專(zhuān)利名稱(chēng)：一株犬源地衣芽孢桿菌Y₁₀及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株經(jīng)分離而獲得的耐酸、耐膽鹽、抑菌效果好且能較顯著改善犬腸道環(huán)境，促進(jìn)微生態(tài)平衡從而降低腹瀉率的地衣芽孢桿菌(BaciIluslicheniformi) Yltl及其在防治犬腹瀉病方面的應(yīng)用，屬于預(yù)防獸醫(yī)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自上世紀(jì)八十年代以來(lái)，微生態(tài)制劑作為生物獸藥和飼料添加劑已廣泛用于仔豬、犢牛、羔羊、家禽等動(dòng)物腸炎、腹瀉病的預(yù)防和治療上。目前專(zhuān)門(mén)用于寵物犬的國(guó)產(chǎn)微生態(tài)制劑還沒(méi)有問(wèn)世，臨床上常使用人用微生態(tài)制劑如整腸生、益菌生等來(lái)調(diào)節(jié)犬的腸道菌群平衡，但效果并不理想。國(guó)外已出現(xiàn)了犬用微生態(tài)產(chǎn)品，但由于目前微生態(tài)制劑作為食品添加劑的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)尚不完善，生產(chǎn)質(zhì)量控制薄弱，一些產(chǎn)品達(dá)不到包裝上所標(biāo)示的活菌數(shù) 量，有的產(chǎn)品根本就不含有活菌(任普軍.2006.新獸醫(yī)，6 :48-50)，從而導(dǎo)致產(chǎn)品達(dá)不到治病、防病的作用，寵物用微生態(tài)制劑整體質(zhì)量水平比較低，完全不能滿足寵物市場(chǎng)快速發(fā)展的需要。從2006年I月開(kāi)始，歐盟已全面禁止在動(dòng)物飼料中添加抗生素(劉興海.2007.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，5 :35-36)。隨著抗生素在我國(guó)的限用，甚至禁用，該病在我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)中將越來(lái)越嚴(yán)重。因此，開(kāi)發(fā)犬用微生態(tài)制劑，不僅對(duì)生態(tài)養(yǎng)犬和環(huán)境治理有重要意義，而且給生物獸藥業(yè)和飼料工業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益。目前許多國(guó)外學(xué)者對(duì)乳酸桿菌應(yīng)用于犬的研究較多，而對(duì)芽孢桿菌應(yīng)用于犬的研究不足(劉昆.2008.飼料工業(yè)，15 54-55)。益生菌(又叫微生態(tài)制劑，或微生物制劑，或微生物飼料添加劑)是最先被提出的抗生素替代品，它的作用主要在于扶植正常微生物菌群，調(diào)節(jié)生態(tài)平衡(李長(zhǎng)強(qiáng).2010.江西飼料，2 21-24)。迄今為止尚未見(jiàn)到有關(guān)地衣芽孢桿菌Yltl的篩選及其在防治犬腹瀉病中的應(yīng)用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)目前抗生素的濫用及禁用導(dǎo)致疾病很難治愈的情況以及犬感染細(xì)菌導(dǎo)致腹瀉病后難以治愈或無(wú)法治療等問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一株具有耐酸、耐膽鹽、抑菌效果好的地衣芽孢桿菌Yltl;同時(shí)也提供該地衣芽孢桿菌Yltl在獸藥或飼料中的應(yīng)用，可用以預(yù)防和治療犬腹瀉病并調(diào)整犬腸道微生態(tài)平衡，提高腸道微生物多樣性。本發(fā)明參考益生菌可用于臨床上預(yù)防和治療動(dòng)物疾病的思維，從健康犬糞樣中篩選出耐酸、耐膽鹽，抑菌效果好的地衣芽孢桿菌Yltl及菌劑，然后利用該菌劑在獸藥或犬日糧中的應(yīng)用，證明添加本發(fā)明菌劑Yltl后，可以預(yù)防和治療犬腹瀉?。煌瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)菌劑Yltl的應(yīng)用能顯著提高犬腸道微生物的多樣性，調(diào)整犬腸道微生態(tài)平衡，改善犬生長(zhǎng)性能。具體講，本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明獲得具有耐酸、耐膽鹽，抑菌效果好的地衣芽孢桿菌Yltl的方法是(見(jiàn)圖1)采集健康犬糞樣，用蒸餾水稀釋后，用不同篩選培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)和鑒定，得到一株對(duì)葡萄球菌、大腸桿菌CVCC2060、綠膿桿菌、大腸桿菌ATCC25922、沙門(mén)氏菌339有顯著抑制作用的菌株Yltl，然后進(jìn)行耐酸、耐膽鹽試驗(yàn)。通過(guò)PCR擴(kuò)增出菌株112的163 rDNA片段，經(jīng)測(cè)序獲得目的基因序列。用美國(guó)生物信息學(xué)中心(NCBI)的BLAST程序?qū)λ醪将@得的菌株H2 的 16S rDNA 序列進(jìn)行登錄，獲得登錄號(hào)為 FJ549021 (GenBank(Http://www. ncb1. nlm.nih. gov/blast/),與已收錄的序列進(jìn)行核苷酸同源性比較。經(jīng)過(guò)微生物學(xué)分類(lèi)鑒定,確定該分離的菌株Ylt!