìn)胡枝子和紫穗槐的根系在礦山邊坡中生長并達(dá)到更高的發(fā)達(dá)程度，從而進(jìn)一步增加了礦山邊坡的穩(wěn)定性，由此得到了本發(fā)明。
[0009]本發(fā)明提供了一種地衣芽孢桿菌，該地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的保藏編號為 CCTCC NO:M2013497o
[0010]本發(fā)明還提供了一種微生物菌劑，該微生物菌劑通過包括如下步驟的制備方法制備得到:將本發(fā)明如上所述的地衣芽孢桿菌接種到液態(tài)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到種子液；(2)將所述種子液接種到固態(tài)培養(yǎng)基中并進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵后的物料。[0011]本發(fā)明還提供了如上所述的地衣芽孢桿菌或如上所述的微生物菌劑在礦山生態(tài)修復(fù)中的用途。
[0012]通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明能夠顯著的促進(jìn)綠化植物的根系在礦山邊坡中生長并達(dá)到更高的發(fā)達(dá)程度，從而進(jìn)一步增加了礦山邊坡的穩(wěn)定性。
[0013]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細(xì)說明。
[0014]生物材料保藏
[0015]本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)是本發(fā)明的發(fā)明人從天津靜?？h的土壤樣本中分離的純培養(yǎng)物，其保藏編號為CCTCC NO:M2013497，保藏日期為2013年10月24日，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址位于中國武漢武漢大學(xué)，分類命名為 Bacillus licheniformis。 【具體實施方式】
[0016]以下對本發(fā)明的【具體實施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0017]本發(fā)明提供了一種地衣芽孢桿菌，該地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的保藏編號為 CCTCC NO:M2013497o
[0018]本發(fā)明還提供了一種微生物菌劑，該微生物菌劑通過包括如下步驟的制備方法制備得到:將本發(fā)明如上所述的地衣芽孢桿菌接種到液態(tài)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到種子液；(2)將所述種子液接種到固態(tài)培養(yǎng)基中并進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵后的物料。
[0019]其中，步驟(1)中，種子液中的活菌濃度沒有特別的限制，可以為地衣芽孢桿菌培養(yǎng)過程中常用的濃度，例如可以為(2-20) X 109CFU/mL。其中，培養(yǎng)的條件沒有特別的限制，培養(yǎng)的條件使得種子液中的活菌濃度可以為(2-20) X 109CFU/mL,例如，培養(yǎng)的溫度可以為28-38°C，培養(yǎng)的時間可以為10-40小時。在培養(yǎng)的過程中，可以通過常規(guī)的方法，例如血球板計數(shù)法或OD值觀察法得到活菌的濃度。
[0020]其中，發(fā)酵的條件和發(fā)酵后的物料中的活菌濃度沒有特別的要求，可以為地衣芽孢桿菌發(fā)酵過程中常用的條件和濃度，作為本發(fā)明優(yōu)選的一種實施方式，步驟(2)中，發(fā)酵的條件使得發(fā)酵后的物料中的活菌濃度為(2-200) X 108CFU/mL，在該優(yōu)選實施方式中的活菌濃度下，獲得的發(fā)酵后的物料作為微生物菌劑使用，能夠更好地在邊坡土壤中定植并建立微環(huán)境。例如發(fā)酵的時間可以為20-200小時，溫度可以為28-36°C。
[0021]其中，所述液態(tài)培養(yǎng)基可以為常規(guī)的各種能夠培養(yǎng)地衣芽孢桿菌的液態(tài)培養(yǎng)基，例如包括但不限于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中的至少一種。
[0022]其中，所述固態(tài)培養(yǎng)基可以為常規(guī)的各種能夠發(fā)酵擴(kuò)大地衣芽孢桿菌數(shù)目的固態(tài)培養(yǎng)基，例如所述固態(tài)培養(yǎng)基可以含有秸桿、木屑、豆餅粉、面粉、淀粉、米糠和麩皮中的至少一種；且所述固態(tài)培養(yǎng)基還可以含有2-10g/kg的磷酸二氫鉀和l-10g/kg的硫酸亞鐵，以補(bǔ)充地衣芽孢桿菌快速生長時所需的無機(jī)鹽。
[0023]其中，作為本發(fā)明特別優(yōu)選的一種實施方式，所述固態(tài)培養(yǎng)基含有400_700g/kg的稻桿、100-300g/kg的豆餅粉、2-10g/kg的磷酸二氫鉀和l_10g/kg的硫酸亞鐵。其中，該固態(tài)培養(yǎng)基還可以含有余量的水和/或其它成分。在該優(yōu)選方式中，一方面能夠讓地衣芽孢桿菌在發(fā)酵過程中快速生長，另一方面獲得的發(fā)酵后的物料作為微生物菌劑使用，能夠更好地在邊坡土壤中定植并建立微環(huán)境。