為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) Yltl,該菌株已于2011年4月20日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號(hào)為:CCTCC NO M2011134o本發(fā)明地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformi)Yltl(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”或“地衣芽孢桿菌Y1(l”)按照常規(guī)甘油冷凍方法保藏。本發(fā)明也提供本發(fā)明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”在獸藥或飼料中的應(yīng)用。采用農(nóng)業(yè)微生物常規(guī)操作方法將本發(fā)明制備成含“地衣芽孢桿菌CCTCC2011134”活菌含量不低于1.0X109cfu/g范圍的微生物制劑(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“菌劑”)，以不低于0. 1%比例添加在犬日糧中，使其在犬日糧中活菌含量不低于1. OX 106cfu/g，可以預(yù)防和治療犬腹瀉病，促進(jìn)其腸道內(nèi)正常生理性厭氧菌的生長(zhǎng)，調(diào)整腸道菌群失調(diào)，恢復(fù)腸道功能，提高犬腸道 微生物多樣性，增強(qiáng)機(jī)體免疫器官指數(shù)，改善犬的生長(zhǎng)性能。本發(fā)明“地衣芽孢桿菌CCTCC2011134”菌劑還可參照北京順達(dá)四海生物藥業(yè)有限公司公開(kāi)的發(fā)明專(zhuān)利(公開(kāi)號(hào)為CN102120972A，發(fā)明名稱(chēng)地衣芽孢桿菌菌粉及微生態(tài)制劑的制備方法)所介紹的方法生產(chǎn)，應(yīng)用后同樣能獲得相同效果。本發(fā)明具有以下效果(I)本發(fā)明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”具有耐酸、耐膽鹽，抑菌效果好，可用于治療由大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等引起的犬腹瀉病并提高犬腸道微生物多樣性。(2)本發(fā)明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”可直接在獸藥或飼料中應(yīng)用；也可制成微生態(tài)制劑，作為生物獸藥和犬食品添加劑使用，比如添加于犬日糧中使用，可有效預(yù)防和治療由大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等引起的腹瀉病，促進(jìn)其腸道內(nèi)正常生理性厭氧菌的生長(zhǎng)，調(diào)整腸道菌群失調(diào)，恢復(fù)腸道功能，提高犬腸道微生物多樣性及免疫器官指數(shù)，改善犬生長(zhǎng)性能。這會(huì)給生物獸藥業(yè)和飼料工業(yè)帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明適用于飼料廠和規(guī)?；B(yǎng)犬場(chǎng)。


圖1為本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2為本發(fā)明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”的抑菌試驗(yàn)結(jié)果圖，其中A，B，C，D，E分別為本發(fā)明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”對(duì)大腸桿菌CVCC2060、ATCC25922，金黃色葡萄球菌，綠膿桿菌和沙門(mén)氏菌抑菌效果。圖3為本發(fā)明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”總DNA的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖。圖4為本發(fā)明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134” 16S rRNAPCR產(chǎn)物的1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖。圖5為從Genbank里搜索出芽孢桿菌屬內(nèi)12個(gè)不同種的16S rRNA序列建立芽孢桿菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖。
圖6為本發(fā)明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”治療感染腹瀉病幼犬糞樣細(xì)菌總DNA的0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖。該圖中，Marker為入-1lldigest，樣品在23kb處都有條帶。圖7為本發(fā)明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”治療感染腹瀉病犬糞樣細(xì)菌16SrRNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果。該圖中，Marker為D2000，PCR擴(kuò)增得到200bp左右的16S rRNAV3區(qū)片段。圖8-圖9為本發(fā)明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”對(duì)各組幼犬處理0日糞樣菌群的DGGE圖譜、聚類(lèi)分析圖。圖10-圖11為本發(fā)明“地衣 芽孢桿菌CCTCC 2011134”對(duì)各組幼犬處理9日糞樣菌群的DGGE圖譜、聚類(lèi)分析圖。圖12-圖13為本發(fā)明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”對(duì)試驗(yàn)組3幼犬糞樣菌群的DGGE圖譜、聚類(lèi)分析圖。