[0024]其中，秸桿可以粉碎為能用于發(fā)酵的常規(guī)的大小，例如長度可以為5-10mm，寬度可以為3-8_，厚度可以為3-8_。秸桿可以為為各種來源的秸桿，例如包括玉米秸桿、高粱秸桿、水稻秸桿、小麥秸桿和大豆秸桿中的至少一種。
[0025]其中，發(fā)酵后的物料可以直接作為微生物菌劑使用，也可以通過包括干燥和/或造粒等步驟進(jìn)一步加工為更方便貯藏的劑型的微生物菌劑使用。
[0026]本發(fā)明還提供了如上所述的地衣芽孢桿菌或如上所述的微生物菌劑在礦山生態(tài)修復(fù)中的用途。
[0027]其中，在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式中，將如上所述的地衣芽孢桿菌或如上所述的微生物菌劑在礦山生態(tài)修復(fù)中用于促進(jìn)邊坡植被生長和構(gòu)建邊坡。
[0028]其中，在本發(fā)明特別優(yōu)選的一種實施方式中，在邊坡基礎(chǔ)上鋪設(shè)袋裝土壤，所述袋裝土壤包括柔性袋體和容納在該柔性袋體內(nèi)部的土壤，并且在所述袋裝土壤上種植植物；其中，在容納于所述柔性袋體內(nèi)部的土壤中摻入如上所述的地衣芽孢桿菌或如上所述的微生物菌劑；所述植物包括胡枝子(Lespedeza bicolor Turcz.)和/或紫穗槐(Amorphafruticosa Linn.)。 [0029]以下通過實施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明:
[0030]實施例1
[0031]本實施例用于說明本發(fā)明的地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)及微生物菌劑的制備。
[0032]將保藏編號為CCTCC NO:M2013497 的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)接種到LB培養(yǎng)基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在35°C和80轉(zhuǎn)/分振蕩下培養(yǎng)至活菌濃度為1010CFU/mL，得到種子菌液。
[0033]將IOOmL上述種子菌液均勻地淋灑到IOOkg發(fā)酵培養(yǎng)基中(發(fā)酵培養(yǎng)基含有600g/kg的稻桿(玉米稻桿，已粉碎為約IOmm長,5mm寬，5mm厚的大小)、300g/kg的豆餅粉、5g/kg的磷酸二氫鉀、5g/kg的硫酸亞鐵和余量的水)，翻拌均勻后在30°C下發(fā)酵，在發(fā)酵過程中進(jìn)行取樣并通過顯微鏡直接計數(shù)法進(jìn)行觀察，直至每千克固體培養(yǎng)基中的地衣芽孢桿菌的活菌數(shù)為1010CFU，所得到的發(fā)酵后的物料即為本實施例的微生物菌劑。
[0034]實施例2
[0035]本實施例用于說明本發(fā)明的地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)及微生物菌劑的制備。
[0036]將保藏編號為CCTCC NO:M2013497 的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)接種到LB培養(yǎng)基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在35°C和80轉(zhuǎn)/分振蕩下培養(yǎng)至活菌濃度為5X 109CFU/mL，得到種子菌液。
[0037]將IOOmL上述種子菌液均勻地淋灑到IOOkg發(fā)酵培養(yǎng)基中(發(fā)酵培養(yǎng)基含有500g/kg的稻桿(玉米稻桿，已粉碎為約IOmm長,5mm寬，5mm厚的大小)、200g/kg的豆餅粉、5g/kg的磷酸二氫鉀、5g/kg的硫酸亞鐵和余量的水)，翻拌均勻后在30°C下發(fā)酵，在發(fā)酵過程中進(jìn)行取樣并通過顯微鏡直接計數(shù)法進(jìn)行觀察，直至每千克固體培養(yǎng)基中的地衣芽孢桿菌的活菌數(shù)為IO9CFU,所得到的發(fā)酵后的物料即為本實施例的微生物菌劑。
[0038]實施例3
[0039]本實施例用于說明本發(fā)明的地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)及微生物菌劑的制備。
[0040]將保藏編號為CCTCC NO:M201:M97 的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)接種到LB培養(yǎng)基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在32°C和100轉(zhuǎn)/分振蕩下培養(yǎng)至活菌濃度為2X 109CFU/mL，得到種子菌液。
[0041]將IOOmL上述種子菌液均勻地淋灑到IOOkg發(fā)酵培養(yǎng)基中(發(fā)酵培養(yǎng)基含有450g/kg的稻桿(玉米稻桿，已粉碎為約IOmm長，5mm寬，5mm厚的大小)、150g/kg的豆餅粉、5g/kg的磷酸二氫鉀、5g/kg的硫酸亞鐵和余量的水)，翻拌均勻后在30°C下發(fā)酵，在發(fā)酵過程中進(jìn)行取樣并通過顯微鏡直接計數(shù)法進(jìn)行觀察，直至每千克固體培養(yǎng)基中的地衣芽孢桿菌的活菌數(shù)為5 X IO8CFU,所得到的發(fā)酵后的物料即為本實施例的微生物菌劑。
[0042]對比例I
[0043]將購自ATCC的商品號為ATCC? 14580?的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)接種到LB培養(yǎng)基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在35°C和80轉(zhuǎn)/分振蕩下培養(yǎng)至活菌濃度為1010CFU/mL，得到種子菌液。
[0044]將IOOmL上述種子菌液均勻地淋灑到IOOkg發(fā)酵培養(yǎng)基中(發(fā)酵培養(yǎng)基含有600g/kg的稻桿(玉米稻桿，已粉碎為約IOmm長,5mm寬，5mm厚的大小)、300g/kg的豆餅粉、5g/kg的磷酸二氫鉀、5g/kg的硫酸亞鐵和余量的水)，翻拌均勻后在30°C下發(fā)酵，在發(fā)酵過程中進(jìn)行取樣并通過顯微鏡直接計數(shù)法進(jìn)行觀察，直至每千克固體培養(yǎng)基中的地衣芽孢桿菌的活菌數(shù)為IOltlCFU,所得到的發(fā)酵后的物料即為本對比例的微生物菌劑。
[0045]測試實施例1
[0046]本測試實施例在室外盆栽實驗中測定本發(fā)明的微生物菌劑在促進(jìn)胡枝子(Lespedeza bicolor Turcz.)和紫穗槐(Amorpha fruticosa Linn.)的根系生長中的作用。
[0047]室外盆栽使用的基質(zhì)土壤購自北京花卉市場的花卉土，土壤有機(jī)質(zhì)含量10.24g/kg、全氮 0.561g/kg、全磷 1.14g/kg、全鉀 14.98g/kg、速效氮 39.19mg/kg、速效磷 16.26mg/kg、速效鉀160.07mg/kg、pH6.5。并且,為了模擬礦山邊坡的土壤環(huán)境，還在花丼土中摻入了與花卉土等重量的煤矸石粉(取自北京市房山區(qū)大安山鄉(xiāng)的廢棄煤礦)，盆栽試驗盆高50cm、上直徑30cm、下直徑23cm，每盆加土 8.2kg，分別加入實施例1_3和對比例I的微生物菌劑100g作為實驗處理,并以加入100g的發(fā)酵培養(yǎng)基(含有600g/kg的稻桿(玉米稻桿，已粉碎為約IOmm長,5mm寬，5mm厚的大小)、300g/kg的豆餅粉、5g/kg的磷酸二氫鉀、5g/kg的硫酸亞鐵和余量的水)作為空白對照。
[0048]在不同的盆中植入相同大小的胡枝子(Lespedeza bicolor Turcz.)和紫穗槐(Amorpha fruticosa Linn.)幼苗，分別用于在30天、60天和90天后，測定胡枝子(Lespedeza bicolor Turcz.)和紫穗槐(Amorpha fruticosa Linn.)的地下部分的生物量(即地下部分的鮮重)，并以實驗處理的地下部分的生物量除以空白對照的地下部分的生物量，計算增重比，結(jié)果如表1所示。
[0049]表1
[0050]
【權(quán)利要求】
1.一種地衣芽孢桿菌，其特征在于:該地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的保藏編號為 CCTCC NO:M2013497o
2.一種微生物菌劑，其特征在于:該微生物菌劑通過包括如下步驟的制備方法制備得到: (1)將權(quán)利要求1所述的地衣芽孢桿菌接種到液態(tài)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到種子液； (2)將所述種子液接種到固態(tài)培養(yǎng)基中并進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵后的物料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于:步驟(1)中，培養(yǎng)的條件使得種子液中的活菌濃度為(2-20) X 109CFU/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于:步驟(2)中 ，發(fā)酵的條件使得發(fā)酵后的物料中的活菌濃度為(2-200) X 108CFU/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任意一項所述的微生物菌劑,其特征在于:所述液態(tài)培養(yǎng)基包括牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中的至少一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任意一項所述的微生物菌劑，其特征在于:所述固態(tài)培養(yǎng)基含有秸桿、木屑、豆餅粉、面粉、淀粉、米糠和麩皮中的至少一種；且所述固態(tài)培養(yǎng)基還含有2-10g/kg的磷酸二氫鉀和l-10g/kg的硫酸亞鐵。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物菌劑，其特征在于:所述固態(tài)培養(yǎng)基含有400-700g/kg的稻桿、100-300g/kg的豆餅粉、2-10g/kg的磷酸二氫鉀和l_10g/kg的硫酸亞鐵。
8.權(quán)利要求1所述的地衣芽孢桿菌或權(quán)利要求2-7中任意一項所述的微生物菌劑在礦山生態(tài)修復(fù)中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于:將權(quán)利要求1所述的地衣芽孢桿菌或權(quán)利要求2-7中任意一項所述的微生物菌劑在礦山生態(tài)修復(fù)中用于促進(jìn)邊坡植被生長和構(gòu)建邊坡。
【文檔編號】E02D17/20GK103966125SQ201410171760
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月25日
【發(fā)明者】王夕剛 申請人:王夕剛