圖14-圖15為本發(fā)明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”對(duì)試驗(yàn)組4幼犬糞樣菌群的DGGE圖譜、聚類(lèi)分析圖。圖16為本發(fā)明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”對(duì)試驗(yàn)幼犬糞樣微生物群落多樣性的影響圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:本發(fā)明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134”的獲取與鑒定，見(jiàn)圖11、本發(fā)明“地衣芽孢桿菌CCTCC 2011134” (即地衣芽孢桿菌Yltl)的分離、獲取1.1菌株Yltl的分離采集位于中國(guó)四川省雅安市內(nèi)常見(jiàn)的、家養(yǎng)的健康寵物犬的新鮮糞樣，立即送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。取新鮮糞樣0. 5g，放入加有49. 5ml生理鹽水并帶有玻璃珠的三角瓶中，搖床37°C震蕩20min，然后60°C恒溫水浴20min。取0. 5ml稀釋糞液做十倍遞減稀釋到10_5。從10_3 10_5各稀釋度取100 U L涂布于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37°C恒溫培養(yǎng)12h。鏡檢培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落。挑取芽孢桿菌單菌落在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上畫(huà)線培養(yǎng)，每個(gè)單菌落重復(fù)平板畫(huà)線2 3次，直到得到純的菌株Yltl即本發(fā)明地衣芽孢桿菌Y1(l。將得到的菌株Yltl接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，保存?zhèn)溆谩?. 2耐酸試驗(yàn)將篩選到的菌株Yltl培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集菌體(4000r/min，10min,4°C ) ；0. 25%生理鹽水漂洗一次后離心；懸浮于0. OSM磷酸緩沖液_pH2. 0中，37°C培養(yǎng)I 3h，檢測(cè)培養(yǎng)期間活菌數(shù)的變化。試驗(yàn)結(jié)果顯示，pH2. 0的緩沖液中3小時(shí)后存活率達(dá)到80. 32% (見(jiàn)表I)。表明本發(fā)明菌株Yltl具有較強(qiáng)的耐酸性。表I菌株Yltl耐酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果 LogltlCFUAiL
1 OhIh2h3h 存活率(%)
Y10 8.99 7.68 7.43 7.22 80.321. 3耐膽鹽試驗(yàn)
將篩選到的菌株Yltl培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集菌體(4000r/min，10min,4°C ) ；0. 25%生理鹽水漂洗一次后離心；懸浮于與初培養(yǎng)基等體積的含1%膽鹽的生理鹽水中，37°C作用6h ;檢測(cè)活菌數(shù)的變化率。試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株Yltl在6小時(shí)后存活率達(dá)94. 11% (見(jiàn)表2)。這表明本發(fā)明菌株Yltl具有較強(qiáng)的膽鹽耐受性。表2菌株Yltl的膽鹽耐受結(jié)果 Log1(lCFU/mL
權(quán)利要求
1.一株地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)Yltl,其特征在于該菌株耐酸、耐膽鹽、抑菌效果好，且能較顯著改善犬腸道環(huán)境，促進(jìn)微生態(tài)平衡從而降低腹瀉率。該菌株已于2011年4月20日由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號(hào)為CCTCC NO M2011134。
2.權(quán)利要求1所述的菌株或含有該菌株的微生物制劑在防治犬腹瀉病方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株耐酸、耐膽鹽、抑菌效果好的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)Y10及其在防治犬腸炎、腹瀉病方面的應(yīng)用。該菌株通過(guò)分離、篩選和鑒定而獲得，保藏編號(hào)為CCTCC NOM2011134；該地衣芽孢桿菌Y10可制成微生態(tài)制劑，作為獸藥和犬食品添加劑使用，調(diào)整腸道菌群失調(diào)，提高犬腸道微生物多樣性及免疫器官指數(shù)，改善犬生長(zhǎng)性能，有效防治犬腹瀉病，為預(yù)防犬腸道細(xì)菌性疾病提供新的思路，同時(shí)也為犬源微生態(tài)制劑的發(fā)展提供可行的備用菌種。本發(fā)明適用于飼料廠和規(guī)?；B(yǎng)犬場(chǎng)。
文檔編號(hào)A61P1/12GK102994416SQ20121038762
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月15日
發(fā)明者倪學(xué)勤, 曾東, 李潔萍, 曾燕, 舒剛, 景波, 彭煥偉 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)